沉默IL-17基因?qū)β闶笕松掀ば月殉舶┮浦擦錾L的抑制作用*

吳美琴，徐元萍，王 勇，宋曉婕，李玉霞，劉智慧，王燕萍，廖紅玉

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院(武漢市婦幼保健院)婦科，武漢 4300152武漢市第三醫(yī)院(武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院)婦產(chǎn)科，武漢 4300743武漢大學(xué)動物實驗中心，武漢 4300724湖北省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北省中醫(yī)藥研究院，武漢 430074

卵巢惡性腫瘤是女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。卵巢癌在婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中的發(fā)病率為第3位，卻是死亡率最高的婦科腫瘤，嚴重威脅著婦女的健康與生命[2-3]。上皮性卵巢癌是最常見的卵巢惡性腫瘤，由于缺乏有效的篩查手段以及發(fā)病初期癥狀、體征較為隱蔽，大多數(shù)患者在確診時已屬晚期。如何改善卵巢癌患者的預(yù)后、延長其生存期是臨床醫(yī)生面臨的困難之一，因此，尋找新的治療靶點是我們亟須解決的問題。本研究以人上皮性卵巢癌細胞株SKOV3細胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，敲降IL-17后，觀察其對腫瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1 裸鼠成瘤及分組

選取對數(shù)生長期的人上皮性卵巢癌細胞株SKOV3細胞(來自中科院細胞庫)，用0.1%的胰酶進行消化至鏡下細胞呈橢圓形至球形時，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液終止消化，吸管輕輕吹打至細胞完全懸浮后收集至離心管，以1000 r/min離心5 min，棄上清，加入RPMI 1640培養(yǎng)液，稀釋至2.5×107個/mL，吹打混勻配置成單細胞懸液。取單細胞混懸液，于無菌環(huán)境中在裸鼠背側(cè)近右前肢處進行皮下接種，每只裸鼠接種0.2 mL(約5×106個/只)，每日觀察瘤體生長情況，于接種后5 d，測量移植瘤直徑，選取直徑在3～5 mm的入組，隨機將其分成空白組和IL-17-siRNA組，每組6只。采用瘤體皮下注射300 μL慢病毒(購于上海吉瑪基因公司)的方式干預(yù)IL-17表達，濃度滴度為1×109TU/mL。每隔2天測量腫瘤體積，計算公式為：V=0.5236×L(長度)×W2(寬度)。3周后頸椎脫臼法處死裸鼠，分離腫瘤組織，測量腫瘤的體積。取每組均數(shù)制作腫瘤生長曲線。實驗?zāi)?，統(tǒng)一以10%水合氯醛3 mL/kg麻醉小鼠，剝離皮下腫瘤結(jié)節(jié)稱瘤重。

1.2 ELISA法測量血清炎癥因子的含量

取血清，以ELISA試劑盒檢測其炎癥因子的含量。根據(jù)試劑盒(購于南京建成生物科技有限公司)的說明書稀釋標準品。繪制標準曲線。在酶標包被板上依次加入50 μL的梯度濃度標準品。設(shè)置空白孔和樣品孔，其中空白孔不加樣品和抗體。在待測樣品孔中加入血清樣品40 μL，然后再加10 μL生物素標記的抗體。每孔加入酶標試劑50 μL，但空白孔不加。封板后于37℃中靜置30 min。將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋后備用。揭掉封板膜，倒掉液體，甩干后加滿洗滌液，靜置30 s后倒掉，重復(fù)洗滌5次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10 min后，迅速向每孔滴加50 μL終止液，用酶標儀讀取吸光度值。

1.3 TUNEL法檢測細胞凋亡水平

常規(guī)石蠟切片脫蠟，梯度乙醇水化，PBS沖洗2 min×3次，采用蛋白酶K(0.02 g/L，10 mmol/L Tris/HCl，pH=7.4～8.0)，21 ℃～37 ℃消化15～30 min，PBS沖洗2 min×3次，加入25 μL TUNEL反應(yīng)液，37℃作用60 min，PBS沖洗3 min×3次，滴加25～50 μL的AP抗體，37℃作用30 min，PBS沖洗3 min×3次，滴加BCIP/NBT，37℃作用20 min，PBS沖洗3 min×3次，復(fù)染，封片，烘干。鏡下觀察切片，細胞核染成深棕色的細胞為凋亡細胞。

1.4 Western blot檢測相關(guān)蛋白含量

按照蛋白提取試劑盒(購于南京建成生物科技有限公司)說明書，提取腫瘤組織總蛋白檢測IL-17、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的表達水平。BCA蛋白定量后上樣，60 V，10% SDS-PAGE凝膠電泳1.5 h，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中轉(zhuǎn)膜30 min，TBS封閉液封閉1 h，5%脫脂奶粉25℃封閉1 h，4℃下分別孵育IL-17、STAT3、p-STAT3一抗過夜，TBST洗10 min×3次，25℃孵育二抗1 h，TBST洗10 min×3次，曝光顯影，采用BIO-RAD Image Lab軟件對條帶進行灰度值分析。

1.5 免疫組化染色

將玻片置于500 mL的檸檬酸鈉緩沖液(0.01 mol/L，pH6.0)中，加熱至持續(xù)沸騰10 min，冷卻后，PBS洗滌5 min，重復(fù)洗滌3次。H2O2滅活內(nèi)源性過氧化氫酶15 min，PBS沖洗。加0.2%的Triton X-100通透10 min。滴加10%山羊血清封閉，室溫孵育20 min。然后滴加抗血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)抗體和CD34抗體(稀釋比例1∶500)，陰性對照滴加PBS，4℃過夜。PBS洗滌3次，每次5 min。滴加VEGF和CD34二抗試劑，室溫孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min。滴加DAB顯色，在鏡下觀察，當(dāng)顯色發(fā)生變化時，立即將玻片浸泡在去離子水中。下一步進行核染。在蘇木精溶液中染色4 min，在去離子水中浸泡1 min。室溫晾干載玻片，浸泡二甲苯透明，中性樹膠封片。晾干后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17-siRNA抑制腫瘤的生長

測量所得腫瘤的體積見圖1。兩組的腫瘤體積均隨時間逐漸增加。和對照組比較，IL-17-siRNA組的腫瘤體積在第5、7、9、11天時無顯著性變化(均P>0.05)，在第17、19、21天時，IL-17-siRNA組的腫瘤體積均顯著小于對照組(均P<0.05)，見圖1A。在第21天時，兩組的腫瘤體積見圖1B。

2.2 IL-17-siRNA促進細胞凋亡

通過TUNEL實驗檢測并分析兩組腫瘤組織中細胞的凋亡率，見圖2。和對照組比較，IL-17-siRNA組腫瘤組織中棕黃色明顯增加，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

與對照組比較，*P<0.05圖1 兩組腫瘤體積及其增長曲線Fig.1 Tumor volume and its growth curve in two groups

A：對照組；B：IL-17-siRNA組；與對照組比較，*P<0.05圖2 TUNEL法檢測IL-17對腫瘤細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of IL-17 on apoptosis of tumor cells

2.3 IL-17-siRNA對炎癥因子的影響

通過ELISA檢測血清中IL-4、IL-17、IFN-γ和TNF-α等炎癥因子的水平，見圖3。和對照組比較，IL-17-siRNA組的血清IL-4、IL-17、IFN-γ、TNF-α水平顯著降低，均P<0.05。

與對照組比較，*P<0.05圖3 各組血清中炎癥因子的表達變化Fig.3 Expression of inflammatory factors in serum of the two groups

2.4 IL-17-siRNA相關(guān)蛋白表達水平的影響

Western blot檢測腫瘤組織中p-JAK、JAK、p-STAT3、STAT3、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白的表達，見圖4。和對照組比較，IL-17-siRNA組腫瘤組織中p-JAK和p-STAT3蛋白表達顯著降低，Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9的表達顯著升高(均P<0.05)；JAK和STAT3的蛋白表達無顯著差異(均P>0.05)。

A：Western blot印跡圖；B：Western blot統(tǒng)計結(jié)果；與對照組比較，*P<0.05圖4 IL-17對腫瘤組織中p-JAK、JAK、p-STAT3、STAT3、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達的影響Fig.4 Effect of IL-17 on protein p-JAK，JAK，p-STAT3，STAT3，Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9 in tumor tissues

2.5 IL-17-siRNA抑制VEGF-A和CD34的表達

通過免疫組化實驗檢測兩組腫瘤組織中VEGF-A和CD34的表達情況，見圖5。和對照組比較，IL-17-siRNA組腫瘤組織中棕黃色信號減弱，VEGF-A和CD34表達降低。

圖5 IL-17對腫瘤組織中VEGF-A和CD34表達的影響Fig.5 Effect of IL-17 on VEGF-A and CD34 expression in tumor tissues

3 討論

IL-17是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細胞因子，由T細胞、中性粒細胞等產(chǎn)生，其靶細胞分布廣泛。IL-17具有強大的招募中性粒細胞、促進多種細胞釋放炎性因子、促進細胞增殖的作用，被認為參與了機體多種炎癥疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等的發(fā)生。目前多項臨床研究顯示，在胃癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等患者外周血或腫瘤組織中可檢測出IL-17表達水平增高，且其水平與腫瘤的惡性程度相關(guān)，但其促進腫瘤發(fā)生的機制尚未明確[4-6]。近年來隨著基礎(chǔ)研究的深入，發(fā)現(xiàn)IL-17可能通過促進腫瘤血管生成及干擾腫瘤免疫等機制發(fā)揮了促瘤作用。Rafa等[7]研究證明，在卵巢癌組織中，IL-17 mRNA的表達顯著高于正常組織，且IL-17陽性表達的腫瘤組織微血管密度顯著高于IL-17陰性表達的正常組織；在接種了含IL-17 cDNA的重組腫瘤細胞后，發(fā)現(xiàn)該腫瘤組織的血管密度明顯增多[8-10]；而腫瘤血管密度增高是血管生成活化的顯著表現(xiàn)，從而證明IL-17是通過促進血管生成作用達到促瘤作用的；且可能是通過促進VEGF的高表達來促進血管的生成[11]。本研究通過移植人上皮性卵巢癌細胞株SKOV3細胞建立裸鼠皮下成瘤模型，敲降IL-17后，結(jié)果顯示IL-17-siRNA組的腫瘤體積增加速率顯著低于對照組，且細胞凋亡率顯著升高，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達顯著升高，這表明敲降IL-17對裸鼠卵巢腫瘤的生長產(chǎn)生一定的抑制作用。

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是卵巢癌患者死亡的重要原因，血管新生為侵襲和轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)，在此過程中起關(guān)鍵作用，VEGF是目前已知最強的血管通透劑，它能導(dǎo)致癌性腹水或腫瘤間質(zhì)水腫，而且導(dǎo)致血漿、纖維等蛋白向血管外滲出，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的改變，從而促進血管的形成，是與惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和腹水形成相關(guān)的重要生長因子之一[4，12]。IL-17-siRNA組的VEGF-A表達顯著降低，提示敲降IL-17基因可能抑制VEGF-A的表達，抑制血管的生成，減緩卵巢癌細胞的遷移。

STAT3是STATs家族成員之一，定位于細胞質(zhì)內(nèi)，被激活后轉(zhuǎn)入核內(nèi)和相應(yīng)DNA結(jié)合，引發(fā)靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄。STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活后，作用于特異的DNA片段，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[13-15]。STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了細胞的增殖、分化和凋亡的過程。STAT3的異?；罨梢鸺毎惓７只驮鲋?，并抑制細胞凋亡，導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化，促進腫瘤的形成。且有研究發(fā)現(xiàn)，STAT3在許多惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達，如胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等常見腫瘤[16-20]。STAT3參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，也參與調(diào)控腫瘤細胞的凋亡和增殖活動。和對照組比較，IL-17-siRNA組的p-STAT3表達顯著降低，提示敲降IL-17基因可能抑制STAT3的磷酸化，減緩卵巢癌的發(fā)展。

綜上，敲降IL-17基因可能通過抑制IL-17-STAT3信號通路，抑制VEGF-A的表達，抑制卵巢腫瘤細胞的遷移，促進腫瘤組織細胞凋亡，減緩卵巢癌的發(fā)展。