β3受體自身抗體降低心衰大鼠的缺血/再灌注損傷

(山西省心血管病醫(yī)院，山西 太原 030024)

隨著急性心肌梗死溶栓治療、經(jīng)皮冠脈血管介入治療、冠狀動脈旁路移植術等方法的建立和推廣，顯著提高了冠心病的救治成功率，但同時心衰人群越來越多，發(fā)生再次心梗的風險增加，因此心臟遭遇二次打擊越來越受到人們的廣泛關注[1]。心衰患者心肌經(jīng)歷缺血/再灌注損傷時其并發(fā)癥的發(fā)生率和病死率均顯著高于心功能正常者。慢性心衰患者機體處于一個新的代謝狀態(tài)，對缺血/再灌注損傷等刺激的反應不同于左室功能正常者。研究報道，心臟特異性高表達β3AR的小鼠模型中，病理染色并沒有發(fā)現(xiàn)肥大增生的心肌細胞，也沒有心肌纖維化等改變[2]。Wang J等[3]研究表明抗β3AR抗體(β3AA)在壓力后負荷的心衰模型中，具有一定的心臟保護作用，但心衰后再經(jīng)歷缺血/再灌注損傷時，β3AA的作用未見報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 由山西醫(yī)科大學動物中心提供的健康雄性Wistar大鼠70只，8～10周齡重量為200～220 g。

1.1.2 試劑 大鼠β3AR細胞外第二環(huán)氨基酸序列(中國醫(yī)學科學院上海生物化學院)；完全氟氏佐劑、不完全氟氏佐劑、小牛血清白蛋白組份V、TTC 2,3,5-氯化三苯基四氮唑、Evan’s blue、吐溫20(均購自Sigma)；辣根過氧化物酶標記的鏈酶親和素、生物素化山羊抗大鼠二抗、原位細胞死亡檢測試劑盒(均購自北京中杉金橋生物技術有限公司)；GlueB型活化辣根過氧化物酶(濟南泰天和生物科技有限公司)；親和柱試劑盒HiTrap Protein G HP column，MAbTrap Kit(Amersham)；Caspase-3底物Ac-DEVD-pNA(美國Biomol公司)。

1.1.3 儀器 MS2000生物信號記錄分析系統(tǒng)(成都泰能公司)；HX-200動物呼吸機(成都太盟科技有限公司)；超低溫冰箱(美國Forma公司)；6-0號無創(chuàng)帶針縫合線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司)；石蠟切片機(Leica)；96孔酶標板(丹麥Nunc公司)；SpectraMax M2/M2e酶標儀(Molecular Devices Corp，CA, USA)。

1.2 方法

1.2.1 β3AA的制備 選用Wistar大鼠20只，β3AA處理組給予皮下注射人工合成抗原肽段進行免疫，首次免疫時采用背部皮下多點注射，抗原肽段劑量為0.4μg/kg，使用完全佐劑混合，2周后用不完全佐劑與抗體肽段混合加強免疫，以后每隔兩周使用不完全佐劑與抗體肽段混合加強免疫1次，共免疫8周。采用改良的ELISA方法檢測免疫鼠血清中β3AA水平。利用IgG親和純化試劑盒(Mab．Trap Kit)純化抗β3AA陽性的免疫大鼠血清中的IgG，嚴格按照試劑盒說明書操作進行。

1.2.2 大鼠壓力后負荷型心衰模型制備 采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g體重)大鼠，在劍突下沿正中線打開腹腔，在左右腎動脈之間分離腹主動脈，將7號針頭粗的探針與腹主動脈一并結扎，然后抽出探針，腹腔注射慶大霉素抗感染，分層關腹。

1.2.3 β3AA鼠尾靜脈給予心衰大鼠 采用尾靜脈注射法將β3AA給予心衰大鼠體內，劑量為2μg/g，每10 d注射1次，共注射5次；對照組以相同的方法給予β3AA陰性的IgG。

1.2.4 缺血/再灌注手術 將大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g體重)麻醉，連接心電監(jiān)護，行氣管切開、呼吸機機械通氣，設置通氣量7～8 mL，呼吸頻率為60次/min；開胸暴露心臟，打開心包，將6～0無創(chuàng)縫合線帶針穿過左前降支下方，系一活結，觀察心電圖Ⅱ導聯(lián)ST-T抬高，松開結扎線，觀察抬高的ST-T下降1/2以上。前降支結扎時間為30 min，再灌注時間3 h；假手術組操作相同，但不結扎前降支。

1.2.5 心梗面積測定 再灌注結束后，麻醉大鼠，連接呼吸機，打開胸腔，再次結扎前降支，從股靜脈注入2% Evan′s 藍染料 2 mL，待大鼠四肢末梢皮膚及口唇藍染后，迅速摘除心臟， -70 ℃凍存。取出凍存心臟，自心底向心尖沿橫切面將心臟平均切成厚約2 mm的環(huán)形薄片，置于TTC染液中，避光孵育15 min，采用10%甲醇固定24～48 h。

1.2.6 Caspase 3 活性測定、原位末端標記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)測定心肌細胞凋亡 利用Capase3 活性測定試劑盒進行檢測，嚴格按說明書操作。利用原位細胞死亡檢測試劑盒檢測。每張切片隨機選取10個視野，計數(shù)視野內凋亡陽性細胞和所有心肌細胞，以凋亡指數(shù)反應心肌細胞凋亡的情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 β3AA可以改善心衰大鼠經(jīng)歷缺血/再灌注手術后的生存情況

心衰后再經(jīng)受缺血/再灌注打擊，極易引發(fā)急性心衰且生存情況不容樂觀。而β3AA經(jīng)鼠尾靜脈給予心衰大鼠后，經(jīng)歷缺血/再灌注手術的生存情況明顯改善，平均存活時間為155 min，死亡率50%，而給予對照組(給予β3AA陰性的IgG組)平均存時間為21 min，死亡率為87.5%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖 1。

圖1 β3AA被動免疫心衰大鼠經(jīng)歷缺血/再灌注(I/R)損傷后，生存率明顯改善

注：Sham：腹主動脈縮窄術后大鼠+偽I/R手術組；AB+β3AA+I/R：β3AA被動免疫腹主動脈縮窄術后大鼠+I/R組；AB+IgG+I/R：免疫球蛋白被動免疫腹主動脈縮窄術后大鼠+I/R組

2.2 β3AA使心衰大鼠經(jīng)歷缺血/再灌注損傷后心梗面積減小

心肌梗塞面積是反映心肌損傷情況的經(jīng)典指標。β3AA經(jīng)鼠尾靜脈給予心衰大鼠后，再經(jīng)歷心肌缺血/再灌注時，與對照組比較可明顯降低心肌梗死面積，差異有統(tǒng)計學意義(48.81±6.45%vs60.25±2.52%，P<0.05，圖2)。提示，β3AA處理的心衰大鼠經(jīng)歷缺血/再灌注后心肌損傷減輕。

圖2 β3AA被動免疫心衰大鼠后，經(jīng)歷缺血/再灌注引發(fā)的心梗面積減小

注：Sham：腹主動脈縮窄術后大鼠+偽I/R手術組；AB+β3AA+I/R：β3AA被動免疫腹主動脈縮窄術后大鼠+I/R組；AB+IgG+I/R：免疫球蛋白被動免疫腹主動脈縮窄術后大鼠+I/R組；AAR/LV%：危險區(qū)面積占左心室面積的百分比；AN/AAR%：心肌梗塞面積占危險區(qū)面積的百分比；*P<0.05 vs sham；#P<0.05 vs AB+IgG+I/R

2.3 β3AA可以使心衰大鼠經(jīng)歷缺血/再灌注手術后心肌細胞凋亡減少

TUNEL染色結果及Caspase-3活性檢測結果均顯示，與對照組相比，β3AA處理的心衰大鼠危險區(qū)心肌組織凋亡指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義(24.33±1.82%vs31.24±1.31%,P<0.05, 圖 3A)，心肌組織caspase-3活性降低，差異有統(tǒng)計學意義(1 485±89.39vs1 941±150.0，P<0.05，圖3B)。偽手術組凋亡指數(shù)為1.32±0.18%，心肌組織TUNEL染色幾乎沒有陽性的凋亡核。

圖3 β3AA被動免疫心衰大鼠后，經(jīng)歷缺血/再灌注引發(fā)的心肌細胞凋亡減少

注：A：TUNEL測定結果，B：Caspase3 活性測定；Sham：腹主動脈縮窄術后大鼠+偽I/R手術組；AB+β3AA+I/R：β3AA被動免疫腹主動脈縮窄術后大鼠+I/R組；AB+IgG+I/R：免疫球蛋白被動免疫腹主動脈縮窄術后大鼠+I/R組；*P<0.05vs.Sham；#P<0.05vs.AB+IgG+I/R

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)β3AA處理的心衰大鼠，經(jīng)歷心肌缺血/再灌注時，生存情況明顯改善，可能是通過減少心肌細胞凋亡而減小心肌梗死面積，提示β3AA對心衰后的缺血/再灌注損傷具有一定的保護作用。

慢性心力衰竭急性失代償是心血管疾病死亡的主要原因，且是心衰患者反復住院的直接原因[4]。多數(shù)慢性心力衰竭急性失代償發(fā)作的誘因是心肌相當或絕對缺血[5]。因此，本研究探索了經(jīng)鼠尾靜脈直接給予β3AA對心衰大鼠經(jīng)受心肌缺血/再灌注損傷的作用。研究發(fā)現(xiàn)，β3AA處理后，心衰大鼠經(jīng)受缺血/再灌注損傷后的生存情況明顯改善，生存時間明顯延長，且心肌損傷情況明顯改善，表現(xiàn)在心肌梗死面積減小，心肌細胞凋亡數(shù)量減少。缺血/再灌注后心肌細胞的死亡形式有多種，包括壞死、凋亡、自噬等，凋亡因其可調可控而廣受關注，通過多種手段以減少心肌細胞凋亡，降低心肌損害，本研究中采用Tunel以及Caspase3活性測定兩種方法檢測凋亡，均發(fā)現(xiàn)β3AA經(jīng)鼠尾靜脈給予心衰大鼠體內，作用約8周后可明顯缺血/再灌注損傷導致的心肌凋亡，進而減小心梗面積，發(fā)揮心臟保護作用。

β3AA是針對β3AR的特異性抗體，可能通過激活心肌細胞β3AR，進而激活一系列下游信號通路，其可能的機制包括：a)心衰時，心肌細胞表面β3AR較非心衰時表達升高2～3倍，β3AA特異激活β3AR，通過其下游信號轉導抑制L2型Ca2+通道，使細胞Ca2+內流減少，內質網(wǎng)等細胞器釋放Ca2+，減輕了鈣超載，發(fā)揮心肌保護作用[6]。b)其次β3AR做為G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員，與Gi 蛋白相互結合, 從而激活一氧化氮合酶，主要是eNOS，從而使一氧化氮產(chǎn)生增加，發(fā)揮擴張血管、改善心臟舒張的作用，增加心臟舒張貯備，改善舒張期冠脈血流，發(fā)揮心肌保護作用[7]。c)β3AR不僅存在于心肌細胞中，在血管內皮細胞中也有表達，β3AA特異性激活血管內皮細胞β3AR后發(fā)揮擴張血管作用，降低了外周阻力，減輕了心臟后負荷，改善心功能[8]。

總之，β3AA被動免疫可以減輕心衰大鼠的缺血/再灌注損傷，然而β3AA發(fā)揮心臟保護作用的具體分子機制尚待進一步研究。