黑老虎果皮中總黃酮提取工藝研究

賀靈芝，李俊華，梁忠厚

(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)藥技術(shù)學(xué)院，湖南 衡陽 421005；2.衡陽師范學(xué)院，功能金屬有機(jī)化合物湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421008)

黑老虎(Kadsura coccinea)為五味子科南五味子屬多年生常綠攀援藤本，廣泛分布于湖南、貴州、福建、云南等地[1]。黑老虎是一種開發(fā)潛力較高的食藥兩用型野生水果，其含有豐富的氨基酸、礦物質(zhì)元素和多酚類物質(zhì)[2]。黑老虎的根莖俗稱大血藤，是一種藥用價(jià)值較高的中藥材[3]。根莖中的活性成分如多酚類、木質(zhì)素類、萜類及揮發(fā)油等具有抗氧化、抗炎抑菌、抗腫瘤、保肝、抗HIV、抗凝血和調(diào)節(jié)血脂等重要作用[4-5]。目前，對(duì)于黑老虎根莖的化學(xué)成分、藥理作用及揮發(fā)油成分等研究較多，而如何從黑老虎果皮中提取有效藥用成分還少見報(bào)道。

黑老虎果皮中主要有效藥用成分為黃酮類化合物、多糖及多糖苷類、酯類、三萜類和微量元素等[6-7]，而黃酮類是天然活性成分檢測(cè)的重要指標(biāo)。近年來，黃酮類化合物的提取多采用超臨界流體萃取法[8]、溶劑法[9]和超聲波法[10]。其中，超聲波提取法具有時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、溶劑用量少和效率高等明顯優(yōu)勢(shì)而被廣泛使用[11]。仿生態(tài)黑老虎接近野生黑老虎生長(zhǎng)環(huán)境，研究它對(duì)維護(hù)生態(tài)可持續(xù)發(fā)展具有更大的意義[12]，所以本文采用超聲波提取法提取仿生態(tài)黑老虎果皮中總黃酮，主要從提取時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度、料液比四個(gè)因素優(yōu)化黑老虎果皮總黃酮提取工藝，并比較仿生態(tài)與組培黑老虎總黃酮含量區(qū)別，為總黃酮的提取及其藥用價(jià)值的研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

組培黑老虎果實(shí)產(chǎn)自福建龍巖市武平縣齊仙布福娜種植專業(yè)合作社，仿生態(tài)黑老虎果實(shí)產(chǎn)自湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院林下種植基地，取11月組培黑老虎果實(shí)和仿生態(tài)黑老虎果實(shí)新鮮果皮去果肉，洗凈低溫烘干至恒重。

1.2 儀器與試劑

YB-1000A型多功能藥物粉碎機(jī)(永康市速鋒工貿(mào)有限公司)，KQ-100B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司)，TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，A124型萬分之一電子分析天平(湖南軒彩科學(xué)儀器有限公司)。

無水乙醇、無水硝酸鋁(AR)、氫氧化鈉(AR)、亞硝酸鈉(AR)、三氯乙酸(AR)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98%)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品100 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇70 mL，置超聲儀中超聲溶解、冷卻，加甲醇至定容刻度線，搖勻。準(zhǔn)確吸取10 mL上述溶液置100 mL量瓶中，加水至刻度線、搖勻即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/mL)。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確量取對(duì)照品溶液(0.1 mg/mL)0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，各加30%乙醇使成5.0 mL，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻后放置10分鐘。再分別加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置10分鐘。最后再分別加l mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，充分搖勻后放置30分鐘。用紫外可見分光光度計(jì)在400~800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定510 nm為其最大吸收波長(zhǎng)。選擇在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，蘆丁溶液濃度(X，mg/mL)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，得到回歸方程式為：Y=5.5831X+0.0079，(R2＝0.999 7)。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 樣品溶液的制備及其含量的測(cè)定

準(zhǔn)確移取3.0 mL黑老虎果皮黃酮提取濾液于10 mL容量瓶中，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制備相同的操作步驟測(cè)定樣品的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可得黑老虎果皮總黃酮濃度X，按下列公式計(jì)算總黃酮含量。

式中：X—每次測(cè)出的吸光度對(duì)應(yīng)的黑老虎果皮中黃酮的濃度，M—黑老虎果皮粉末質(zhì)量，C—容量系數(shù)，其值為Vm*Vo/Vn，Vm為定容體積，Vo為原液體積，Vn為從原液中移取的原液體積。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取在120℃減壓干燥至恒重的5 g黑老虎果皮，在其他因素一定的情況下，分別以不同提取溫度(40，45，50，55，60，65，70℃)、提取時(shí)間(20，25，30，35，40，45，50 min)、乙醇濃度(40，50，60，70，80，90%)、超聲功率(100，120，140，160，180，200 W)和料液比(1:5，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30 g/mL)進(jìn)行超聲提取，趁熱抽濾得濾液，測(cè)定黑老虎果皮中總黃酮提取率。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)因素與水平表設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)、料液比(D)為自變量，以黑老虎果皮中總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化黑老虎果皮總黃酮提取工藝參數(shù)，正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對(duì)黑老虎果皮中總黃酮提取率的影響

圖2 提取溫度對(duì)提取率的影響

按超聲提取時(shí)間40 min，乙醇濃度60%，料液比1:20，超聲功率100 W于不同的提取溫度下提取黑老虎果皮中總黃酮。如圖2所示，在50~60℃之間，提取率隨著溫度的升高而增加，當(dāng)溫度為60℃時(shí)提取率最高，隨后下降。說明隨著提取的溫度升高，分子之間運(yùn)動(dòng)激烈，有利于總黃酮隨著有機(jī)溶劑滲出；而當(dāng)溫度過高時(shí)，黑老虎果皮總黃酮溶出量減少。出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因是，首先高溫下乙醇溶液蒸發(fā)得更快，乙醇濃度過高不利于黃酮滲出；另外溫度過高時(shí)會(huì)破壞黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率下降。因此，黑老虎果皮中總黃酮的提取溫度最好控制在60℃。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)對(duì)黑老虎果皮中總黃酮提取率的影響

按超聲提取溫度60℃，乙醇濃度60%，料液比1:20，超聲功率100 W于不同的提取時(shí)間下提取黑老虎果皮中總黃酮。如圖3所示，黑老虎果皮中總黃酮的提取率隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，提取率在35 min時(shí)達(dá)到最大值5.69%，隨后時(shí)間延長(zhǎng)提取率逐漸下降，提取率在45 min之后逐漸變得平穩(wěn)?？赡茉蚴翘崛r(shí)間較短時(shí)，黑老虎果皮中總黃酮并沒有完全提取，所以時(shí)間增長(zhǎng)提取率增大；然而加熱時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)可能破壞黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致黑老虎果皮中總黃酮提取率下降[13-14]，因此黑老虎果皮中總黃酮的超聲提取時(shí)間最好控制在35 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.1.3 乙醇濃度對(duì)對(duì)黑老虎果皮中總黃酮提取率的影響

按超聲提取溫度60℃，提取時(shí)間35 min，料液比1:20，超聲功率100 W于不同的乙醇濃度下提取黑老虎果皮中總黃酮。如圖4所示，在乙醇濃度為40~80%，黑老虎果皮中總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高而逐漸增大，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)黑老虎果皮中總黃酮提取率達(dá)到最大值6.98%，隨后提取率增加緩慢。根據(jù)“相似相溶”原理，黑老虎葉總黃酮的極性與80%乙醇極性相似，所以在乙醇濃度為80%時(shí)提取率最大；乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)提取液中所含色素較多，會(huì)干擾測(cè)定。因此黑老虎果皮中總黃酮的超聲提取乙醇濃度以70~90%之間為宜。

圖4 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

2.1.4 料液比對(duì)對(duì)黑老虎果皮中總黃酮提取率的影響

按超聲提取溫度60℃，提取時(shí)間35 min，乙醇濃度80%，超聲功率100 W于不同的料液比下提取黑老虎果皮中總黃酮。如圖5所示，在料液比為1:5~1:20之間，黑老虎果皮中總黃酮提取率隨乙醇量增加而不斷增大，在料液比為1:20時(shí)，黑老虎果皮中總黃酮提取率達(dá)到最大5.97%。然后隨著料液比的增大呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。原因可能為乙醇量增加可增大黃酮類物質(zhì)與溶劑的接觸面，故總黃酮提取率會(huì)增大；但當(dāng)乙醇達(dá)到一定量后，物料與溶劑量的比例達(dá)到飽和狀態(tài)，此時(shí)再增加溶劑的量對(duì)提取率影響不大，反而會(huì)使細(xì)胞內(nèi)外濃度差降低使提取率下降。因此，黑老虎果皮中總黃酮的超聲提取料液比應(yīng)控制在1:15~1:25之間為宜。

圖5 料液比對(duì)提取率的影響

2.1.5 超聲功率對(duì)對(duì)黑老虎果皮中總黃酮提取率的影響

按超聲提取溫度60℃，提取時(shí)間35 min，乙醇濃度80%，料液比為1:20時(shí)于不同的超聲功率下提取黑老虎果皮中總黃酮。如圖6所示，超聲功率在100~180 W時(shí)，黑老虎果皮中總黃酮提取率緩慢增大，提取率在超聲功率為180 W時(shí)達(dá)到最大6.75%，超過180 W后，提取率迅速下降。一般而言，超聲波可以最大限度的破壞黑老虎果的細(xì)胞壁使其內(nèi)含物釋放出來，樣品中的黃酮會(huì)隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)而越來越多地逸散出來；但超聲波功率過強(qiáng)會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和部分黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞中非黃酮的物質(zhì)也不斷溶出使有效成分的含量減少，導(dǎo)致在總黃酮含量測(cè)定時(shí)吸光度下降，提取率變小[14]。因此，黑老虎果皮中總黃酮的超聲為功率180 W時(shí)最優(yōu)。

圖6 超聲功率對(duì)提取率的影響

2.2 黑老虎果皮中總黃酮提取工藝優(yōu)化結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2正交試驗(yàn)結(jié)果可知，各因素影響黑老虎果皮中總黃酮提取的主次順序?yàn)椋禾崛囟龋玖弦罕龋疽掖紳舛龋咎崛r(shí)間，提取最優(yōu)組合為A2B1C2D3，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，黑老虎果皮中總黃酮提取最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)方案為：提取溫度為60℃，料液比1:25，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，提取時(shí)間35 min，提取功率為180 W，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案下，重復(fù)超聲提取6次取平均值，得黑老虎果皮中總黃酮提取率可達(dá)到6.69%。

2.3 與仿生態(tài)黑老虎果皮比較

稱取組培、仿生態(tài)黑老虎新鮮果皮，洗凈低溫烘干至恒重，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下提取總黃酮物質(zhì)，比較結(jié)果如表3。從表中可見，仿生態(tài)黑老虎總黃酮提取率高于組培黑老虎果皮?？赡茉蚴欠律鷳B(tài)老黑虎的成長(zhǎng)環(huán)境與組培黑老虎的成長(zhǎng)環(huán)境不同，仿生態(tài)黑老虎在施用過生物炭的土壤中模仿野生生態(tài)環(huán)境生長(zhǎng)[12-13]，使得仿生態(tài)黑老虎中黃酮類化合物的種類和含量都較組培黑老虎積累得更多。所以，仿生態(tài)黑老虎果皮總黃酮提取率高于組培黑老虎果皮總黃酮提取率。

表3 組培種植和仿生態(tài)種植黑老虎比較

3 結(jié)論

本研究以湖南、福建珍惜資源黑老虎果實(shí)為研究對(duì)象，以乙醇為提取溶劑，采用超聲波輔助提取工藝，通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)提取工藝條件為：提取溫度60℃、提取時(shí)間35 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、料液比1:25、超聲功率180 W，在此條件下黑老虎果皮總黃酮提取率可達(dá)6.69%。通過對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)仿生態(tài)黑老虎果皮總黃酮提取率高于組培黑老虎果皮總黃酮提取率，其藥用價(jià)值更高。