改良六胺銀染色法在真菌染色中的應(yīng)用

邢 杰，吳佳君，葉 敏，秦 鋼，趙蘭香，余科科，張 杰，韓昱晨

近年來，隨著廣譜抗生素的濫用、免疫抑制劑和抗腫瘤藥物的廣泛使用，加之外科介入性治療的不斷發(fā)展與成熟，使得系統(tǒng)性真菌感染在原有的基礎(chǔ)上日益增多。尤以肺部真菌感染位居首位，超半數(shù)的真菌感染會侵犯支氣管、肺部，然而其癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)均缺乏特異性，因此在病理上準(zhǔn)確診斷出真菌感染顯得極其重要[1-4]。隨著診斷試劑盒不斷的更新，雖然染色方法越來越簡便，效果也越來越好，但同時也導(dǎo)致越來越多的技術(shù)員并不能很好的理解六胺銀特殊染色方法的原理和過程。上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院病理科至今仍然使用手工配制試劑進(jìn)行染色，并且不斷改良配方，取得了很好的效果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料 隨機選取2016年上海市胸科醫(yī)院病理科存檔的六胺銀陽性病例20例，為保證實驗結(jié)果評價的一致性，均選用手術(shù)切除標(biāo)本。每例標(biāo)本連續(xù)切片3張，分別用于原六胺銀試劑染色、改良六胺銀試劑染色、六胺銀試劑盒染色。

1.2 試劑配制 六胺銀染色試劑盒購自Baso公司。六胺銀染色試劑的配制[5]：(1)高碘酸溶液(原方法使用0.5%高碘酸溶液，改良法使用1%高碘酸溶液)；(2)六胺銀儲備液的配制，將3%六次甲基四胺水溶液100 mL加入到5 mL的5%硝酸銀溶液中即形成白色沉淀，搖動可使沉淀立即溶解，澄清后放置于4 ℃冰箱中保存；(3)六胺銀工作液的配制，將3 mL 5%的四硼酸鈉加入到25 mL的蒸餾水中混合均勻，然后加入15 mL的六胺銀儲備液，攪拌混合均勻后即可使用；(4)1%氯化金水溶液；(5)2%硫代硫酸鈉水溶液；(6)1%中性紅染液(原方法使用1%中性紅復(fù)染，改良法使用伊紅復(fù)染)。

1.3 染色步驟 將三種六胺銀染色方法進(jìn)行比較(表1)。

1.4 結(jié)果分析 閱片方法：三種方法染色的切片分別由病理科兩位主治醫(yī)師和一位副高級醫(yī)師進(jìn)行判讀和評分，并且所有切片隱藏病歷號等常規(guī)使用的編號，因此參加判讀的三位醫(yī)生事先對切片的結(jié)果并不知曉。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，使用χ2檢驗對三位醫(yī)師的判讀結(jié)果和評分進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

改良六胺銀試劑所染色的切片(圖1)染色效果較好，與六胺銀試劑盒染色結(jié)果(圖2)差異無顯著性(P=0.766)，原六胺銀試劑所染色的切片(圖3)，雖然能夠區(qū)別陽性和陰性，但染色效果與六胺銀試劑盒染色效果相比差異有顯著性(P=0.005)，并且與改良六胺銀染色效果相比差異有顯著性(P=0.028，表2)。

①②③圖1 改良六胺銀試劑染色的效果 圖2 六胺銀試劑盒染色的效果 圖3 原六胺銀試劑染色的效果

3 討論

真菌內(nèi)的多糖化合物能夠被酸氧化而暴露醛基，醛基能夠?qū)⒘枫y還原為黑色的金屬銀，從而在鏡下觀察到真菌。傳統(tǒng)的六胺銀染色方法中使用鉻酸溶液作為氧化劑，由于鉻酸氧化性較弱，后逐漸被高碘酸取代[6]。原六胺銀試劑染色法使用0.5%高碘酸將多糖化合物氧化而暴露醛基，而改良六胺銀試劑染色法使用1%高碘酸，且氧化時間也從原來的30 min增加到60 min，這種改良能夠更好的將真菌的多糖化合物酸化從而暴露醛基。溫度是六胺銀染色的重要因素，溫度必須不低于60 ℃，亦不能較高，時間不能過長，否則六胺銀易氧化變渾濁出現(xiàn)黑色的氧化膜[7]，因此改良六胺銀試劑染色法將溫度從原來的58～60 ℃提高到65～70 ℃，時間仍然控制在60 min。最后使用伊紅替代中性紅復(fù)染，使得被染色成黑色的真菌在伊紅的背景下更加清晰。

表1 三種六胺銀染色方法的差異比較

表2 三種染色方法結(jié)果對比

病理技術(shù)的主要工作是協(xié)助病理醫(yī)師更好的診斷，病理技術(shù)員除了熟練的掌握染色方法外，更需要熟知染色方法中的原理和過程，才能更好的掌握和熟練運用染色方法。手工配制試劑即使是在各種試劑盒不斷更新的今天，依然有助于我們熟知每一種染色方法的原理和過程，仍具有重要的意義。