微流控SERS及其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的研究進展

徐迪，黃青*

(1. 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院，中國科學(xué)院強磁場與離子束物理生物學(xué)重點實驗室，合肥 230031；2. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，合肥 230026)

1 引言

微流控芯片又稱芯片實驗室(Lab on a chip)，是一種在微米級尺度上實現(xiàn)操作微觀物體及分析微量樣品的技術(shù)。微流控芯片作為微全分析系統(tǒng)(micro total analysis systems,TAS)中最活躍的領(lǐng)域和發(fā)展前沿，其概念最早是于1990年由Manz提出[1]，他們以微機電加工技術(shù)(Microelectromechanical system, MEMS)作為建立TAS的技術(shù)基礎(chǔ)，設(shè)計了一款微型化硅基開放式液相色譜儀器，將樣品預(yù)處理、分離及檢測功能集成于一張芯片上。微流控芯片的設(shè)計理念及最終目的就是將分析實驗室的功能轉(zhuǎn)移到便攜的微型化、集成化的芯片上，實現(xiàn)分析實驗室的個人化、家用化。自微流控芯片發(fā)展的二十年來，芯片的制作材料、加工技術(shù)、操控及檢測方法日漸成熟，在化學(xué)分析和化學(xué)合成等許多領(lǐng)域逐漸得到應(yīng)用[2]。微流控芯片系統(tǒng)最突出的優(yōu)勢在于樣品消耗少、反應(yīng)時間短，而對于稀少且易失活的生物樣品來說無疑是一種極好的分析工具。因此，近年來微流控芯片在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用受到格外重視[3]，如核酸測定[4]、蛋白質(zhì)檢測[5]、臨床診斷[6]、細胞分析[7]、藥物發(fā)現(xiàn)[8]等，另外在環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測、食品健康與安全檢測[9]等方面也顯示了良好的應(yīng)用前景。

微流控芯片與檢測器結(jié)合構(gòu)成微流控芯片分析系統(tǒng)，使得微流控芯片的研發(fā)及應(yīng)用不斷獲得發(fā)展。檢測器是整個分析系統(tǒng)中尤為關(guān)鍵的部分，其好壞直接關(guān)系到整個微流控芯片分析系統(tǒng)的性能，如檢測速度、樣品體積、檢出限及檢測范圍等。相對于傳統(tǒng)分析系統(tǒng)，微流控芯片由于具有特殊的微觀性狀如樣品體積小、檢測區(qū)域小、樣品流速快等，因此對檢測器的要求更加嚴格，如更高的靈敏度、更好的信噪比及更快的響應(yīng)速度；同時，檢測器的微型化和可集成性始終作為微流控分析的一個重點研究方向；此外，具有高通量的微流控芯片要求檢測器具備多重平行檢測功能[10]。現(xiàn)已用于微流控芯片上的檢測技術(shù)有電化學(xué)檢測[11]、質(zhì)譜分析[12]、光學(xué)檢測等。光學(xué)檢測器具有檢測速度快、靈敏度高等優(yōu)勢，其中與微流控芯片系統(tǒng)聯(lián)用的光學(xué)檢測器以熒光檢測器[13]、化學(xué)發(fā)光檢測器[14]、吸收光度檢測器[15]及拉曼散射檢測器[16]等為主。其中拉曼光譜檢測具有很多其他檢測技術(shù)難以達到的優(yōu)勢，首先它具有優(yōu)異的指紋識別能力，譜線銳利，可反映物質(zhì)分子的細微結(jié)構(gòu)變化；其次在樣品處理上也十分的簡便，所需樣品量少，對樣品的性質(zhì)和狀態(tài)無過多限制，有機、無機化學(xué)成分和生物材料均可檢測；另外拉曼光譜可對樣品進行無接觸、無損傷檢測，光譜成像簡便、分辨率高、分析快速；而且拉曼光譜儀器體積適中、操作簡單，以上優(yōu)勢與微流控芯片的特征相容性程度很高。拉曼光譜與微流控芯片技術(shù)結(jié)合，可以準確地且快速地監(jiān)測、檢測并分析微流控環(huán)境中的各種微小體積的生化樣品，特別是對于稀少且昂貴的生物樣品以及需要連續(xù)監(jiān)測的環(huán)境樣品等。目前拉曼微流控系統(tǒng)在單細胞分析尤其是在細胞分選上表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，與流式細胞術(shù)相比無需進行標記，芯片上流體操控更加精確，可實現(xiàn)在高速流動狀態(tài)下單細胞的捕獲、拉曼光譜采集及自動分離[17-18]。最近剛發(fā)表的關(guān)于自動化拉曼光譜儀用于活細胞功能分選的工作[19]特別介紹了一個微流控光學(xué)平臺集成了微流體、光鑷和拉曼光譜技術(shù)，用于對穩(wěn)定同位素標記的微生物細胞進行自動化分類，適合于后續(xù)單細胞基因組學(xué)、微型宏基因組學(xué)的研究。

但普通拉曼光譜固有的缺點是信號極弱，其散射光強度約為入射光強度的10-6～ 10-9，拉曼光譜的應(yīng)用受到限制。表面增強拉曼光譜(SERS)的發(fā)現(xiàn)使這一狀況大為改觀[20]，即當分子吸附于金或銀等貴金屬納米材料表面時，在電磁場增強及電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)下其拉曼信號可增強6～11個數(shù)量級[21]，靈敏度得到了質(zhì)的提升，單分子[22]及單細胞水平[23]檢測成為可能。所以，融合SERS檢測技術(shù)的微流控芯片可將拉曼微流控系統(tǒng)的分析水平和應(yīng)用范圍大大提高。實際上，近年來人們開始發(fā)展SERS與微流控系統(tǒng)相結(jié)合的技術(shù)，并在分析檢測方面已有十多年應(yīng)用和研發(fā)的歷史。Cooper團隊[24]于2002年首次將SERS應(yīng)用到微流控芯片上，在微流體通道內(nèi)用硼氫化鈉還原硝酸銀的方法合成膠體銀作為流動的SERS基底，膠體銀聚集形成間距小于10 nm的納米隙，在共振波長激發(fā)下，納米隙能產(chǎn)生一個顯著增強的電磁場，即所謂的“熱點”，熱點處的分子被激發(fā)得到增強的拉曼信號。該系統(tǒng)可用于檢測低至10 fmol的偶氮染料，與宏觀流動狀態(tài)下相比微流控芯片SERS檢測的靈敏度高出了1～2個數(shù)量級。隨后大量的相關(guān)工作被報道，盡管大多報道將SERS微流控平臺僅用于具有高散射界面的分子如羅丹明6G[25]、結(jié)晶紫[26]等的檢測，但人們很快將目標集中在生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域，利用SERS微流控技術(shù)，在諸如病原體鑒定[27]以及各種疾病的生物標志物檢測[28]等方面開展了大量工作。

本綜述針對SERS微流控芯片近年來發(fā)展及在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用研究作了較為系統(tǒng)的介紹和論述。首先介紹SERS微流控芯片系統(tǒng)的核心部件——微流控芯片的制作和加工，以及如何在SERS微流控芯片上進行流體操控，接著介紹了近年來微流控芯片中SERS基底的發(fā)展情況，隨后重點介紹和討論近年來SERS微流控芯片系統(tǒng)在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用及代表性或突破性工作，包括生物分子的檢測、細胞分析、藥物監(jiān)測和篩選、疾病診斷，以及關(guān)于環(huán)境衛(wèi)生和食品健康方面的檢測，最后對涉及該技術(shù)發(fā)展中的問題提出一些看法，對其未來的發(fā)展前景予以展望。

2 SERS微流控芯片系統(tǒng)

2.1 微流控芯片的制作

微流控芯片的制作材料從無機材料硅、玻璃及石英發(fā)展到現(xiàn)在使用最廣泛的有機聚合物如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，另外低成本的陶瓷材料以及新興的紙基材料也被用于微流控芯片的制作。硅由于具備良好的化學(xué)惰性和熱穩(wěn)定性，且作為微電子行業(yè)的基礎(chǔ)材料，其加工工藝及相關(guān)設(shè)備已相當成熟，在TAS發(fā)展初期首先被用于制作微流控芯片(圖1a)[29]，但是由于硅材料自身的缺點如易碎、不透光、電絕緣性欠佳等，后來一度被玻璃和高聚物所取代。玻璃材料價廉易得、透光、耐腐蝕，且易構(gòu)建微結(jié)構(gòu)如微閥或微泵，由玻璃基底及其他材料復(fù)合形成的多路閥如圖1b所示[30]。石英芯片的透光性好，且拉曼背景低，適用于制作用于拉曼檢測的芯片。低溫共燒陶瓷(LTCC)是一種氧化鋁基材料，它在層壓板中形成圖案、完成組裝，然后在高溫下燒結(jié)形成芯片(圖1c)[31]。LTCC在制造復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)、多層結(jié)構(gòu)和低成本的微流控器件上有一定的優(yōu)勢。有機聚合物材料由于具有選擇空間大、易加工、價格低廉且可進行大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，非常適合于批量制作一次性微流控芯片，其中熱固性聚合物聚二甲基硅氧烷(PDMS)是當前應(yīng)用最多的微流控芯片材料之一[32]。PDMS透氣透光、無毒、成本低廉、化學(xué)惰性、制作快捷，具有特殊的彈性易于加工微型控制結(jié)構(gòu)，另外通過疊合多層PDMS可制作復(fù)雜結(jié)構(gòu)功能化芯片(圖1d)[33]。Whitesides等于20世紀90年代末期采用了軟光刻方法制作微流控芯片[34]，此后PDMS和軟光刻法被推廣開來，成為實驗室普遍采用的芯片制作材料和方法。凝膠材料具備良好的透過性以及生物相容性，主要應(yīng)用在細胞培養(yǎng)及組織工程的研究中(圖1e)[35]。新提出的紙基芯片處于高速發(fā)展的階段，其來源豐富、成本低廉、便攜性好，具有良好的生物相容性，且廢棄后易處理，引起了科研人員的廣泛關(guān)注。第一例紙基微流控芯片是由Whitesides團隊于2007年報道[36]，該芯片上的液體是在毛細作用下實現(xiàn)被動運輸，無需外接驅(qū)動裝置，如圖1f所示。紙基芯片適合于需要成本低且操作簡單的快速分析，其推動了便攜式分析設(shè)備在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[37]。

圖1 不同材料制作的芯片。(a)硅[29]；(b)玻璃[30]；(c)陶瓷[31]；(d)PDMS[33]；(e)凝膠[35]；(f)紙[36]

Fig 1 Microfluidic chips fabricated by different materials: (a) silicon[29]; (b) glass[30];(c) ceramic[31]; (d) PDMS[33]; (e) gel[35]; (f) paper[36]

硅片、玻璃和石英芯片的制作方法一般采用成熟的微細加工技術(shù)，即半導(dǎo)體及集成電路芯片廣泛使用的光刻和蝕刻技術(shù)。芯片制作過程主要包括薄膜沉積、光刻和蝕刻三個工序。薄膜沉積是通過熱氧化、化學(xué)氣相沉積、氣相外延、物理氣相沉積、涂敷、濺射等方法在基片表面覆蓋一層薄膜，薄膜作為犧牲層，提高了刻蝕時的選擇性，起到對基片的保護作用。光刻和蝕刻技術(shù)是將掩模上設(shè)計的微流控芯片圖案通過曝光成像轉(zhuǎn)移到薄膜上并進而在基片上加工成特定微結(jié)構(gòu)的工藝。有機聚合物芯片的制作則與無機材料芯片有很大的區(qū)別，可采用的制作技術(shù)有傳統(tǒng)的模塑法、注塑法、熱壓法，或激光燒蝕法、LIGA(X射線光刻、微電鑄與微復(fù)制)、軟光刻以及新興的3D打印法等。激光燒蝕法[38]是一種新型微細加工技術(shù)，利用可光解聚合物在紫外激光作用下發(fā)生激光濺射，采用掩?；蛑苯痈鶕?jù)計算機輔助設(shè)計(CAD)精密控制濺射位置，從而得到具有特定結(jié)構(gòu)的芯片。激光燒蝕得到的微流控芯片通道壁垂直、深寬比大，但加工效率低，激光器昂貴且具有一定的危險性。LIGA[39]是一種基于X光深層光刻、微電鑄和微復(fù)制的MEMS加工技術(shù)，近來已用于制作熱壓法和注塑法所需的模具及高深寬比的聚合物芯片。軟光刻是20世紀90年代末提出的一種新的微圖形復(fù)制技術(shù)，它的研發(fā)及在PDMS材料的大規(guī)模應(yīng)用是微流控芯片發(fā)展史上一個重要的里程碑。該技術(shù)用彈性介質(zhì)代替了傳統(tǒng)光刻中使用的硬模，多數(shù)條件下用PDMS，利用這種彈性介質(zhì)進行簡便而又精確的復(fù)制，從而提高了微制作的效率。另外，軟光刻技術(shù)能在曲面上操作，可制造復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)，相對于傳統(tǒng)光刻應(yīng)用更加靈活。軟光刻技術(shù)沒有光散射引起的精度限制，可以達到30 nm～1m的微結(jié)構(gòu)尺寸。近年來，3D打印法在分辨率和速度方面的提升使微流控器件的制作過程直接簡化為一步，是最有可能將芯片推向商業(yè)化的一項制作技術(shù)[40]。與傳統(tǒng)方法相比，除了高速和高分辨率，3D打印在制造微流控器件方面還有其他顯著的優(yōu)點，包括適用材料廣、可制造特殊的孔結(jié)構(gòu)，甚至可將將多孔的組織支架嵌入到芯片。另外，生物材料如活細胞和生長因子，可以直接用3D打印機打印[41]。

圖2 微通道構(gòu)型被動混合器。(a)微柱陣列[46]；(b)鱷魚齒狀[47]；(c)級聯(lián)分裂重組[44]；(d)多通道交替混合[43]

Fig 2 Passive micromixers based on designed microfluidic channels such as (a) a pillar array microfluidic channel[46]; (b)an alligator teeth-shaped microfluidic channel[47]; (c)the cascaded splitting and recombination (C-SAR) microfluidic mixer[44]; (d)multiple channels for fast and alternating mixing[43]

2.2 SERS微流控芯片上的流體操控

微流控芯片在SERS測量之前主要用于特定樣品的預(yù)處理[42]，控制目標分析物與金屬納米材料之間的混合[43]，另外控制納米粒子間距以增強SERS信號[44]，通過流體操控捕獲樣品制造小體積、高濃度樣品，以便從目標物中獲得詳細的拉曼光譜信息[45]。如何實現(xiàn)微流控芯片上對流體的精密操控，為完成后續(xù)光譜分析提供保障，以充分利用SERS系統(tǒng)的高靈敏度和高選擇性，這就需要芯片上各種微結(jié)構(gòu)的配合使用如微泵、微閥、微混合器等，對微流體環(huán)境進行精準有效的控制。以微結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)建立的各個功能化的模塊，可以對復(fù)雜樣品進行預(yù)處理，如分離、富集、捕獲等，從而提高SERS微流控系統(tǒng)的分析能力。

SERS檢測要求目標分析物與SERS基底即納米材料的充分混合，所以微流控通道的設(shè)計或微混合器的使用十分重要。在微流控通道中，微米尺度下的流體均以低雷諾數(shù)的層流形式流動，分子只能通過擴散進行混合。為了混合充分，目前使用較多的是根據(jù)微流體力學(xué)原理設(shè)計復(fù)雜的通道構(gòu)型以提高混合效率，減小混合所需的時間和空間，如微柱陣列[46]、鱷魚齒狀[47]、 級聯(lián)分裂重組[44]及多交替通道微混合器[43]等(圖2)。另外，SERS微流控系統(tǒng)中已經(jīng)報道的主動混合器有電動[48]及磁力攪拌[28]混合器，另外氣泡誘導(dǎo)[49]、聲波驅(qū)動[50]等混合器具有應(yīng)用潛力。主動混合器可以實現(xiàn)良好的混合，但相對于被動微混合器來說成本高、集成難，通常需要復(fù)雜的控制單元和外部驅(qū)動等。

另外，生物樣品的復(fù)雜性對目標分子SERS光譜分析帶來一定的干擾，所以樣品預(yù)處理技術(shù)在SERS微流控系統(tǒng)研發(fā)和應(yīng)用中也十分關(guān)鍵。SERS微流控系統(tǒng)常采用芯片毛細管電泳對復(fù)雜樣品中的多種組分進行高速分離，Schultz等[51]設(shè)計的毛細管電泳SERS芯片中毛細管附著在鞘流界面上，用于分離后的流體分析物的連續(xù)流動和聚焦，并將其準確引入SERS基底上，該裝置已用于氨基酸[52]及多肽[53]等的高效分離。Perozziello等[54]將微滲析膜安裝在微流控芯片中，可以在樣品到達SERS基底之前從較大的蛋白質(zhì)中分離出較小的蛋白質(zhì)或其他小分子。Kong等[55]采用由高度多孔的硅藻土作為微流體通道的材料，將色譜分離集成在芯片通道內(nèi)，利用該裝置從混合物或復(fù)雜生物流體中分離小分子。Durucan等[56]結(jié)合了離心力和毛細作用力在SERS襯底上進行樣品的分離純化，即快速、簡便地提取牛奶中的三聚氰胺。Au NP陣列阻礙了大分子的擴散，離心下的慣性力加速了過濾過程，小分子擴散到相對純凈的環(huán)境中。Morelli,等[42]介紹了一種集過濾、液液萃取和檢測SERS傳感器于一體的離心式微流控自動化平臺，用于檢測大腸桿菌的次生代謝物---對香豆酸，并可能適用于其他次級代謝物如抗生素、維生素和藥物的提取和檢測。集成在芯片內(nèi)的醋酸纖維素膜用于過濾細胞，萃取室與裝載二氯甲烷的腔室及導(dǎo)入過濾后樣品的蛇形虹吸管相連，蛇形虹吸管分裂成四個通道連接在萃取室底部，以產(chǎn)生氣泡提高混合和萃取效率，萃取后的樣品直接通入檢測室獲取SERS圖譜。

2.3 微流控芯片中的SERS材料或基底

SERS通常采用由Ag、Au、Cu等金屬納米材料作為SERS活性基底，增強原理目前可以分為電磁場增強(EM)及化學(xué)增強(CE)[21]。SERS光譜強度可通過以下公式近似表示[57]：

(1)

(2)

式中GEM為EM增強因子，A(νL)和A(νs)分別為激光和拉曼散射場的增強因子，ε0為周圍介質(zhì)的介電常數(shù)，ε(ν)為金屬納米材料的介電函數(shù)，d為分析物和金屬納米材料的距離，和項(αρσ)nm為CE增強因子。同時將EM和CM結(jié)合是SERS實現(xiàn)超痕量檢測的關(guān)鍵，其靈敏度可與熒光光譜相媲美[58]。盡管作用機制不同，二者均受到SERS活性基底即納米材料的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)影響。

關(guān)于SERS熱點構(gòu)建，主要基于EM機制設(shè)計各種納米尺度形狀的材料和平臺，從單個粒子發(fā)展到復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，也將設(shè)計理念從最初的創(chuàng)造具有獨特結(jié)構(gòu)特征以提高單個粒子的熱點密度，發(fā)展到利用多維等離子體耦合來顯著提高熱點強度。在單個粒子形狀的設(shè)計上，主要利用大曲率結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出的“避雷針效應(yīng)”以獲得較高的電磁場增強，例如Au和Ag納米球[59]、納米棒[60]、納米錐[61]、納米星[62]、花狀[63]等結(jié)構(gòu)的納米粒子，他們因具有納米尺度的尖角、脊、溝槽、尖端或粒子內(nèi)間隙表現(xiàn)出強烈的SERS活性。除了直接合成復(fù)雜的納米粒子形貌外，還可以通過對合成后的納米粒子進行形態(tài)修飾，如在納米銀八面體的邊緣及尖端區(qū)域選擇性沉積Au納米粒子[64]，或者將原先合成的材料刻蝕掉一部分，如通過化學(xué)刻蝕增加Ag納米顆粒的粗糙度以提高熱點EM增強效應(yīng)[65]。第二種SERS熱點產(chǎn)生于耦合納米結(jié)構(gòu)的可控的粒子間納米間隙，典型的例子是Au或Ag 納米粒子二聚體，用于SERS 單分子檢測，以及核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子二聚體、納米粒子聚集體或寡聚體及納米粒子陣列等。通常，耦合等離子體納米結(jié)構(gòu)的平均SERS強度比單個納米結(jié)構(gòu)的平均SERS強度高出四個數(shù)量級[66]。三維結(jié)構(gòu)的納米材料的引入不僅能使吸附和檢測到的目標分子更多，而且有效提高了熱點的數(shù)量及其在Z方向上的利用率。目前3D SERS平臺的制造策略主要分為自上而下和自下而上兩種。自下而上是通過納米顆粒自組裝形成各種大面積三維結(jié)構(gòu)和緊密堆積的超晶體[67]。而自上而下是采用傳統(tǒng)的微加工方法(如光刻、反應(yīng)離子刻蝕等)來設(shè)計納米器件[68，69]，目前自上而下的制造技術(shù)在精度方面受到著如電子束光刻的空間分辨率限制，難以重復(fù)制作粒子間間隙小于10 nm的陣列結(jié)構(gòu)。為了克服這一限制，研究者提出將自上向下與納米顆粒自組裝結(jié)合起來制造具有納米級粒子間隙的3D SERS基底的方法，即由模板引導(dǎo)的納米顆?；瘜W(xué)自組裝[70]。

圖3 金屬膠體在微流控通道中的可控聚集。(a-b)介電泳驅(qū)動力按需捕獲并釋放銀納米顆粒[78]；(c)光電鑷子聚集金納米粒子于激光光斑內(nèi)[79]；(d)磁聚焦納米顆粒[81]:金包覆NiFe磁性納米粒子NiFe@Au，Ab1捕獲抗體，Ab2檢測抗體，RL拉曼標記分子，腫瘤生物標志物CEA

Fig 3 The controllable aggregation of SERS-active nanoparticles in the microfluidic channel. (a-b)Dielectrophoretic actuation[78]for on-demand nanoparticle aggregation and release; (c)optoelectronic tweezer for accumulating gold nanoparticles in a laser spot[79]; (d)magnetic focusing realized by functional nanoprobes(NiFe@Au), capture antibody(Ab1), detection antibody(Ab2), and Raman label (RL)[81]

以上金屬納米材料的SERS熱點只通過電磁場增強來實現(xiàn)，為了進一步提高熱點增強效應(yīng)，一些功能材料如石墨烯[71]、半導(dǎo)體[72]和壓電聚合物[73]等被引入，它們與傳統(tǒng)的SERS活性金屬納米材料結(jié)合形成復(fù)合材料產(chǎn)生新型SERS基底。這些材料可以提供額外的化學(xué)或電場增強，與金屬納米粒子產(chǎn)生的電磁增強相互補充，在原有的基礎(chǔ)上提升10～102倍。此外，復(fù)合的SERS基底結(jié)合了這兩種材料的固有特性，克服了傳統(tǒng)的純貴金屬SERS基底的局限性，如增強了材料表面與分析物的親和力，提高了穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。除了提高SERS基底的熱點強度外，另一種提高SERS信號的方法是增強目標分子的捕獲率，該操作可進一步將SERS性能提高10-104倍。分子捕獲旨在通過各種途徑提高SERS活性位點的局部分析物濃度，特別是對于與材料表面沒有親和力的分子。

一般說來，被測樣品的拉曼信號增強可以從三個方面考慮：擴大分子拉曼截面[74]、在材料表面通過化學(xué)修飾捕獲分子[75]、以及用物理方法將分析物直接限制在SERS-活性表面[76]。如何將以上多種高質(zhì)量的SERS基底應(yīng)用到微流控通道中是構(gòu)建SERS微流控系統(tǒng)的一個重要環(huán)節(jié)?？傮w來說微流控通道中的SERS基底可以分為兩類：金屬膠體和固態(tài)基底?；诮饘倌z體的SERS基底合成及使用方法簡單方便，首個SERS微流控系統(tǒng)就是以膠體銀作為流動的SERS基底[24]，膠體銀通過硼氫化鈉還原硝酸銀的方法在微流體通道內(nèi)原位合成，或可預(yù)先合成金屬膠體然后直接注入微流控通道以進行后續(xù)的SERS檢測[47]。金屬膠體的合成依賴于帶電表面活性劑作為穩(wěn)定劑和分散劑，離子環(huán)境的變化會導(dǎo)致膠體聚集，這種隨機不可控的聚集導(dǎo)致電磁場增強分布不均，引起信號不均、重現(xiàn)性差的問題需得到解決。近年來關(guān)于金屬膠體的在微流控通道中可控聚集的研究工作取得了一定的進展。介電泳在微流控裝置中被廣泛應(yīng)用于粒子和細胞的操縱、分選和捕獲，其是指極化粒子在電場梯度中的遷移。Chrimes等利用介電泳控制銀納米粒子在通道中的聚集及間距，有效地提高SERS活性熱點的數(shù)量，同時避免粒子的不可逆聚集[77]。Salemmilani等[78]采用介電泳技術(shù)，高度局部地按需捕獲并釋放銀納米顆粒，如圖3a和3b所示，裝置包括夾在電極基板和頂蓋之間的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微通道，通道出口處的真空泵用于建立負壓引起流體流動。在電極接觸墊上施加交流電位以激活介電泳納米粒子捕獲陷阱。銀納米粒子與分析物預(yù)混合，在陷阱區(qū)團聚形成SERS熱點，然后利用拉曼顯微鏡掃描陷阱區(qū)獲得光譜。研究者利用光電鑷子[79]將金納米粒子聚集在激光光斑內(nèi)，實現(xiàn)了對SERS信號的原位增強和測量，如圖3c所示。通過光誘導(dǎo)電動機理使分散在樣品溶液中的金納米粒子集中到激光光斑中并激發(fā)拉曼散射，實現(xiàn)了按需產(chǎn)生SERS活性位點及原位測量SERS信號。除了采用光電，磁場也可用于控制納米粒子聚集。研究者利用免疫反應(yīng)將表面修飾有抗原的金納米顆粒與負載有相應(yīng)抗體的磁珠結(jié)合，通道中固定的螺線管通電后產(chǎn)生的磁場用于捕獲上述免疫復(fù)合物，SERS檢測信號與待測物中抗原的含量成負相關(guān)[80]。另外還可以采用磁性物質(zhì)如鎳鐵與貴金屬形成的核殼型納米材料作為SERS活性基底，直接通過磁場進行控制[81](圖3d)。在生物免疫結(jié)合作用下，納米探針被磁聚焦在微流控通道中的一個特定點上，從而能夠富集“熱點”，用于對靶向的癌胚抗原進行SERS檢測。除了以上外部施加的主動驅(qū)動力，通道內(nèi)部的結(jié)構(gòu)設(shè)計可在特定位置提供毛細管力直接用作納米粒子的聚集點[82]。如在一個縮窄的、臺階式的微通道-納米通道結(jié)處，由于通道面積突然減小，大量納米粒子團聚在此，電磁增強因子達到108，同時目標分子也集中在此處，SERS信號得以大幅度提升。

基于金屬膠體的SERS微流控系統(tǒng)可以提供可控的流動檢測條件，使信號差異平均化，減少局部升溫，從而提高檢測重復(fù)性。但存在的問題是分析物與金屬納米顆?；旌系臅r間較長，且不易混合均勻，甚至堵塞通道。在固態(tài)SERS基底中，這些問題是可以避免的，因為SERS基片不會隨分析物流動。此外，為了產(chǎn)生均勻的熱點陣列，固態(tài)SERS襯底需精確控制納米間隙，這是獲得電磁場增強和高重現(xiàn)性所必需的。在微流控芯片中嵌入固態(tài)SERS基底主要可以通過兩種方式實現(xiàn)，一種是在微流控通道內(nèi)原位制備SERS活性金屬納米結(jié)構(gòu)，另一種是在固態(tài)SERS基底上構(gòu)建微流控通道。在芯片中原位制備固態(tài)SERS基底，如采用多元醇還原法原位制備納米Ag薄膜，該方法簡單方便且成本低[83]，制備過程及表征如圖4所示。將以硅片為襯底的PDMS通道加熱至150℃并注入Ag前驅(qū)體。前驅(qū)體中的Ag+被還原成核，在一定的Ag+濃度條件下，Ag核生長為Ag納米粒子并在襯底和PDMS通道的表面形成Ag薄膜。圖案化Ag薄膜的SERS增強系數(shù)為4.25×1010，用于實時傳感檢測。電偶置換法可在室溫下進行，如將銀納米顆粒原位電沉積在粗糙Cu核/C鞘層納米壁上，在通道內(nèi)形成高活性拉曼基底[84]。在該方法中，電極必須集成到微流控通道中，納米銀的沉積形狀和位點可通過預(yù)先圖案化的電極來控制。納米銀沉積的的納米壁具有很大吸附的面積，以及大量的SERS熱點，計算的表觀增強因子高達1.1×109。該方法為在微流控通道內(nèi)集成SERS活性基底開辟了新的途徑。另外有研究者提出通過光熱效應(yīng)在芯片中原位生長負載Ag NP的ZnO納米棒(Ag@ZnO)3D SERS基底[85]。飛秒激光直寫技術(shù)以其獨特的設(shè)計性和可控性，被認為是制備光聚合物微納結(jié)構(gòu)的一種強有力的方法。Xu等利用飛秒激光誘導(dǎo)銀離子光還原，在微流控通道內(nèi)原位合成銀納米花陣列基底[86]，該微通道被用作實時監(jiān)測的催化微反應(yīng)器。

圖4 (a)多元醇還原法原位制備納米Ag薄膜流程圖；(b)通道中Ag薄膜的SEM圖像；(c)Ag薄膜PDMS通道；(d)Ag薄膜硅片[83]

Fig 4 (a) In-situ fabrication Ag thin films by a polyol method; (b) SEM image of the Ag thin film in a channel; (c) a PDMS channel and (d) a Si wafer patterned with Ag thin films[83]

除了上述的在芯片上原位合成固態(tài)SERS基底，還可以預(yù)先制備好圖案化的固態(tài)SERS基底，再在基底上構(gòu)建微流控通道。最典型方法是采用光刻法制備固態(tài)SERS基底，以Choo團隊設(shè)計的金陣列為例[87]，他們選用玻璃片為最底層，依次濺射鈦和金膜，再旋凃光刻膠，與傳統(tǒng)的掩模曝光不同的是他們采用的是UV定位曝光，顯影刻蝕后獲得特定圖案的金微陣列。用于SERS基底的理想納米制造技術(shù)需能夠產(chǎn)生尺寸只有幾十納米、同時間隔只有幾納米的金屬結(jié)構(gòu)，該方法獲得金微陣列的仍達不到該條件。一個芯片往往需要多種技術(shù)的結(jié)合才能完整的制備出來，芯片是基于軟光刻、金屬沉積后選擇性圖案化及氧等離子體處理制備而成[88]。在帶有微流控通道的PDMS板上熱蒸發(fā)一層薄銀膜，用膠帶將微流控通道外表面的銀膜簡單而有選擇地去除。氧等離子體處理同時使納米表面形成高強度SERS活性的納米尖端或納米點，并使PDMS與玻璃基板永久結(jié)合。Han等[89]采用激光刻劃法制備銀納米粒子(AgNPs)氧化石墨烯(GO)的SERS復(fù)合基底，通過編程直接形成圖案，再將其轉(zhuǎn)移至PDMS上，再與另一片PDMS封合制成芯片(圖5)。激光刻劃法屬于連續(xù)激光直寫法，采用的是780 nm聚焦近紅外激光器(200 mW)對DVD光盤進行劃刻。DVD可被編寫特定程序，并可用于大面積、快速和無掩模的GO還原(RGO)，只需20分鐘就可以完成整個DVD光盤的圖案制作。作為投入實際應(yīng)用的要求，這些技術(shù)應(yīng)該具有一些突出的特點，包括低成本的制造、大面積的圖案化及良好的重現(xiàn)性等。

Zhou等[90]開發(fā)了一種不同于上述兩種構(gòu)建微流控固態(tài)SERS基底的方案，他們是將制備好的線狀基底直接插入玻璃毛細管中。該線狀基底是一條電熱康銅絲，其表面覆蓋修飾有Ag納米顆粒(Ag-NP)的垂直排列的ZnO納米錐(ZnO-NT)。隨后，溫敏微凝膠、金納米棒膠體和分析物組成的混合物被填充到毛細管的剩余空間中，通過電路開合控制溫度，溫敏微凝膠遇熱收縮，使得待測物和Au納米棒相互接近，且更接近Ag-ZnO納米錐。該3D固態(tài)基底產(chǎn)生高密度的SERS“熱點”，并被應(yīng)用于湖水中甲基對硫磷的測定。

圖5 激光刻劃法制備AgNPs@RGO SERS微流控芯片。(a)AgNPs@RGO芯片制作過程示意圖；(b)紫外光照射下石墨烯片上Ag NPs的生長機理；(c)各種AgNPs@RGO SERS襯底的可編程圖案(標尺：500m)；(d)制備的AgNPs@RGO芯片的照片(標尺：1 cm)[89]

Fig 5 Fabrication of AgNPs@RGO SERS microfluidic chip by direct laser scribing. (a) Fabrication procedures; (b) growth mechanism of AgNPs on graphene sheets under UV irradiation; (c) various programmable patterning of AgNPs@RGO SERS substrates (scale bar: 500m); (d) the as-prepared AgNPs@RGO SERS microfluidic chip (scale bar: 1cm)[89]

3 生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

伴隨著微工藝加工技術(shù)的發(fā)展以及生物醫(yī)學(xué)研究對生物樣品組分分離分析的高精度需求，近十幾年來微流控技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[3]。微流控芯片最大的特征是微型化，從而具備樣品消耗少，分離分析速度快、通量高、液體流動可控、穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)勢。微流控芯片具有靈活的集成性，多個微腔室可同時實施不同的功能，如在一塊芯片上可以完成對細胞的培養(yǎng)、分選、識別和分析等一系列精準操作[91]。SERS在痕量檢測上具有超高靈敏度以及快速無損檢測的特點，同時固有的拉曼特征峰半峰寬窄，特異性強，易于區(qū)分。將SERS與微流控相結(jié)合，一方面在極少液態(tài)樣品的檢測上提高了SERS穩(wěn)定性和重復(fù)性，另一方面也拓展了微流控芯片的使用領(lǐng)域，特別是在生物分子的檢測、細胞分析、藥物篩選和開發(fā)、疾病診斷、環(huán)境健康及食品衛(wèi)生檢測等均已有相當出色的應(yīng)用。

圖6 電池控制的SERS微流控系統(tǒng)的示意圖和表征圖。(a)電池控制的SERS微流控系統(tǒng)；(b)康銅線電鍍ZnO納米錐SEM圖；除去部分ZnO納米錐后的康銅線SEM圖(c)和近觀圖(d)[90]

Figure 6 Schematic illustration of the battery-controlled SERS microfluidic system and characterizations. (a)The battery-controlled SERS microfluidic system; (b)a SEM image of the constantan wire electrodeposited with ZnO nanotapers(ZnO-NTs); (c) a SEM image and (d) a close-up view of ZnO-NTs covered constantan wire after partial ZnO-NTs being removed[90]

3.1 生物分子檢測

生物分子檢測技術(shù)的發(fā)展，有利于臨床及醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)的進步。SERS微流控系統(tǒng)具備無損、超靈敏檢測的優(yōu)勢，已成功地應(yīng)用于DNA、RNA以及蛋白質(zhì)等生物分子的檢測。

DNA分子需要一種快速、靈敏的檢測技術(shù)，在DNA微陣列芯片技術(shù)中，由于DNA的濃度很低，在檢測之前應(yīng)使用PCR技術(shù)對DNA樣品進行擴增，再用微陣列測定機將樣品固定在滑動玻璃上，最后用熒光或化學(xué)發(fā)光檢測方法對放大信號進行檢測。Park等[92]采用共焦表面增強拉曼光譜(SERS)技術(shù)，對PDMS微流控通道中染料標記的雙鏈DNA寡核苷酸進行了快速、高靈敏的檢測，檢測濃度可低至10-11M。與DNA微陣列芯片相比，這種方法既不需要固定的程序，也不需要PCR擴增。此外，相對于熒光或化學(xué)發(fā)光信號，每個染料標記的DNA的特征拉曼峰很容易分辨。準確、靈敏地識別腫瘤細胞DNA突變對腫瘤的診斷、預(yù)后及個體化治療至關(guān)重要，Huh等[93]將電動驅(qū)動的微流控裝置與SERS結(jié)合(圖7)，采用連接酶檢測反應(yīng)法(LDR)檢測人KRAS癌基因的點突變。在LDR中有兩個引物，上游引物含有SERS活性染料和識別目標DNA的3’端堿基，而下游引物連接著銀納米顆粒。當這兩個引物與模板DNA完全匹配的情況下，即連接在一起時，染料被帶到靠近納米粒子的地方，其特征拉曼峰可以被檢測到。電動驅(qū)動的微阱裝置將反應(yīng)產(chǎn)物濃縮在一個有限的體積中以增強光學(xué)信號，對目標DNA的檢測限低至20 pM。連接酶鏈式反應(yīng)也被用于SERS微流控系統(tǒng)中KRAS癌基因的點突變檢測[94]，在40分鐘內(nèi)區(qū)分癌細胞多種核酸中突變型和野生型KRAS基因。SERS微流控技術(shù)的結(jié)合使得DNA無標記檢測成為可能。核酸典型堿基的化學(xué)修飾在增加遺傳多樣性和編碼生物信息方面起著重要作用，Morla‐Folch等[95]應(yīng)用SERS結(jié)合化學(xué)計量學(xué)和微流控技術(shù)實現(xiàn)了對單鏈和雙鏈DNA中4種不同修飾的胞嘧啶的鑒別和相對定量。SERS檢測和微流控技術(shù)的結(jié)合消除了預(yù)擴增或富集步驟的需要，實現(xiàn)了對pg級DNA樣品進行超靈敏分析，這為DNA實時的自動篩選提供了一種簡單的低成本設(shè)備。為了克服微流控芯片中液體通過層流擴散導(dǎo)致檢測效率低、芯片重復(fù)利用的交叉污染等問題，Han等[89]介紹的激光刻劃方法制備的AgNPs@RGO生物芯片，作為一種可重復(fù)使用的SERS微流控傳感器進行DNA檢測。DNA和石墨烯之間的非共價相互作用介導(dǎo)了DNA序列的可控捕獲和釋放，從而有效地實現(xiàn)了芯片內(nèi)SERS檢測和生物芯片的再生。

圖7 (a)用于LDR反應(yīng)中目標DNA的SERS微流控電動驅(qū)動微阱裝置。從下往上依次為修飾有電極的Pyrex玻璃襯底、微阱陣列(直徑10m、高度8m)及功能化的PDMS金電極。通過極性來(b)吸引目標分子或(c)排斥非目標分子[93]

Fig 7 (a) A SERS microfluidic platform with an electroactive microwell for single nucleotide polymorphisms detection in LDR. From the bottom to the top: Pyrex glass substrates modified with electrodes, microwell arrays (10m in diameter, 8m in height) and functionalized PDMS gold electrode.. (b-c)Selective attraction and rejection achieved by controlling the polarity[93]

作為疾病標志物的微小RNA(miRNAs)的靈敏檢測可以促進疾病的診斷和治療。許多用于miRNAs定量檢測的方法如基于PCR的方法或雜交鏈式反應(yīng)[96]，需要復(fù)雜和耗時的程序，Wang等[97]設(shè)計了一種可觸發(fā)式相互放大信號(TMAS)探針，在微流控芯片中用SERS對miRNA進行一步定量檢測。相互放大信號的兩個TMAS探針是通過目標miRNA啟動的無酶靶鏈位移循環(huán)反應(yīng)產(chǎn)生的，從而產(chǎn)生增強的SERS信號(圖8)。另外采用交流電動流動技術(shù)的微流控芯片產(chǎn)生高效混合和快速富集，以提高DNA雜交率，進一步提高SERS信號強度。該方法可在30 min內(nèi)快速、靈敏地檢測人乳腺癌細胞中miRNA-21的含量，檢測限為2.33 fM。與傳統(tǒng)方法相比，該方法克服了操作復(fù)雜的缺點，具有靈敏度高、檢測時間短、樣品用量少等優(yōu)點。Prado等[98]將SERS液滴微流控用于無標記檢測寡核苷酸RNA。液滴微流控允許內(nèi)部流體再循環(huán)從而進行快速有效的混合，防止納米粒子堵塞通道，該條件下RNA拉曼信號的極大值在液滴的中心，且在液滴形成并混合后的一段特定的時間后測得，這為提高SERS信號的重復(fù)性提供了有效的手段。該初步實驗驗證了SERS液滴微流控無標記檢測純寡核苷酸RNA的可行性，對于混合物光譜重疊問題，他們將應(yīng)用原先開發(fā)的SERS光譜分解程序估計混合物中每種堿基的百分比。

圖8 基于信號相互放大機制的SERS微流控平臺測量miRNA-21的裝置圖[97]

Fig 8 The schematic diagram describing the use of mutual-signal amplification mechanism-based SERS-microfluidics platform for miR-21 detection[97]

SERS微流控系統(tǒng)因具備以下幾個優(yōu)勢而常被用于蛋白質(zhì)檢測：首先SERS檢測是在與生理條件相似的水環(huán)境中進行的，有助于維持蛋白質(zhì)的固有形態(tài)；SERS基底的高增強能力使激發(fā)激光功率盡可能低，測量時間盡可能短，大大減少了激光造成的損傷；微通道中的流動流體不僅有效地避免了樣品在激光斑點處的局部加熱，而且保持了測量條件的穩(wěn)定性和一致性；貴金屬納米材料周圍的配體可以防止蛋白質(zhì)與銀之間的直接化學(xué)相互作用，并減少對蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的影響。Lu等[44]基于以上條件設(shè)計了一種特殊的微流控通道(圖2c)，混合效率高且增強了分析物落入SERS熱點的幾率，對外周髓鞘蛋白PMP22蛋白的野生型和突變體G150D的第四跨膜(TM4)螺旋構(gòu)象隨環(huán)境pH變化差異進行了原位觀察和分析。Reza等[48]開發(fā)出一種用于同時檢測多個免疫檢查點標志物的SERS標記微流控芯片，利用表面功能化的氧化石墨烯(GO)即修飾有納米酵母單鏈抗體(NY-scFv)來捕獲目標蛋白。交流電動力(AC-EHD)驅(qū)動流體增強混合效率，從而提高NY-scFv與目標蛋白的結(jié)合，同時減少非特異性作用。Choi等[99]報道了一個完全集成化的SERS微液滴芯片，用于鼠疫菌F1抗原的自動免疫分析。該系統(tǒng)包括液滴產(chǎn)生、傳輸、混合、合并和分裂模塊，實現(xiàn)了快速、高效的免疫反應(yīng)及無需洗滌的免疫分析。基于SERS的微滴平臺檢測鼠疫菌F1抗原的檢測限為59.6 pg mL-1，比常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附試驗靈敏度高約2個數(shù)量級。為了實現(xiàn)特定蛋白質(zhì)或其他生物分子的分離和捕獲，往往需要在芯片上集成復(fù)雜的通道或微器件等，Xiong等[28]報道了一種磁性納米鏈集成的微流控芯片，該磁性納米鏈不僅作為納米級攪拌棒加速溶液混合，還可用作特定生物分離的捕獲劑，磁性納米鏈的引入簡化了微芯片的平面設(shè)計(圖9a)，芯片僅由平坦的通道組成(圖9b)。磁性納米鏈上的抗體捕獲和分離目標蛋白，再用SERS納米探針進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可同時用于檢測多種蛋白(圖9d)。另外芯片很容易被改進成多通道陣列(圖9c)，用于多樣本的平行分析，大大改善了分析動力學(xué)。該體系已經(jīng)實現(xiàn)了在8 min內(nèi)對1L體液中的癌蛋白和細菌進行超靈敏的鑒定和定量。

圖9 (a)磁性納米鏈集成的SERS微流控芯片的設(shè)計圖；芯片實物圖: (b)單通道和(c)多通道陣列，微通道中填充了紅色染料(標尺：0.5 cm)；(d)芯片用于檢測癌蛋白的原理圖[28]

Fig 9 (a)Schematic diagram of the magnetic nanochain integrated SERS microfluidic chip; photographs of the chip with (b) single channel and (c) multichannel arrays filled with a red dye(scale bar: 0.5?cm); (d) the mechanism for the detection of cancer proteins[28]

3.2 細胞分析

微流控SERS結(jié)合了微流控的微型高效自動化和SERS的高靈敏度等優(yōu)勢，在細胞分析領(lǐng)域有著許多重要的應(yīng)用，如細胞捕獲、分選、鑒定、定量分析、通信監(jiān)測以及藥物與細胞間相互作用檢測等。

為了穩(wěn)定地捕獲細胞并保持細胞的活性，我們課題組采用交流介電泳(AC-DEP)微流控芯片裝置，可以通過加電捕獲細胞(如圖10a所示)[45]。利用微流控SERS技術(shù)進行活細胞檢測，實現(xiàn)了雙氫青蒿素(DHA)對HeLa細胞作用和效果的定量分析與評估。實驗采用DHA調(diào)控細胞表面葉酸受體表達，通過在微流控芯片中測量細胞SERS信號，確定在不同劑量DHA下納米粒子分別進入正常細胞(293T)和HeLa細胞的數(shù)量，同時測量了不同藥物劑量下細胞的存活率。另外，我們課題組還設(shè)計了一種具有微阱的微流控芯片[100](圖10b-d)，實現(xiàn)了單個細胞的分離與捕獲，再進行SERS檢測以得到進入HeLa細胞內(nèi)的銀納米粒子數(shù)量，用MTT比色法測定細胞存活率，從而得到細胞毒性與進入細胞內(nèi)的銀納米粒子數(shù)量的定量關(guān)系，同時也建立了一種基于微流控SERS技術(shù)分析銀納米顆粒對細胞毒性作用的方法。

圖10 (a)交流介電泳微流控SERS系統(tǒng)裝置圖[45]；(b)SERS微流控裝置用于單細胞分析的裝置圖；(c) 通道中細胞流動及微阱捕獲的微觀圖；(d) 微阱捕獲單個細胞的過程[100]

Fig 10 (a)Schematic diagram of the microfluidic SERS platform based on AC-DEP for cell manipulation[45]; (b) the SERS microfluidic device for single-cell analysis; (c) microscopic image showing both the cells moving inside the microfluidic channel and the single cell trapped in the microfluidic well; (d) steps of trapping single cells in the micro-wells[100]

通過SERS微流控獲得細胞信號并對細胞進行區(qū)分和鑒別，往往需要結(jié)合一種或多種化學(xué)計量法。Pallaoro等[101]將流動聚焦微流控通道與拉曼光譜相結(jié)合，實現(xiàn)了一定程度上癌細胞與正常細胞比例的測定。他們合成了連有亞甲基藍或硫堇兩種拉曼活性分子的銀納米二聚體，用PVP包裹后進行多肽修飾，作為兩種生物拉曼探針(SBT)。NRP-SBT探針可靶向前列腺癌細胞上過度表達的神經(jīng)氈蛋白-1(NRP)，而作為對照的PC-SBT即可與正常細胞又與癌細胞作用。通過用SBT標記哺乳動物細胞并使其在流動聚焦的微流體通道中流動，可以通過激光拉曼快速地逐一檢測細胞，經(jīng)過簡單的數(shù)據(jù)處理即可得到NRP/PC。在所得數(shù)據(jù)中偶爾會出現(xiàn)偏差較大的不可信的值，這可能是由于某個癌細胞的大部分都和NRP-SBT相連了。他們組在另一篇文章[102]中基于同樣的方法，且結(jié)合了主成分分析和最小二乘法，用著兩種分析方法對所得大量的SERS信號進行數(shù)據(jù)處理，提高了檢測方法的可信度和可重復(fù)性，實現(xiàn)了在低濃度下對癌細胞和正常細胞的區(qū)分鑒別。Zhang Y等[103]將基于尺寸差分離細胞的微流控芯片與SERS光譜相結(jié)合，采得的多維譜圖再根據(jù)數(shù)據(jù)分析方法進行簡化，以實現(xiàn)細胞膜蛋白的原位分析以及循環(huán)腫瘤細胞(CTC)亞群的鑒定(圖11)。在微流控芯片中，基于CTC和血細胞之間的大小差異，微流體過濾器將CTC從血液中分離出來。而采用的SERS探針是連接有不同的DNA適配體的Au@Ag納米顆粒，以同時靶向細胞膜上不同的蛋白。為了簡化復(fù)雜的SERS指紋譜，采用修正的經(jīng)典最小二乘法以獲得單個細胞的表型信息。最后，使用偏最小二乘法判別分析來精確分類不同亞型的細胞?；谖⒘骺豐ERS系統(tǒng)，Cho等[104]為了實現(xiàn)更精準的鑒定，采用了五種拉曼活性分子對五種表面標記物進行編碼，增加了譜圖的維度和難度。對循環(huán)腫瘤干細胞(CCSC，一種稀有的CTC亞型細胞)和其他三種不同的CTC細胞進行了鑒定。Xu等[105]提出了一種將無標記SERS技術(shù)與軟管狀微流控技術(shù)相結(jié)合的動態(tài)SERS微流控檢測細胞的平臺。微流控芯片是由一個商業(yè)微軟管嵌入到3D打印的模板中形成的，以一小段石英毛細管作為SERS檢測區(qū)，銀納米星作為無標記的SERS基底。在樣品流動狀態(tài)下，對1株正常乳腺細胞系和2株乳腺癌細胞系的SERS光譜進行連續(xù)采集，最后采用K-最近鄰(K-NN)算法對三種類型的細胞進行精確分類。

圖11 基于尺寸差分離細胞的SERS微流控芯片用于CTCs的捕獲、細胞表型分析和分類的流程圖[103]

Fig 11 The flow diagram of operating on the platform for CTCs capture, profiling of cell phenotype, and classification based on the integrated system of size-based microfluidic cell isolation and multiple spectrally orthogonal SERS analysis[103]

微流控SERS分析細胞表達上具有重要應(yīng)用，Dey等[106]提出了一種微流控SERS平臺用于抗原特異性T細胞的分離和免疫表型分析。他們基于T細胞受體(TCR)和肽主要組織相容性復(fù)合物(pMHC)相互作用從復(fù)雜生物樣品中分離抗原特異性T細胞，使用交流電EHD增強pMHC和TCR相互作用的頻率，降低非特異性作用，再使用單點直流脈沖釋放T細胞以便后續(xù)的檢測。用SERS標記的pMHCs編碼T細胞，以分析T細胞TCR表達的異質(zhì)性，可以反映T細胞的活化狀態(tài)或患者對免疫治療的反應(yīng)。這種方法在監(jiān)測免疫狀態(tài)、理解治療應(yīng)答和有效的疫苗開發(fā)等方面具有潛在的應(yīng)用潛力。Willner等[107]使用微流控裝置將單個前列腺癌細胞和小麥胚芽凝集素功能化的SERS納米探針包裹在油包水液滴中，隨后將其鎖定在儲存液滴的陣列中，用于光譜檢測。通過快速檢測獲得粗糙譜圖，隨后針對有價值的癌細胞熱點區(qū)域進行分析，以研究細胞間和胞內(nèi)變異對細胞膜上聚糖表達的影響。

SERS微流控還被應(yīng)用于細胞分泌物的檢測，Sun等[108]提出將SERS微液滴芯片用于同時檢測單個細胞分泌的兩種細胞因子。他們利用抗原抗體特異性識別捕獲目標物，免疫夾心法使Ag NPs靠近磁性納米顆粒上的拉曼染料，觸發(fā)SERS信號。磁場作用誘導(dǎo)了Ag NPs的自發(fā)聚集，增強SERS信號。除此之外，單個液滴包裹的細胞因子隨著時間的推移積聚起來，進一步增強SERS信號。在單個液滴中檢測單個細胞的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和白細胞介素-8(IL-8)，檢出限低至1.0 fg mL-1。另外，他們應(yīng)用這種超靈敏的SERS微液滴芯片對單個液滴中多個細胞分泌的VEGF和IL-8進行了研究，結(jié)果表明，細胞與細胞間的相互作用可能通過VEGF和IL-8的上調(diào)促進癌細胞血管的生成。

3.3 疾病診斷

進一步，利用微流控SERS技術(shù)檢測與疾病相關(guān)的生物標志物，可顯著提高檢測的靈敏度和選擇性，減少了樣品體積，降低檢測時間，簡化診斷過程，為疾病的早期診斷提供了新的方法。例如，Su等[109]設(shè)計并制作了一種集血液分離和原位檢測為一體的SERS微流控芯片，用于臨床血樣血肌酐的快速檢測。該SERS微流控芯片所需血樣量少、可重復(fù)使用、操作方便且可回收利用，同時，在芯片上集成了多個微流控SERS單元，實現(xiàn)了對同一血液樣本的平行檢測或?qū)Σ煌簶颖镜亩嗦窓z測，為臨床腎病的快速診斷提供一種新的方法。Cheng等[27]設(shè)計了一種電驅(qū)動SERS微流控平臺(圖12)，用于長距離濃縮人血中的稀有病原體并進行快速檢測。利用交流電場誘導(dǎo)介電泳和電流體力學(xué)的混合電動機制，使細菌可以集中在SERS活性粗糙電極上的停滯區(qū)，而血細胞則被排除在同心圓電極中心區(qū)域之外。該方法在3分鐘內(nèi)實現(xiàn)了細菌的分離和濃縮，密度因子增加了約1000倍。此外，在分離的細菌血癥感染中發(fā)現(xiàn)的三種細菌，分別是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌，在不到一分鐘的時間內(nèi)就被成功地鑒定出來，無需任何抗體或化學(xué)固定和反應(yīng)過程。該方法的檢出限為50L樣品中的數(shù)百個細菌，約為103CFU mL-1。Lu等[110]制作的微液滴芯片可在3.5 h內(nèi)采集58株金黃色葡萄球菌的17400 個SERS譜圖，具備快速、高通量檢測性能，并且基于SERS的偏最小二乘回歸模型準確地測定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在含有甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌的混合物中的濃度。該研究體現(xiàn)了SERS微流控系統(tǒng)在細菌感染檢測和流行病學(xué)監(jiān)測的優(yōu)勢。

圖12 (a)實驗裝置圖：SEM圖像顯示了中心電極表面粗糙的Au，采用交流電場誘導(dǎo)介電泳和電流體力學(xué)方法快速濃縮人血中的細菌，通過濃縮后細菌的SERS指紋圖譜鑒定細菌；(b)在大范圍不對稱電極陣列上選擇性濃縮目標細菌的原理圖[27]

Fig 12 (a) Experimental setup of electrokinetic SERS microfluidic chip: the SEM image showing the roughened Au surface on the central electrode, AC electric field induced dielectrophoresis and electrohydrodynamics for rapid bacteria concentration from human blood, and SERS Raman spectroscopy of the concentrated bacteria for bacteria identification; (b) the mechanism of selective bacteria concentration over a wide range asymmetric electrode array[27]

SERS微流控芯片有望成為人體體液中生物標志物檢測的有力工具，對臨床診斷和人體健康評價具有指導(dǎo)意義。Wu等[111]采用SERS微液滴芯片對人血清和唾液中硫氰酸鹽(SCN-)進行了定量分析，SCN-是人體健康評價系統(tǒng)中的重要生物標志物之一。他們選用具有較大SERS增強因子的金銀核殼納米棒(Au@Ag NRs)捕獲體液中的SCN-，根據(jù)-C≡N伸縮振動產(chǎn)生的2100 cm-1拉曼峰強度進行定量。整個檢測過程只需幾分鐘，實際樣本只需幾微升，人血清中SCN-的檢測限為1M。此外，還可快速檢測人唾液中的SCN-，該結(jié)果與是否吸煙以及煙齡相關(guān)。當檢測的標志物為蛋白質(zhì)一類如癌胚抗原，可采用抗體修飾的SERS基底捕獲目標物，Li等[81]在此基礎(chǔ)上又引入了抗體修飾的磁性納米材料(圖3d)，通過磁場對捕獲的目標物進行聚焦，進一步增強信號，癌胚抗原的檢測限低至0.1 pM。癌癥標志物的快速、有效檢測有利于早期癌癥篩查，而同時檢測多種生物標志物對于提高癌癥診斷的準確性具有重要意義。Gao等[112]設(shè)計了一種全自動SERS液滴微流控平臺，用于同時檢測兩種前列腺癌標志物。以他們團隊之前設(shè)計的用于檢測鼠疫菌F1抗原的微液滴芯片為基礎(chǔ)，增加了一個并行微流控通道，是為了在同一塊芯片上同時進行兩路檢測。結(jié)果表明，在0.05 ～ 100 ng mL-1的范圍內(nèi)，兩種PSA標志物均有良好的線性響應(yīng)，檢出限均在0.1 ng mL-1以下。Gao等[113]近期還報道了一個無泵SERS液滴微流控平臺用于檢測人血清中PSA標志物，通過芯片底部的毛細通道驅(qū)動液體流動，檢測可在5 min內(nèi)完成，無需人工孵育和沉重的注射器泵。結(jié)果表明，該芯片在0.01 ～ 100 ng mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性響應(yīng)，檢出限在0.01 ng mL-1以下。

3.4 藥物檢測和篩選

SERS微流控芯片也為藥物檢測和篩選提供了一種快速、靈敏且高通量檢測分析的手段。SERS微流控芯片可用于治療藥物監(jiān)測，即分析治療性藥物在體液中的濃度以指導(dǎo)臨床藥物治療的方法。血液中的游離藥物是進行藥物作用的有效部分，更容易與受體結(jié)合或被代謝。Zhang等[114]采用SERS微液滴芯片方法檢測人血清中的一種抗癌藥物6-硫鳥嘌呤，該裝置在提高測定重復(fù)性方面具有優(yōu)勢，變異系數(shù)不超過5%(n=25)，檢測速度快，每次檢測僅需10s。Wu等[33]設(shè)計的多功能微流控芯片可監(jiān)測Hela細胞分泌物的動態(tài)變化以及Hela細胞對藥物的免疫響應(yīng)，從而用于藥物篩選。SERS微流控芯片也被嘗試用于體液中興奮劑的檢測，Gjergjizi等[115]設(shè)計了一種被動閥的微流控芯片，結(jié)合SERS以檢測人血清中的黃體生成素(LH)，極大地改善了傳統(tǒng)LH檢測方法耗時長、基質(zhì)效應(yīng)干擾等問題，不需要預(yù)制備、預(yù)富集和免疫催化反應(yīng)等步驟。抗體修飾磁性金納米粒子捕獲LH，與4-氨基噻吩(4-ATP)標記的金納米顆粒形成夾心免疫結(jié)構(gòu)，通過記錄4-ATP的SERS信號，可以探測血清中微量LH。Salemmilani等[78]報道了一種基于微流控介電泳誘導(dǎo)的SERS裝置，它能在2分鐘內(nèi)檢測唾液中冰毒的生理濃度，用主成分分析法(PCA)區(qū)分冰毒陽性樣品和陰性對照樣品。對唾液等體液中非法藥物的快速檢測，其在醫(yī)療保健和執(zhí)法方面具有很大的實用價值。Kong等[55]采用由多孔光子晶體生物二氧化硅作為微流體通道的材料，構(gòu)建了硅藻土微流控分析裝置。該芯片可用作色譜，從復(fù)雜的生物流體樣品中分離小分子，并對獲得的目標化學(xué)品進行SERS檢測。在與拉曼染料分子的混合樣品中芘的檢測限達到1 ppb，且該系統(tǒng)檢測人血漿中的可卡因的檢測限達到10 ppb。

3.5 環(huán)境健康與食品衛(wèi)生

此外，與人類健康相關(guān)，環(huán)境和食品中的污染物如重金屬、非法添加劑、濫用藥物及細菌病毒等對人類的健康和社會秩序帶來了嚴重威脅，SERS微流控系統(tǒng)也可用于檢測環(huán)境和食品痕量污染物，可實現(xiàn)實時、現(xiàn)場的快速檢測。近年來，人們也把SERS與微流控相結(jié)合應(yīng)用于環(huán)境和食品檢測方面[24]。例如，Wilson等[116]設(shè)計了具有被動混合階段的微流體管道，在微流體反應(yīng)器中原位合成膠體銀，隨后在管道中和分析物充分混合，進而檢測待測物。他們將該裝置用于檢測偽枝藻素(藍藻細菌的一種天然色素)，檢測限約10 pM。Bai等[117]在3D玻璃微流體通道中構(gòu)建2D Cu-Au金屬納米點陣，實現(xiàn)超高靈敏度的SERS檢測，可以實時檢測水樣中濃度低至10 ppb的Cd2+。Wang[118]利用SERS分子探針通過一步反應(yīng)實現(xiàn)目標細菌的檢測，采用兩種SERS分子免疫探針同時識別病原體不同的表位。為了降低方法的檢測限并實現(xiàn)現(xiàn)場檢測，他們設(shè)計了一種納米DEP微流體裝置，用來富集水樣中低濃度病原體，使得該方法的檢測限達到了100CFU mL-1，遠遠低于DEP常用細菌濃度(>106CFU mL-1)，因此可用于檢測飲用水中的病原體。Galarreta等[119]在玻璃蓋玻片表面通過電子束光刻金屬納米結(jié)構(gòu)，并將其嵌入PDMS的微流體通道中，作為SERS平臺，并用該系統(tǒng)對赭曲霉素A進行了定性檢測。Kim等[120]在微流控芯片內(nèi)通過納米壓印光刻法構(gòu)建納米柱陣列，將其作為SERS基底，結(jié)合便攜式拉曼光譜儀可現(xiàn)場檢測牛奶中的三聚氰胺。Dou等[121]用裸露的金納米顆粒負載于微流控紙芯片上，選擇性地增強豬毛發(fā)提取物中的β-受體激動劑的SERS信號，檢測限可達ng mL-1級別。整個裝置材料十分簡易且便宜，也無需化學(xué)標記、純化和分離，操作簡單，有利于現(xiàn)場的及時檢測和分析。Gao等[122]在微液滴芯片上實時生長銀納米顆粒，同時與另一個含有敵草快二溴化物(DQ)的液滴相混合，再進行SERS檢測。使用這種可生成間斷且流動的液滴的裝置，其目的是避免因銀納米顆粒聚集在管壁上造成的記憶效應(yīng),該系統(tǒng)對水樣中DQ的檢測限達到了5 nM。

4 總結(jié)與展望

近年來，SERS與微流控技術(shù)相結(jié)合在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境衛(wèi)生、食品健康等領(lǐng)域得到了大量的實驗應(yīng)用和深入研究。但是，為了實現(xiàn)SERS微流控系統(tǒng)實用化和商業(yè)化的目標，微流控SERS技術(shù)還需要克服一些困難。目前，多數(shù)微流控SERS仍存在信號重復(fù)性低和被分析物污染的問題。盡管對微流控通道中連續(xù)流過的樣品進行快速檢測和平均化可提高SERS信號的重現(xiàn)性，但是金屬膠體的布朗運動可引起的樣品的隨機聚集，仍然會引起SERS信號的不穩(wěn)定。另外為了使金屬膠體和分析物充分混合，需要設(shè)計復(fù)雜的微通道，這又可能會交叉污染和通道堵塞，也會帶來記憶效應(yīng)。這些缺陷阻礙了SERS微流控系統(tǒng)的實際應(yīng)用。當前，研究者分別從微流控芯片和SERS兩部分的設(shè)計上入手，尋找解決以上問題的方案。首先，要獲得可靠的且重復(fù)性好的SERS信號，其關(guān)鍵還在于提高SERS活性基底的質(zhì)量。另一方面，微流控系統(tǒng)可通過對膠體的可逆操控實現(xiàn)其在微流控通道中的可控聚集，從而提高SERS信號的的重現(xiàn)性。其次，關(guān)于芯片易被污染堵塞等問題，隨著芯片制作材料、制作技術(shù)及加工手段等的進步，可以設(shè)計出成本極低的紙基芯片作為一次性芯片使用，或在通道中固定固體金屬納米陣列材料，從而避免因混合造成的交叉污染和通道堵塞，以及利用非連續(xù)流微液滴芯片來降低通道中的記憶效應(yīng)。除此以外，為了提高SERS微流控芯片的檢測性能如檢測通量、靈敏度等，還可以設(shè)計可同時檢測多個樣品的微陣列芯片，以提高芯片的分析效率和通量。另外，利用SERS芯片的流體操控可以增強對分析樣品的操縱和捕獲能力，或應(yīng)繼續(xù)研發(fā)新型的SERS活性基底以提高樣品的檢測靈敏度。對于復(fù)雜樣品，目標分析物與其它混合物的拉曼光譜可能有嚴重重疊，這時就需對目標物進行分離、富集等預(yù)處理，也可以通過改進芯片結(jié)構(gòu)或功能來實現(xiàn)，例如，可通過各種微器件如微泵、微閥、微通道等相互配合達到樣品預(yù)處理的功能。最后，對于多樣品多參數(shù)問題、數(shù)據(jù)量大的情況，后期需要采用化學(xué)計量學(xué)方法、結(jié)合大數(shù)據(jù)和智能計算等方式，以此對數(shù)據(jù)結(jié)果進行準確分析?？傊覀兿嘈?，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展，SERS與微流控技術(shù)兩者可以更好地結(jié)合在一起，將在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。