基于基因拷貝數(shù)的缺失型α地中海貧血檢測(cè)體系研究

呂姍 王太重 覃茜 李佳 陳發(fā)欽

1右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣西百色533000）；2右江民族醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院（廣西百色533000）；3百色市婦幼保健院遺傳實(shí)驗(yàn)室（廣西百色533000）；4右江民族醫(yī)學(xué)院（廣西百色533000）

地中海貧血（簡(jiǎn)稱地貧）已成為世界上影響人群最大的單基因遺傳病［1］。在地中海地區(qū)、中東及東南亞多見(jiàn)，而在我國(guó)，主要分布在廣東和廣西地區(qū)［2］。最新的調(diào)查顯示，廣西地貧的基因攜帶率為21%（α地貧15.2%，β地貧5.8%）［3］。臨床上α地貧的嚴(yán)重程度與α基因缺陷的數(shù)量有關(guān)［4］。重型地貧目前尚無(wú)有效治療方法，產(chǎn)前篩查和地貧基因檢測(cè)是優(yōu)生優(yōu)育的有效措施［5?6］。雖然自2010年開(kāi)始，廣西壯族自治區(qū)人民政府啟動(dòng)實(shí)施了《廣西壯族自治地中海貧血防治計(jì)劃》，大規(guī)模推廣地貧的產(chǎn)前診斷，廣西中、重型地貧患兒的出生率開(kāi)始明顯下降，但據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，當(dāng)前中、重型地貧患者至少有90 000 多例，合計(jì)發(fā)病率仍高達(dá)0.2%。曾慶青［3］研究發(fā)現(xiàn)，在調(diào)查的300 多例重型地貧患兒中，多于30%是2010年后出生的，說(shuō)明當(dāng)前實(shí)行的地貧篩查方案存在不足，不利于優(yōu)生優(yōu)育?？缭綌嗔腰c(diǎn)PCR（Gap?PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time PCR）技術(shù)是缺失型α地貧常用的篩查技術(shù)，但Gap?PCR 無(wú)法檢測(cè)未知的基因型。因此，研究設(shè)計(jì)一個(gè)高通量高靈敏度的、能檢測(cè)非常見(jiàn)基因型的方法，有利于廣西開(kāi)展大規(guī)模缺失型α地貧基因突變的分子流行病學(xué)篩查，以便及早發(fā)現(xiàn)攜帶者，及早采取防控措施，降低廣西人群地貧的基因攜帶率和患病率有重要意義。自1991年開(kāi)始，研究者連續(xù)報(bào)道，在廣西境內(nèi)和廣西的近鄰廣東，檢測(cè)出“罕見(jiàn)的”缺失α地貧基因突變的基因型［7?11］。本研究建立基于α珠蛋白基因拷貝數(shù)變化的缺失型α地中海貧血基因突變的高通量檢測(cè)體系——三重TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過(guò)檢測(cè)α1、α2、ζ 的基因拷貝數(shù)的變化，可以發(fā)現(xiàn)上述基因的缺失，實(shí)現(xiàn)非常見(jiàn)缺失型α地貧基因型和基因頻率的探索，可以有效地在產(chǎn)前進(jìn)行地貧基因缺陷的診斷，促進(jìn)優(yōu)生優(yōu)育的開(kāi)展。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集收集2018年8月至2019年7月，在百色市婦幼保健院和右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行地貧篩查的外周血標(biāo)本共169 例，其中69 例為已知α地貧基因型標(biāo)本，100 例為臨床待測(cè)標(biāo)本。所選標(biāo)本年齡≥18 歲，EDTA 抗凝，4 ℃保存不超過(guò)7 d。樣本收集時(shí)均得到受檢者的知情同意，可用于后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 主要儀器與試劑ABI7500 熒光定量PCR 儀（新加坡Thermo Flisher 公司）；TAKARA HS Taq 酶，10 × PCR Buffer 購(gòu)自大連寶生物公司；25 mmol/L氯化鎂購(gòu)自珠海寶銳生物有限公司；dNTPs 購(gòu)自深圳菲鵬生物技術(shù)有限公司；無(wú)核酶水購(gòu)自Life公司；組織DNA 提取試劑盒購(gòu)自深圳優(yōu)圣康生物科技有限公司；缺失型α地中海貧血基因Gap?PCR診斷試劑盒購(gòu)自深圳益生堂公司。

1.3 基因組DNA 提取基因組DNA 提取與純化使用深圳優(yōu)圣康生物科技有限公司生產(chǎn)的組織DNA 提取試劑盒，參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 引物及探針設(shè)計(jì)引物及探針的設(shè)計(jì)參照Z(yǔ)HOU 等［12］的方法，NCBI 下載相關(guān)序列后，使用ABI 的Primer Express 軟件輔助設(shè)計(jì)。引物探針的核酸序列見(jiàn)表1。HBA、CRE、HBZ 探針的5'端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM、JOE、CY5；HBA、CRE 的3'端均標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)BHQ1，HBZ 的3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)BHQ3。符合多重Taq?Man 熒光定量PCR 體系要求［13］。引物和探針均由深圳優(yōu)圣康生物科技有限公司合成。

表1 設(shè)計(jì)的引物探針核酸序列Tab.1 The designed primers probe nucleic acid sequence

1.5 三重TaqMan 熒光PCR 體系優(yōu)化參考LIVAK 等［14］和ZHOU 等［12］報(bào)道的方法，建立三重TaqMan 熒光PCR 體系并對(duì)體系中的緩沖液、引物、探針、鎂離子、dNTPs 等成分的濃度進(jìn)行優(yōu)化。此體系含主反應(yīng)液16.5 μL、引物探針Mix 3 μL、Takara DNA 聚合酶0.5 μL、DNA 模板5 μL，反應(yīng)體系總體積25 μL，引物終濃度400 nmol/L，探針終濃度200 nmol/L。反應(yīng)程序：95 ℃，5 min；45×（95 ℃，10 s；60 ℃，45 s）。

1.6 數(shù)據(jù)分析及基因缺失判斷見(jiàn)圖1。α珠蛋白基因簇位于16 號(hào)染色體的短臂（16p13.3），基因大小約為26 kb［15］。每條染色體包含3 個(gè)有功能的基因：1 個(gè)ζ（或稱HBZ）、1 個(gè)α2（或稱HBA2）和1 個(gè)α1（或稱HBA1）。每對(duì)染色體共有2 個(gè)ζ基因，4 個(gè)α基因。因此，正常人有2 個(gè)ζ基因，4 個(gè)α基因。而人類(lèi)基因組中的某些看家基因（house keeping genes，HKGs），如ρ?actin、GAPDH、CREBPP，無(wú)論在什么情況下都是2 個(gè)拷貝。根據(jù)缺失型α地貧分子機(jī)制中α 珠蛋白基因和看家基因的拷貝數(shù)比例差異，以及2?△△ct相對(duì)定量分析方法的原理［12］，各缺失的基因型與拷貝數(shù)有如下數(shù)值規(guī)律：正常個(gè)體HBZ、HKGs 基因都是2 個(gè)拷貝，HBA 為4個(gè)拷貝。定量檢測(cè)時(shí)，△ct=ct目的基因-ct參比基因，△△ct=△ct檢測(cè)標(biāo)本-△ct正常對(duì)照，目的基因2?△△ct值即為目的基因與參比基因的比例，計(jì)算受檢標(biāo)本的2?△△ct值，根據(jù)2?△△ct值直接分析基因的相對(duì)拷貝數(shù)，判斷基因的缺失，實(shí)現(xiàn)缺失型α地貧的快速篩查。

圖1 HBA1、HBA2、HBZ 在各種已知缺失型α 珠蛋白基因突變時(shí)的缺失表現(xiàn)Fig.1 The deletions of HBA1，HBA2 and HBZ in various known deletions of alpha globin gene mutations

1.7 2?△△ct值的確立對(duì)69 例已知基因型標(biāo)本的相對(duì)拷貝數(shù)定量檢測(cè)，根據(jù)不同HBA 基因拷貝數(shù)分組，確定不同拷貝數(shù)的2?△△ct取值范圍，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同組間差異的比較用方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。判定方法見(jiàn)表2。HBA 基因拷貝數(shù)的測(cè)定：判定值2?△△ct＝1，表示樣本HBZ 拷貝數(shù)正常，偏差小于0.1 有較好的分辨率，即陽(yáng)性值為0 ～0.89（2 個(gè)平行結(jié)果均值），陰性值為0.9 ～1.1（2 個(gè)平行結(jié)果均值）。判定值介于0.85 ～0.9、0.6 ～0.65 及0.35 ～0.4 之間即為灰度區(qū)，需重新檢測(cè)或用Gap?PCR + MLPA 檢測(cè)驗(yàn)證。HBZ 基因拷貝數(shù)的測(cè)定：判定值2?△△ct＝1，表示樣本HBZ 拷貝數(shù)正常，偏差小于0.2 有較好的分辨率（判定原理如HBA 拷貝數(shù)的判定）；判定值均值< 0.5，表示拷貝數(shù)低于正常。

表2 69 例樣本中不同HBA 基因拷貝數(shù)及其判定值2-△△ctTab.2 The copy numbers of different HBA genes and their decision value 2-△△ct in 69 samples ±s

表2 69 例樣本中不同HBA 基因拷貝數(shù)及其判定值2-△△ctTab.2 The copy numbers of different HBA genes and their decision value 2-△△ct in 69 samples ±s

HBA 基因拷貝數(shù)4 3 2 1例數(shù)27 15 19 8 2-△△ct均值1±0.1 0.75±0.1 0.5±0.1 0.25±0.1 2-△△ct 0.9 ～1.1 0.65 ～0.85 0.4 ～0.6 0.15 ～0.35

1.8 診斷性能評(píng)價(jià)用本實(shí)驗(yàn)研究建立的方法與地貧臨床常規(guī)篩查方法進(jìn)行對(duì)比，用Gap?PCR +MLPA 技術(shù)進(jìn)行確認(rèn)。將100 例臨床樣本按頻數(shù)資料數(shù)據(jù)整理為四格表，計(jì)算敏感度和特異度。根據(jù)表3 的數(shù)據(jù)，敏感度計(jì)算方法為本方法檢測(cè)及Gap?PCR + MLPA 試驗(yàn)檢測(cè)均陽(yáng)性的個(gè)數(shù)/Gap?PCR+MLPA 檢測(cè)的陽(yáng)性數(shù)；特異度計(jì)算方法為本方法檢測(cè)及Gap?PCR + MLPA 試驗(yàn)檢測(cè)均陰性的個(gè)數(shù)/Gap?PCR+MLPA 檢測(cè)的陰性數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 臨床地貧樣本的不同基因拷貝數(shù)及基因型頻率對(duì)100 例臨床樣本，分別用本實(shí)驗(yàn)研究建立的方法和地貧臨床常規(guī)篩查方法進(jìn)行檢測(cè)，Gap?PCR + MLPA 技術(shù)驗(yàn)證。其中，檢測(cè)出兩個(gè)2 基因拷貝的樣本，用普通臨床試劑盒檢測(cè)結(jié)果為正常4拷貝，通過(guò)Gap?PCR + MLPA 驗(yàn)證后，證明這兩個(gè)樣本是異常泰國(guó)型樣本，α基因拷貝為2。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 100 例臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Test results of 100 clinical specimens

2.2 不同統(tǒng)計(jì)結(jié)果對(duì)比結(jié)果顯示，本研究建立的方法敏感度和特異度均為100%；臨床常規(guī)檢測(cè)方法的特異度為100%，敏感度為96%。本研究建立的方法敏感度高于臨床常規(guī)檢測(cè)方法，檢測(cè)準(zhǔn)確，并能發(fā)現(xiàn)臨床常規(guī)檢測(cè)不能發(fā)現(xiàn)的非常見(jiàn)地貧基因型，如泰國(guó)基因型。

3 討論

地貧是一種由于珠蛋白肽鏈合成速率降低導(dǎo)致珠蛋白肽鏈合成不平衡的血紅蛋白?。?6?18］，臨床表現(xiàn)為溶血性貧血癥狀。孕婦經(jīng)過(guò)遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷后，可為預(yù)防重癥地貧患兒提供重要理論依據(jù)［19］，產(chǎn)前地貧篩查和地貧基因檢測(cè)是廣東和廣西地區(qū)當(dāng)前優(yōu)生優(yōu)育的重要措施［20］。

本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)方法不同于目前臨床所用的檢測(cè)方法，目前臨床對(duì)于缺失型α地貧的檢測(cè)所用的試劑盒只能常規(guī)檢測(cè)幾種常見(jiàn)類(lèi)型的α地貧，如-SEA、?α4.2和?α3.7［21］，不能檢出靜止型α地貧，也不能檢出非常見(jiàn)的α地貧，且操作繁瑣。本研究建立起了基于α珠蛋白基因拷貝數(shù)變化的高通量高靈敏篩查方法，采用相對(duì)定量技術(shù)及2?△△ct原理，相對(duì)定量α地貧基因拷貝數(shù)，從而檢測(cè)α基因缺失或基因疊加，操作簡(jiǎn)單可行。同時(shí)，由于HBA2 和HBA1 具有高度的同源性，作為一個(gè)初篩試驗(yàn)，測(cè)定HBA2 和HBA1 是不必要的。因此，本研究?jī)H測(cè)定HBA2 和HBA1 的共同特征基因片段HBA。HBZ 基因雖然在成人是關(guān)閉的，但如果患兒的2 個(gè)HBZ 基因都缺失，將在胚胎期死亡，形成流產(chǎn)，從而增加社會(huì)醫(yī)療成本。以前的篩查方法，都僅檢測(cè)HBA2 和HBA1，而忽略HBZ，因而沒(méi)有關(guān)于單純HBZ 缺失的報(bào)道。本研究設(shè)計(jì)的新的三重TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)體系加入了對(duì)HBZ 基因的檢測(cè)，或許會(huì)檢出由HBZ 基因缺失所致的非常見(jiàn)缺失型α地貧。

DNA 的提取是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟，經(jīng)比較快速提取法（不分離細(xì)胞）、紅細(xì)胞裂解液分離白細(xì)胞、細(xì)胞裂解液分離白細(xì)胞核、細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞四種方法，若不分離白細(xì)胞，直接提取DNA，結(jié)果對(duì)HBA 及HBZ 的擴(kuò)增影響非常顯著，不符合本實(shí)驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究最終選擇將所取的臨床外周血標(biāo)本先用白細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞作為前處理，以確保得到最高濃度的DNA。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DNA 提取過(guò)程中，95 ℃處理1 h 的步驟不可或缺，對(duì)結(jié)果有較大影響。

本研究基于α珠蛋白基因拷貝數(shù)變化建立的α地貧篩查方法，能夠檢測(cè)常見(jiàn)的和非常見(jiàn)的缺失型α地貧基因突變，其檢出效率和準(zhǔn)確性較高，敏感度和特異度均為100%，臨床常規(guī)檢測(cè)方法的敏感度只有96%。經(jīng)驗(yàn)證，本研究建立的檢測(cè)體系能夠檢測(cè)臨床常規(guī)檢驗(yàn)方法未檢出的非常見(jiàn)型α地貧基因型泰國(guó)型（??THAI）。

另外中國(guó)南方地區(qū)有一定比例的HKαα等位基因，血液學(xué)表現(xiàn)較輕，臨床診斷困難［22］，某些情況下可能導(dǎo)致HKαα等位基因被誤診為?α3.7/αα。目前仍待進(jìn)一步探索，力求為HKαα基因型與?α3.7/αα的鑒別診斷提供更多基因診斷咨詢，同時(shí)探索出更多非常見(jiàn)缺失型α地貧基因型檢測(cè)手段。