南岳茶油腐乳中乳酸菌的分離鑒定

李建周，肖堯婷，莫婷婷，羅佳茜，李汝芹，李悅桐，陳曉華※

(1.衡陽(yáng)師范學(xué)院南岳學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421008；2.衡陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421008；3.衡陽(yáng)師范學(xué)院 南岳山區(qū)生物資源保護(hù)與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421008)

南岳茶油腐乳是一類利用毛霉、酵母和細(xì)菌共同作用改變豆腐中蛋白質(zhì)風(fēng)味的發(fā)酵豆制品，其發(fā)酵過(guò)程通常為天然發(fā)酵，腐乳中繁殖的乳酸菌從環(huán)境中偶然混入起作用。因此豆腐乳是分離和篩選優(yōu)良乳酸菌的的豐富資源。從某種特定食品中分離篩選出的乳酸菌，可以制作成該食品進(jìn)行乳酸發(fā)酵的發(fā)酵劑，而且是其發(fā)酵的最佳菌種選擇，因?yàn)樗鼈儽葟钠渌牧现泻Y選出的乳酸菌具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力[1]。目前動(dòng)物性乳酸菌比植物性乳酸菌應(yīng)用更廣泛，但實(shí)際上植物性乳酸菌在人體腸道中的存活率更高、生長(zhǎng)能力更強(qiáng)，在耐鹽和膽鹽性質(zhì)上優(yōu)于動(dòng)物性乳酸菌。對(duì)于中國(guó)人的體質(zhì)，植物性乳酸菌不會(huì)造成機(jī)體的異體蛋白質(zhì)排斥反應(yīng)。從豆腐乳中分離篩選乳酸菌就能體現(xiàn)植物性乳酸菌的優(yōu)勢(shì)。

豆腐乳中乳酸菌的種類豐富，曹翠峰[2]在腐乳的微生物種類研究中表明豆腐乳的制作過(guò)程中不僅有生產(chǎn)用微生物毛霉，還檢測(cè)出乳酸菌、腸道菌、真菌如酵母等微生物菌群。魯緋[3]等在青方腐乳中篩選出了奇異菌屬、片球菌屬和乳桿菌屬三個(gè)菌屬的乳酸菌。南曉芳[4]等從市面上購(gòu)買的不同廠家的腐乳中篩選出堅(jiān)強(qiáng)腸球菌和糞腸球菌。鄧加聰[5]從豆腐乳中篩選出10株乳桿菌屬，其中有一株具有廣譜抑菌活性。王夫杰[6]等從青方和白方腐乳中篩選出鼠李糖乳桿菌、清酒乳桿菌、干酪乳桿菌和植物乳桿菌四種乳酸菌。豆腐乳發(fā)酵前、后期都有種類豐富的乳酸菌的存在，腐乳的特殊發(fā)酵環(huán)境，賦予了乳酸菌不同于泡菜等傳統(tǒng)乳酸菌來(lái)源開發(fā)的菌株的性質(zhì)，國(guó)內(nèi)對(duì)豆腐乳中乳酸菌的性質(zhì)做了研究，篩選出許多性質(zhì)優(yōu)良、有開發(fā)潛力的菌株，也給我們提供了寶貴的參考價(jià)值。鄧加聰[5]等從豆腐乳中篩選具有廣譜抑菌活性乳酸菌，采用溶鈣圈方法、產(chǎn)酸試驗(yàn)、形態(tài)學(xué)分析及生理特性判斷是否為乳酸菌屬；使用平板透明圈法對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行分析來(lái)研究抑菌活性，從而篩選出具有廣譜抑菌活性的乳酸菌。魯緋[3]在青方腐乳中篩選出一株短小奇異菌、一株植物乳桿菌、一株表觀形態(tài)類似于片球菌的菌株，并且把這三株菌應(yīng)用到豆腐乳的發(fā)酵生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)片球菌對(duì)腐乳風(fēng)味的協(xié)同作用最好，明顯改善了腐乳的風(fēng)味、改變了游離氨基酸的含量。王夫杰[6]從白方和青方腐乳中篩選出的四株乳桿菌均能耐受10%的鹽度和5%的酒精度，其中有一株甚至能在10%的鹽度和6%的酒精度下生長(zhǎng)旺盛。鑒于此，本研究以南岳茶油腐乳為研究對(duì)象，從其篩選分離益生乳酸菌并利用16S rDNA技術(shù)對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定，為今后提高腐乳風(fēng)味，改善腐乳品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原料：衡陽(yáng)南岳豆腐乳。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，牛肉膏10 g，檸檬酸銨2 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，葡萄糖20 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，吐溫80 1mL，蒸餾水1 L，培養(yǎng)基pH控制在6.2-6.4，滅菌鍋設(shè)置參數(shù)121℃，20 min[7]。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入瓊脂條2%[8]。

溶鈣圈法培養(yǎng)基：在MRS固體培養(yǎng)基中加入碳酸鈣2%[9]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選實(shí)驗(yàn)流程

豆腐乳樣品的取樣→梯度稀釋→平板涂布培養(yǎng)（溶鈣圈法）→形狀分析→革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶鑒定→平板劃線培養(yǎng)→甘油保藏。

1.2.2 乳酸菌的分離

根據(jù)Pringsulaka[10]等采用的溶鈣圈法并做修改：取1 g腐乳塊于9.0 mL無(wú)菌水中，通過(guò)玻璃珠震蕩均勻，制成腐乳懸液，再進(jìn)行梯度稀釋，并依次采用澆注平板法置于含有碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基，37℃靜止培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)基中單菌落外圍出現(xiàn)透明溶鈣圈，且單菌落形狀為圓形或橢圓形，顏色為白色或乳白色，標(biāo)記此類菌落，初步確定為乳酸菌，進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.2.3 菌株生理性質(zhì)研究

1.2.3.1 最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定

菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接取1%的菌懸液到MRS液體培養(yǎng)基中，分別置于15℃、20℃、30℃、37℃和42℃下靜止培養(yǎng)24 h，用分光光度儀測(cè)定菌液在600 nm吸收波長(zhǎng)處的OD值[11]。

1.2.3.2 最適生長(zhǎng)PH值的測(cè)定

菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將菌懸液離心，轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，時(shí)間10 min。棄上清液，菌體用無(wú)菌生理鹽水離心洗滌2-3次，并制成菌懸液。接取1%的菌懸液到特定pH值的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，pH分別為2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0，培養(yǎng)溫度為37℃，時(shí)間24 h，測(cè)定600 nm吸收波長(zhǎng)處的OD值[12]。

1.2.3.3 最適接種量的測(cè)定

菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接取不同接種量的菌懸液至MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量分別為0.5、1、1.5、2、5、10%，培養(yǎng)溫度為37℃，時(shí)間24 h，用分光光度儀測(cè)定菌液在600 nm吸收波長(zhǎng)處的OD值[13]。

1.2.3.4 耐鹽性的測(cè)定

菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接取1%的菌懸液至不同鹽濃度的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，鹽濃度分別為0、3、5、7、9、11、13%，培養(yǎng)溫度為37℃，時(shí)間24 h，用分光光度儀測(cè)定菌液在600 nm吸收波長(zhǎng)處的OD值[14]。

1.2.3.5 耐膽鹽性的測(cè)定

菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種1%的菌懸液至不同膽鹽濃度的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，膽鹽濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.35、0.4和0.45%。膽鹽類型為牛膽汁粉（膽鹽三號(hào)），培養(yǎng)溫度為37℃，時(shí)間24 h，用分光光度儀測(cè)定菌液在600 nm吸收波長(zhǎng)處的OD值[15]。

1.2.3.6 產(chǎn)酸能力的測(cè)定

菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接取5%的菌懸液至MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，通過(guò)每隔6 h測(cè)定72 h內(nèi)各菌株的pH值、總酸隨發(fā)酵時(shí)間的變化，得到產(chǎn)酸能力強(qiáng)、發(fā)酵性能高的優(yōu)良菌株。菌液中總酸（以乳酸計(jì)）測(cè)定：用0.1 mol/L的NaOH溶液進(jìn)行測(cè)定，然后換算成乳酸度，以0T表示。采用NaOH滴定法測(cè)定[16]。

式中N指NaOH的濃度，V1指所用NaOH的體積，V2指滴定菌液體積。

1.2.3.7 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，接取2%的菌懸液至MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37%，每培養(yǎng)2 h用分光光度儀測(cè)定菌液在600 nm吸收波長(zhǎng)處的OD值，然后根據(jù)菌株OD值繪制生長(zhǎng)曲線[17]。

1.2.4 菌株的鑒定

1.2.4.1 初步鑒定

按照凌代文[18]的《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》中介紹的方法，將所有革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性的分離菌株初步鑒定為乳酸菌。

1.2.4.2 細(xì)菌16SrDNA生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物57F:5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和205R:5'-CTTGTTACGACTTCACCC-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增后送樣檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果在NCBI上用Blast進(jìn)行同源檢索，利用MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019和Origin Pro 2019b進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)觀察

溶鈣圈法可用來(lái)初步鑒定乳酸菌，從初步鑒定的38菌株中挑選透明圈直徑與菌落直徑比值較大的6株菌株進(jìn)行菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)觀察，結(jié)果見表1。

表1 菌株的形態(tài)特征

RSP1-RSP6菌株在MRS固體培養(yǎng)基上平板劃線后生長(zhǎng)旺盛，在37℃厭氧的環(huán)境下培養(yǎng)48h，形成白色菌落，形態(tài)分別如圖1所示；6株菌均為球菌，長(zhǎng)×寬為0.569~0.601μm×0.564~0.589μm，均不產(chǎn)生色素。

圖1 RSP1-RSP6菌落形態(tài)

對(duì)6株菌進(jìn)行革蘭氏染色，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察形態(tài)，結(jié)果如圖2所示，它們均為革蘭氏陽(yáng)性菌，球狀，成對(duì)或四聯(lián)排列。過(guò)氧化氫酶鑒定結(jié)果為陰性，可以初步鑒定為片球菌屬或者氣球菌屬[19]。

圖2 RSP1-RSP6細(xì)胞形態(tài)（×1000）

2.2 菌株生理特性研究

2.2.1 菌株最適生長(zhǎng)溫度

不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株的生長(zhǎng)影響見圖3，RSP1~RSP6 6株菌在溫度為20~42℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，在15℃左右不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)能力差，而在37℃時(shí)進(jìn)入生長(zhǎng)高峰期，40℃之后生長(zhǎng)明顯受限。6株菌的最適生長(zhǎng)溫度均在30~37℃之間。研究表明乳酸菌最適生長(zhǎng)溫度為30~40℃，20℃以下一般不生長(zhǎng)。

圖3 不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

尚天翠[20]對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)情況受溫度的影響做了研究，其最適生長(zhǎng)溫度為38℃，在30~42℃之間生長(zhǎng)良好。由此可見RSP1~RSP6菌株所需的生長(zhǎng)溫度在正常值范圍。

2.2.2 菌株最適生長(zhǎng)p H值

不同pH值對(duì)6株乳酸菌生長(zhǎng)的影響見圖4。RSP4、RSP5和RSP6適合生長(zhǎng)的pH值范圍較廣，在4.0~7.0范圍內(nèi)都能很好地生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)pH值為6.0左右，pH值低于4.0時(shí)生長(zhǎng)受到明顯抑制。而RSP1、RSP2和RSP3的pH值生長(zhǎng)范圍為5.0~7.0，RSP2的最適生長(zhǎng)pH為5.5，RSP1和RSP3株菌的最適生長(zhǎng)pH值為6.5左右，pH值低于5.0時(shí)生長(zhǎng)受到明顯抑制，在pH值為4.0時(shí)幾乎不生長(zhǎng)。乳酸菌一般最適生長(zhǎng)pH為5.5~6.0之間，耐酸性較強(qiáng)，比其他細(xì)菌更能在酸性環(huán)境下生長(zhǎng)。從各類泡菜中篩選的乳酸菌最適pH值范圍為3.0~7.0，而豆腐乳周圍環(huán)境酸度比泡菜低，所篩乳酸菌耐受酸度的能力較弱，能在pH=4.0下生長(zhǎng)的RSP5等菌株耐酸性比普遍豆腐乳中篩選的菌株強(qiáng)，但是比泡菜中篩選的乳酸菌弱。趙立彬[21]等從四川泡菜中篩選的耐酸性較好的LL-1、LL-4、ZZ-2能耐受pH=2.5的環(huán)境。而楊曉宇[22]從禽畜體內(nèi)分離出來(lái)的乳酸菌的LS、LJ2能耐受pH=2.0的酸性環(huán)境。研究表明片球菌屬在pH=5.0時(shí)能夠生長(zhǎng)，氣球菌屬的耐酸能力明顯弱于片球菌，在pH=5.0的環(huán)境下不能生長(zhǎng)[23]。由此本實(shí)驗(yàn)篩選的6株菌初步確定為片球菌。

圖4 不同p H對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.2.3 菌株最適接種量

圖5 不同接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

不同接種量對(duì)6株菌生長(zhǎng)的影響見圖5，由圖可見接種量對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)情況影響不明顯。而在接種量為0.5~10%的范圍內(nèi)，6株菌的生長(zhǎng)隨著接種量的增大反而降低，RSP4和RSP5最適接種量為1.7%左右，RSP1、RSP3和RSP6最適接種量在1.5%左右，RSP2最適接種量為1.0%左右?？偟膩?lái)說(shuō)，6株菌的最適接種量在0.5~1.5%之間。乳酸菌篩選的活化、性質(zhì)研究過(guò)程普遍所用接種量為1.0%，也有部分針對(duì)活性較弱的菌株，使用2.0%的接種量，則RSP1~RSP6的接種量對(duì)菌株的影響在正常范圍。

2.2.4 菌株耐受NaCl的能力

豆腐乳中NaCl濃度較高，6株菌均在豆腐乳中分離得到表明它們均有較強(qiáng)的的耐鹽能力。球菌的耐鹽能力普遍大于桿菌。6株乳酸菌耐受NaCl的能力見表2，RSP1、RSP2和RSP3這3株菌明顯比RSP4、RSP5和RSP6 3株菌的耐鹽能力差。RSP1、RSP2和RSP3能夠在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%的環(huán)境下幾乎不生長(zhǎng)。而RSP4、RSP5和RSP6這3株菌能夠在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%的環(huán)境下幾乎不生長(zhǎng)。相對(duì)而言，RSP5的耐鹽性最好，在NaCl濃度為7~9%的范圍內(nèi)生長(zhǎng)旺盛。從泡菜等酸性發(fā)酵食品中篩選的乳酸菌普遍最高只能在NaCl濃度為8%的條件下生長(zhǎng)，如胡書芳[24]等從自然發(fā)酵酸菜中篩選的乳酸菌19株中，耐鹽性最好的菌株也只能在鹽濃度為8%時(shí)生長(zhǎng)，而其他多數(shù)菌株只能耐受4%的鹽濃度。由此可見，RSP1-RSP6這6株菌的耐鹽能力均高于泡菜等酸性食品中篩選的乳酸菌。南曉芳[4]等對(duì)豆豉和腐乳中的乳酸菌進(jìn)行了耐鹽能力的研究，篩選出三株耐鹽能力達(dá)到12%的乳酸菌，其中1株為糞腸球菌，另外2株為堅(jiān)強(qiáng)腸球菌。比較可知本研究篩選的乳酸菌比同源乳酸菌的耐鹽能力弱。針對(duì)目前乳酸菌的分類，凌代文[18]在乳酸細(xì)菌分類鑒定和分析方法的研究中表示耐鹽度在10%以上的乳酸菌主要分為片球菌和四聯(lián)球菌這兩個(gè)屬。但是四聯(lián)球菌的耐鹽能力更強(qiáng)，其能耐受18%以上的鹽度，這種性質(zhì)與片球菌極為相似。

表2 菌株的NaCl耐受力

2.2.5 菌株耐受膽鹽的能力

乳酸菌作為益生菌，要在人體內(nèi)發(fā)生作用必須能夠耐受胃酸和膽鹽的損害，人體小腸的膽鹽濃度一般在0.03~0.3%，可以在細(xì)胞外產(chǎn)生高滲透壓，對(duì)菌體細(xì)胞造成影響。RSP1和RSP2這兩株菌在膽鹽濃度為0.20%時(shí)可以生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)活力弱。RSP3-RSP6在膽鹽濃度為0.20%時(shí)生長(zhǎng)良好，膽鹽濃度為0.35%時(shí)還可以生長(zhǎng)，從表3可以看出，RSP6菌株耐受膽鹽的能力最強(qiáng)。6株菌均能夠在膽鹽濃度為0.20%時(shí)生長(zhǎng)，甚至可以超過(guò)0.35%，可見其在腸道的膽鹽作用下也能正常生長(zhǎng)繁殖，在小腸內(nèi)起作用。趙立彬[21]對(duì)不同來(lái)源的乳酸菌進(jìn)行耐膽鹽分析，結(jié)果表示挑選的乳酸菌在人體小腸的膽鹽濃度范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，從四川泡菜、東北泡菜和其自制泡菜中篩選的10株菌株均能耐受膽鹽濃度為0.3%的環(huán)境。

表3 表3菌株的膽鹽耐受力（△OD600）

2.2.6 菌株的產(chǎn)酸能力

6株乳酸菌的產(chǎn)酸能力研究見圖6。6株菌的產(chǎn)酸速度基本一致，RSP3的產(chǎn)酸速度最快，在16 h時(shí)pH值最低為4.3左右，而其他5株菌在20 h時(shí)才慢慢達(dá)到最低值。6株菌在26 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期且總保持較低值狀態(tài)，均在4.0左右。謝靜[25]等從臘魚中篩選的乳酸菌的產(chǎn)酸能力強(qiáng)，其中乳酸片球菌在培養(yǎng)20 h時(shí)pH=3.5，戊糖片球菌在培養(yǎng)20 h時(shí)pH=3?？梢姳緦?shí)驗(yàn)篩選的性質(zhì)類似片球菌的6株菌的產(chǎn)酸能力在正常范圍之內(nèi)。

圖6 6株乳酸菌發(fā)酵p H變化曲線

圖7 6株乳酸菌發(fā)酵期間產(chǎn)酸情況

圖7可知，RSP2、RSP3和RSP5這3株菌在16 h達(dá)到產(chǎn)酸峰值；RSP4和RSP6這2株菌在12 h時(shí)達(dá)到產(chǎn)酸峰值；RSP6在16 h時(shí)總酸達(dá)到2.1%左右，酸度最高?？傮w而言，RSP4和RSP6產(chǎn)酸速度最快，所有菌株產(chǎn)酸峰值均在1.50%以上，且在24 h后酸值穩(wěn)定，均在1.30%以上。從泡菜中篩選的菌株產(chǎn)酸量在1.0~1.5左右，陳曉平[26]等從酸菜汁中分離出9株乳酸菌，產(chǎn)酸量最低為1.2%，最高為2.6%。對(duì)比可知，本研究6株菌的產(chǎn)酸能力均在平均水平以上，RSP6產(chǎn)酸水平最高。

2.2.7 菌株的生長(zhǎng)曲線

6株乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)曲線見圖8，6株菌均在培養(yǎng)4 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)24 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。RSP1、RSP3兩株菌的生長(zhǎng)活性相對(duì)較弱，生長(zhǎng)較慢。RSP2、RSP4和RSP5生長(zhǎng)較快，活性較強(qiáng)，RSP6生長(zhǎng)速度最快，生長(zhǎng)周期與其他5株菌相比最短。

圖8 6株菌的生長(zhǎng)曲線圖

2.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

將RSP5和RSP6菌株進(jìn)行16SrDNA測(cè)序，將所獲得的序列與GenBank和Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)中已有細(xì)菌的16SrDNA序列進(jìn)行相似性比較分析，最后選擇同源性較高的序列，利用MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖9可知，RSP5、RSP6與戊糖片球菌親緣最近，鑒定為戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）。

圖9 系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論

本研究通過(guò)溶鈣圈法，從自然發(fā)酵的南岳豆腐乳中篩選出RSP1~RSP6 6株乳酸菌，初步鑒定為革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧球菌，并對(duì)這6株菌的生理性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明RSP5和RSP6這兩株菌在6株菌性質(zhì)最為優(yōu)良，可以在pH=4.0、鹽度為11%、膽鹽濃度為0.35%時(shí)存活，RSP5的耐酸、耐鹽能力最強(qiáng)；RSP6的耐膽鹽、產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，生長(zhǎng)活性最強(qiáng)、生長(zhǎng)周期最短。將RSP5和RSP6菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)RSP5、RSP6與戊糖片球菌親緣最近，鑒定為戊糖片球菌。

致謝：

感謝湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（NYD201810）項(xiàng)目對(duì)本項(xiàng)目的支持。