miR-34b/c基因rs4938723的單核苷酸多態(tài)性與少精癥的相關(guān)性研究

柯紅利，阿周存

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

精子發(fā)生是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，涉及眾多相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)調(diào)控。相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控異常會(huì)引起生精異常，導(dǎo)致生精障礙，如無精癥、少精癥等〔1〕。微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）通過與靶基因的mRNA結(jié)合并沉默靶基因，參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控〔2〕，而轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是精子發(fā)生過程基因表達(dá)調(diào)控的重要方式，是正常生精不可或缺的〔3〕。有研究顯示，miRNA在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，其異常可能導(dǎo)致生精障礙〔4〕。然而，具體哪些miRNA與生精障礙有關(guān)還不完全清楚。

近年來，在小鼠模型中的研究顯示，miR-34b/c是小鼠正常生精所必需的miRNA，其異常與小鼠的生精障礙相關(guān)〔5〕。這提示miR-34b/c基因也可能與人類生精障礙相關(guān)，但目前缺乏相應(yīng)研究資料。鑒于此，本研究在漢族人群中，對(duì)miR-34b/c基因的常見單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)rs4938723的多態(tài)性與少精癥的相關(guān)性進(jìn)行研究，初步探索miR-34b/c基因與少精癥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象病例組由273個(gè)少精癥患者組成，來自于四川大學(xué)華西醫(yī)院和大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院，根據(jù)WHO（世界衛(wèi)生組織）指南診斷為少精癥的男性（精子密度小于15×106個(gè)/mL）。對(duì)照組包括234個(gè)精子密度正常的男性。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增 用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒，從研究對(duì)象的外周血中提取基因組DNA。SNPrs4938723的PCR擴(kuò)增引物序列為：5'-CTCTGGGAACCTTCTTTGACCCAT-3'和 5'-TGAGATCAAGGCCATACCATTCAAGA-3'，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為147 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的體積為25μL，反應(yīng)的條件為：94℃預(yù)變性5 min，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s），最后72℃延伸5 min。

1.2.2 基因分型 利用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析對(duì)SNP rs4938723進(jìn)行基因分型。取PCR產(chǎn)物10μL，用10個(gè)單位的限制性內(nèi)切酶BclⅠ消化過夜，然后在3%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳?；蛐蚑T為1條帶（147 bp），TC為3條帶（147 bp，118 bp和29 bp），CC為2條帶（118 bp和29 bp）。通過對(duì)不同基因型的部分標(biāo)本進(jìn)行PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，對(duì)電泳分型結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過計(jì)數(shù)計(jì)算基因頻率和基因型頻率。用HWE計(jì)算器進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。用χ2檢驗(yàn)比較患者組和正常對(duì)照組之間等位基因和基因型頻率之間的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果

檢測(cè)到miR-34b/c基因SNP rs4938723位點(diǎn)所具有的TT、TC、CC全部3種基因型。測(cè)序結(jié)果與電泳分型結(jié)果一致，表明所采用的基因分型方法可靠。見圖1。

圖1 SNPrs4938723的電泳分型結(jié)果

SNPrs4938723的等位基因頻率和基因頻率分布在少精癥患者和正常男性間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；少精癥患者的等位基因C的頻率（35.0%vs.28.2%，P=0.021，OR=1.378，95%CI為1.048～1.789）和基因型CC的頻率（13.9%vs.7.3%，P=0.016，OR=2.064，95%CI為1.132～3.764）顯著高于正常男性。見表1。經(jīng)HWE計(jì)算器分析檢驗(yàn)，SNP rs4938723的基因型分布在少精癥患者和正常男性中符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

3 討論

近年來，一系列研究結(jié)果顯示，miR-34b/c基因的SNP位點(diǎn)rs4938723的多態(tài)性影響多種疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，如冠心病、缺血性中風(fēng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和癌癥等〔6-10〕，提示miR-34b/c基因可與不同的疾病的發(fā)生有關(guān)。然而，miR-34b/c基因與生精障礙的關(guān)系尚未明確。鑒于miR-34b/c基因在精子發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，推測(cè)miR-34b/c基因也可能與人類的生精障礙相關(guān)。為了驗(yàn)證上述推測(cè)，本研究在273個(gè)少精癥患者和234個(gè)正常男性中，對(duì)miR-34b/c基因SNP位點(diǎn)rs4938723的多態(tài)性分布進(jìn)行調(diào)查。研究結(jié)果顯示，SNPrs4938723的基因型分布在少精癥患者和正常人群中符合Hardy-Weinberg平衡，表明本研究的對(duì)象具有群體代表性；在少精癥中SNP rs4938723的等位基因C的頻率和基因型CC的頻率顯著高于正常人群，提示SNP位點(diǎn)rs4938723的多態(tài)性與少精癥相關(guān)，基因型CC可能增加少精癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR=2.064）。

表1 兩組患者rs4938723的等位基因頻率和基因型頻率分布［n（%）］

雖然本研究的結(jié)果表明SNP rs4938723的CC基因型可能增加無精癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但具體機(jī)制還不清楚。SNP rs4938723是一個(gè)位于miR-34b/c基因啟動(dòng)子區(qū)的C/T變異，其影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合進(jìn)而影響啟動(dòng)子的活性；與等位基因T相比，等位基因C會(huì)降低啟動(dòng)子的活性，使miR-34b/c表達(dá)水平下調(diào)，導(dǎo)致CC基因型個(gè)體的miR-34b/c表達(dá)水平顯著低于TT和TC基因型個(gè)體〔11〕。有研究顯示，在無精癥和少弱精癥患者的睪丸組織或精子中，miR-34b/c的表達(dá)水平顯著降低，而在正常生精個(gè)體中則高表達(dá)，提示miR-34b/c的表達(dá)水平降低可能影響精子的數(shù)量〔12-13〕。此外，在小鼠中的研究表明，高miR-34b/c表達(dá)水平是有效調(diào)控生精過程中一些關(guān)鍵基因（如Nanos 2基因等）的表達(dá)，從而確保生精過程正常進(jìn)行所必需的〔14-15〕。因此，CC基因型個(gè)體的miR-34b/c表達(dá)水平降低，可能影響正常的生精過程，進(jìn)而引起精子數(shù)量的減少。這可能是本研究所發(fā)現(xiàn)的CC基因型增加少精癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)原因。

目前，尚未見有關(guān)miR-34b/c基因的多態(tài)性與生精障礙相關(guān)性的研究報(bào)道。本研究首次對(duì)miR-34b/c基因SNP位點(diǎn)rs4938723的多態(tài)性與少精癥的關(guān)系進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)SNPrs4938723的多態(tài)性與少精癥相關(guān)，SNPrs4938723的CC基因型可能增加少精癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，提示miR-34b/c基因可能參與了少精癥的發(fā)病。研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明miR-34b/c基因在人類生精障礙中的作用提供一些有價(jià)值的參考。