N-（三氘代甲氧羰基）-L-纈氨酸的合成*

豐巍偉，劉 飛，徐云根，朱雪焱，張寅生

1正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，南京 211122；2 中國(guó)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，南京 211198；3中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 201203

鹽酸達(dá)卡他韋（daclatasvir dihydrochloride，a），化學(xué)名為N，N’-[[1，1’-聯(lián)苯]-4，4’-二基雙[1H-咪唑-5，2-二基-（2S）-2，1-吡咯烷二基[（1S）-1-（1-甲基乙基）-2-氧代-2，1-乙烷二基]]]雙氨基甲酸二甲酯二鹽酸鹽，是百時(shí)美施貴寶公司研制開發(fā)的HCV NS5A抑制劑[1]，于2014年8月獲EMA批準(zhǔn)上市，是首個(gè)用于治療HCV感染的NS5A抑制劑，對(duì)HCV基因1-6型均有較好的治療效果[2，3]。

本公司自主研發(fā)的1類新藥氘代達(dá)卡他韋[4]（Deudaclatasvir，b）與達(dá)卡他韋的作用機(jī)制相同，結(jié)構(gòu)式見圖1，通過(guò)與HCV病毒NS5A蛋白結(jié)合發(fā)揮藥效作用，藥理毒理實(shí)驗(yàn)表明，兩者的藥效相當(dāng)，藥代行為及毒性反應(yīng)基本相似，氘代達(dá)卡他韋擁有較高的成藥性，該產(chǎn)品目前正在國(guó)內(nèi)進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)。

在氘代達(dá)卡他韋的合成過(guò)程中，最關(guān)鍵的是其氘代片段N-（三氘代甲氧羰基）-L-纈氨酸（1）的制備。先前開發(fā)的合成方法[4]（見圖2）利用三光氣和氘代甲醇，制備氘代氯甲酸甲酯，再與L-纈氨酸（2）反應(yīng)，生成目標(biāo)產(chǎn)物（1），總收率14%（以氘代甲醇計(jì)）。該路線對(duì)環(huán)境污染較大，存在明顯的缺陷：①三光氣雖然比光氣安全，但難免在使用過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生少量的光氣，特別在炎熱的夏天為甚；②大量使用了吡啶（Py）；③參考氯甲酸甲酯的毒性，氘代氯甲酸甲酯亦是劇毒品。上述三者均對(duì)環(huán)境污染較大，安全隱患大，不利于勞動(dòng)保護(hù)。

N，N’-羰基二咪唑（CDI）被廣泛應(yīng)用于酰胺、多肽、氨基甲酸酯等的合成[5]。利用該方法改進(jìn)了氘代片段（1）的合成，見圖3。用對(duì)溴溴芐保護(hù)N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸（3）的羧基，得到化合物（4），再用鹽酸脫去Boc保護(hù)基制備（5），CDI先與氘代甲醇反應(yīng)，生成活性中間體咪唑甲酸氘甲酯，再和（5）生成N-（三氘代甲氧羰基）-L-纈氨酸對(duì)溴芐酯（6），最后鈀碳加氫脫芐酯，得氘代片段（1），4步總收率58%（以氘代甲醇計(jì)，收率26%）。若以市售的L-纈氨酸甲酯（5’）代替L-纈氨酸對(duì)溴芐酯（5），2步總收率68%（以氘代甲醇計(jì)收率30%，是路線1的2倍），收率進(jìn)一步提高，成本較路線1降低約40%，同時(shí)大大降低了對(duì)環(huán)境的污染，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

1 儀器與試劑

Buchi B-545熔點(diǎn)儀；Bruker AV-500、Avance III HD-400M核磁共振儀；Waters Acquity H-Class QDa液質(zhì)聯(lián)用儀；AB SCIEX Triple TOF 4600質(zhì)譜儀；Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀；所用試劑均為分析純。

2 合成方法

2.1 N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸對(duì)溴芐酯（4）的合成

將N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸（3）（21.73g，0.1mol）溶于150 mL N-甲基吡咯烷酮（NMP）中，加入對(duì)溴溴芐（27.49 g，0.11 mol），Cs2CO3（19.55 g，0.06 mol），攪拌，25 ℃反應(yīng)3 h，薄層色譜（TLC）顯示反應(yīng)完全，向反 應(yīng)液中加入0.8 L冰水，乙酸 乙酯（AcOEt，200 mL×3）萃取，500 mL飽和NaCl水溶液洗滌有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓旋干溶劑，得到化合物4粗品44.40 g，可直接投入下步反應(yīng)。亦可經(jīng)硅膠柱層析分離提純石油醚（PE）與AcOEt為50∶1～20∶1,得到淡黃色漿（4）38.15 g，收率99%，純度97.8%[HPLC面積歸一化法，色譜柱：Waters Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.01%三氟乙酸-乙腈（80∶20）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL]。

1H-NMR（500MHz，CDCl3），δ:0.87（d，J=7.0Hz，3H，CH3），0.96（d，J=6.5Hz，3H，CH3），1.46（s，9H，（CH3）3C），2.15（m，1H，CH（CH3）2），4.27（dd，J=4.5，9.0 Hz，1H，NHCH），5.01（d，J=8.5 Hz，1H，NH），5.09（d，J=12.5 Hz，1H，p-Br-Ar-CH2O），5.17（d，J=12.5 Hz，1H，p-Br-Ar-CH2O），7.25（d，J=8.5 Hz，2H，p-Br-Ar），7.51（d，J=8.5 Hz，2H，p-Br-Ar）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3），δ：17.5，19.0，28.3，31.2，58.6，66.0，79.9，122.5，130.0，131.8，134.5，155.7，172.2。

2.2 L-纈氨酸對(duì)溴芐酯（5）的合成

將N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸對(duì)溴芐酯（4）（37.63 g，0.097 mol）溶于異丙醇（200 mL）中，室溫?cái)嚢瑁尤霛恹}酸（24 mL，0.292 mol），加熱到60℃，反應(yīng)7 h，TLC顯示反應(yīng)完全，減壓旋干異丙醇。加入400 mL飽和碳酸鈉水溶液，AcOEt（200 mL×3）萃取，300 mL飽和NaCl水溶液洗滌有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓旋干溶劑，得到化合物5粗品27.48 g，可直接投入下步反應(yīng)。亦可經(jīng)硅膠柱層析分離提純（PE∶AcOEt 15∶1～2∶1）,得到淡黃色油狀液體（5）26.96 g，收率97%，純度98.6%（液相方法同上）。

1H-NMR（500 MHz，CDCl3），δ：0.89（d，J=7.0 Hz，3H，CH3），0.98（d，J=7.0 Hz，3H，CH3），2.05（m，1H，CH（CH3）2），3.34（d，J=4.5 Hz，1H，NH2CH），5.10（d，J=12.5 Hz，1H，p-Br-Ar-CH2O），5.14（d，J=12.5 Hz，1H，p-Br-Ar-CH2O），7.26（d，J=8.0 Hz，2H，p-Br-Ar），7.51（d，J=8.0 Hz，2H，p-Br-Ar）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3），δ：17.1，19.3，32.2，60.0，65.7，122.4，130.1，131.8，134.8，175.4。

TOF-MS：m/z=286.0[M+H]+。

2.3 N-（三氘代甲氧羰基）-L-纈氨酸對(duì)溴芐酯（6）的合成

將CDI（18.64 g，0.12mol）、CD3OD（4.15g，0.12mol）、KOH（0.16 g，2.85 mmol）加入到甲苯（150 mL）中，加熱至70 ℃，反應(yīng)5 h后，加入5（14.31 g，0.05 mol），繼續(xù)70 ℃反應(yīng)17 h，冷卻到室溫，過(guò)濾，用甲苯洗滌濾餅，將濾液減壓濃縮，經(jīng)硅膠柱層析分離提純（PE∶AcOEt 20∶1～10∶1），得到白色固體（6）13.02 g，收率75%，m.p.：49℃～51 ℃。

1H-NMR（500 MHz，CDCl3），δ：0.87（d，J=7.0 Hz，3H，CH3），0.97（d，J=7.0 Hz，3H，CH3），2.18（m，1H，CH（CH3）2），4.34（dd，J=5.0，9.0 Hz，1H，NHCH），5.14（m，3H，p-Br-Ar-CH2O，NH），7.25（d，J=8.5 Hz，2H，p-Br-Ar），7.51（d，J=8.0 Hz，2H，p-Br-Ar）。13CNMR（125 MHz，CDCl3），δ：17.4，19.0，31.2，59.0，66.2，122.6，130.1，131.8，134.4，156.9，172.0。

TOF-MS：m/z=347.1[M+H]+。

2.4 N-（三氘代甲氧羰基）-L-纈氨酸甲酯（6’）的合成

將CDI（18.65g，0.12mol）、CD3OD（4.15g，0.12mol）和KOH（0.22g,4 mmol）加入到甲苯（130 mL）中，70 ℃反應(yīng)3 h，加入L-纈氨酸甲酯（5’）（6.56 g，0.05 mol），70 ℃繼續(xù)反應(yīng)20 h，冷卻到室溫，過(guò)濾，用甲苯洗滌濾餅，濾液濃縮，經(jīng)硅膠柱層析分離提純（PE∶AcOEt 20∶1～10∶1），得油狀液體（6’）7.69 g，收率80%，純度98.2%[HPLC面積歸一化法，色譜柱：Waters Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.01%三氟乙酸-乙腈（75∶25）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm；進(jìn)樣量：25 μL]。

1H-NMR（500 MHz，CDCl3），δ：0.91（d，J=7.0 Hz，3H,CH3），0.97（d，J=7.0 Hz,3H，CH3），2.16（m，1H，CH（CH3）2），3.75（s，3H，COOCH3），4.29（dd，J=5.0，9.0 Hz，1H，NHCH），5.22（d，J=6.5Hz，NH）。13C-NMR（125MHz，CDCl3），δ：17.5，18.9，31.3，52.1，59.0，156.9，172.7。

TOF-MS：m/z=193.1[M+H]+。

2.5 N-（三氘代甲氧羰基）-L-纈氨酸（1）的合成

方法一：將N-（三氘代甲氧羰基）-L-纈氨酸對(duì)溴芐酯（6）（10 g，0.029 mol）溶于THF（100 mL）和水（10 mL）的混合溶液中，加入濕鈀碳（3 g，含水60%，鈀10%），充氫氣，常壓下30℃反應(yīng)2 h。過(guò)濾，除去鈀碳，濾液加飽和NaCl水溶液（300 mL），AcOEt（150 mL×3）萃取，飽和NaCl水溶液200 mL洗滌有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓旋干溶劑，得到化合物1粗品5.5 g。用甲基叔丁基醚（30 mL）重結(jié)晶，得到白色結(jié)晶粉末（1）4.1 g，收率80%。

方法二：將NaOH（2.91 g，0.073 mol）溶于50 mL水中，加入乙醇（150 mL）和6’（7 g，0.036 mol），室溫反應(yīng)3 h。用5%稀鹽酸調(diào)pH至4～5，加水150 mL，AcOEt（100 mL×3）萃取，100 mL飽和NaCl水溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓旋干溶劑，得到化合物1粗品6.6 g。用甲基叔丁基醚（35 mL）重結(jié)晶，得到白色結(jié)晶粉末（1）5.5 g，收率85%。

1H-NMR（400MHz，CDCl3），δ：0.94（d，J=6.8Hz，3H，CH3），1.01（d，J=6.8 Hz，3H，CH3），2.23（m，1H，CH（CH3）2），4.33（dd，J=4.6，9.0 Hz，1H，NHCH），5.25（d，J=9.2Hz，NH），10.74（br，1H，COOH）.13C-NMR（100MHz，CDCl3），δ:17.5，19.2，31.2，59.0，157.3，177.2。

TOF-HRMS：m/z=179.1106[M+H]+。

m.p.：112～113℃。純度99.7%[HPLC面積歸一化法，色譜柱：Chiral PAK?IA（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.05%磷酸-乙腈（76∶24）；柱溫：30 ℃；流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：193 nm；進(jìn)樣量：25μL]。R-異構(gòu)體（N-（三氘代甲氧羰基）-D-纈氨酸）：未檢出[HPLC面積歸一化法，色譜柱：Chiral PAK?AY-H（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：異丙醇-正己烷-三氟乙酸（25∶75∶0.02）；柱溫：35℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：202 nm；進(jìn)樣體積：20 μL]。

3 討論

對(duì)L-纈氨酸的羧基分別進(jìn)行了對(duì)溴芐酯（5）和甲酯（5’）保護(hù)，再以CDI為活化試劑，2步合成了N-（三氘代甲氧羰基）-L-纈氨酸（1），與之前開發(fā)的三光氣路線相比，收率提高了2倍，成本降低了約40%，也大大降低了對(duì)環(huán)境的污染。對(duì)溴溴芐是白色針狀結(jié)晶，可室溫儲(chǔ)存，廉價(jià)易得，與L-纈氨酸生成對(duì)溴芐酯，具有熒光，便于液相紫外檢測(cè)。以市售的L-纈氨酸甲酯（5’）代替L-纈氨酸對(duì)溴芐酯（5），最后一步反應(yīng)甲酯保護(hù)基更易于水解脫除，反應(yīng)收率及經(jīng)濟(jì)性進(jìn)一步提高，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。