SHCBP1：乳腺癌治療候選靶點(diǎn)和潛在預(yù)后標(biāo)志物

趙詩(shī)哲，徐佳寶，毛金校

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬兒童醫(yī)院藥學(xué)部；兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心；兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地；兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市 400010；2.河南大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，河南 開封 475004)

乳腺癌是全球范圍內(nèi)最常見的腫瘤之一[1]，在女性腫瘤患者中，乳腺癌致死率排名第二[2]。如今，乳腺癌的治療包括局部手術(shù)、全身化療、精確放療、內(nèi)分泌治療、生物靶向制劑治療等手段，而生物標(biāo)志物可用于建立病人預(yù)后和預(yù)測(cè)的結(jié)果。因此，尋找更有效、靈敏的乳腺癌預(yù)后生物標(biāo)志物是乳腺癌研究的迫切需要[3]。過去的幾十年，新型治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和新型靶向藥物的開發(fā)已大大改變了抗乳腺癌戰(zhàn)場(chǎng)的局面[4-5]。

Src homology 2 domain containing(Shc)家族包含ShcA、ShcB，ShcC和ShcD4個(gè)亞基因家族[6]，SHC SH2-domain binding protein 1(SHCBP1)在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中首次被鑒定出來，目的是尋找適配蛋白ShcA新的結(jié)合伴侶[7]。因?yàn)镾HCBP1在T細(xì)胞活化時(shí)表達(dá)上調(diào)，所以它最初被命名為鼠活化淋巴細(xì)胞蛋白(mPAL)[7]。

SHCBP1可以通過其他途徑來影響多種惡性腫瘤如肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、滑膜肉瘤等的生長(zhǎng)[8-9]。有研究表明，SHCBP1在乳腺癌細(xì)胞中過度表達(dá)[10]。但目前對(duì)于SHCBP1的表達(dá)與預(yù)后作用方面的關(guān)系研究匱乏。利用多種常用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌臨床數(shù)據(jù)，評(píng)估分析了SHCBP1在不同亞型乳腺癌中的表達(dá)水平和潛在的臨床價(jià)值，以期為SHCBP1靶向治療的未來發(fā)展和乳腺癌的預(yù)后和預(yù)測(cè)提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 Oncomine分析

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)可公開訪問的在線癌癥表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)(www.oncomine.org)。在數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過查詢SHCBP1，通過選擇乳腺癌與正常組織進(jìn)行比較。在本次研究中，P值由studentt檢驗(yàn)產(chǎn)生，用于乳腺癌和正常組織中SHCBP1 mRNA水平的比較。有效倍數(shù)變化閾值定義為2，P值設(shè)置為0.01[11]。

1.2 bc-GenExMiner v4.2分析

bc-GenExMinerv4.2(bcgenex.centregauducheau.fr/BC-GEM/)在2019年1月進(jìn)行數(shù)據(jù)更新，是一種數(shù)據(jù)挖掘工具，包含36個(gè)已發(fā)表的注釋基因組數(shù)據(jù)[12-13]。根據(jù)臨床標(biāo)準(zhǔn)(如激素受體、淋巴結(jié)狀態(tài)等)，用三個(gè)模塊來呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)，使用表達(dá)模塊分析SHCBP1基因的臨床參數(shù)，如Scarff Bloom&Richardson分級(jí)(SBR)、諾丁漢預(yù)后指數(shù)(Nottingham Prognositc Index,NPI)、雌激素受體(ER)、孕酮受體(PR)、表皮生長(zhǎng)因子受體-2 (HER-2)、基底細(xì)胞樣(Basal-like)；使用預(yù)后模塊評(píng)估SHCBP1表達(dá)模塊與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)事件的相關(guān)性；使用相關(guān)模塊評(píng)估SHCBP1與CDC45的相關(guān)性。

1.3 Kaplan-Meier plotter分析

Kaplan-Meier plotter(www.kmplot.com)是一個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集的在線數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)來源于GEO,EGA和 TCGA三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)。使用Kaplan-Meier plotter評(píng)價(jià)無轉(zhuǎn)移生存期(R)和無復(fù)發(fā)生存率(RFS)，顯著性利用log-rankP值表示[14]。

1.4 STRING分析

STRING(http://string-db.org/)是一個(gè)可用于確定蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用的在線數(shù)據(jù)庫(kù)[15]。本文通過該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)SHCBP1進(jìn)行蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析，以發(fā)現(xiàn)可能與SHCBP1存在相互作用的蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果分析

2.1 與正常乳腺組織相比，SHCBP1在乳腺癌中顯著高表達(dá)

大量研究表明，SHCBP1在多種癌癥中高表達(dá)，如白血病、肝細(xì)胞癌等[8]。而Oncomine分析結(jié)果也證實(shí)了該表型(見圖1a)。與正常組織相比，SHCBP1在乳腺癌組織中高表達(dá)。在乳腺癌中，有6組數(shù)據(jù)顯示乳腺癌組織高表達(dá)SHCBP1，而僅有1組數(shù)據(jù)顯示正常組織內(nèi)SHCBP1高表達(dá)。癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)和Richardson研究表明，幾種類型的乳腺癌中SHCBP1轉(zhuǎn)錄水平均高于正常組織(見圖1b～1g)。

圖1 SHCBP1在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織Fig.1 The expression of SHCBP 1 in breast cancer tissue is significantly higher than that in normal tissue

注：(a)圖顯示了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的mRNA過度表達(dá)(紅色)或靶基因的下調(diào)表達(dá)(藍(lán)色)的數(shù)據(jù)集的數(shù)目。P值閾值為0.01。每個(gè)方框中的數(shù)字代表在這些分析和癌癥類型中達(dá)到閾值的分析數(shù)量。在每一項(xiàng)研究中，以所有基因中所測(cè)得的目標(biāo)基因的百分比來分析基因等級(jí)。分析結(jié)果顏色由方框內(nèi)分析的最佳基因等級(jí)百分位數(shù)決定。(b-g)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(b-f)，(g)中SHCBP1 mRNA表達(dá)的比較。利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)比較SHCBP1在正常組織和乳腺癌組織中的表達(dá)得出箱式圖。P值設(shè)為0.01，有效倍數(shù)變化閾值定義為2。

表1 SHCBP1 mRNA表達(dá)與乳腺癌臨床特征參數(shù)的關(guān)系Table 1 Relationship between SHCBP1 mRNA expression and clinical characteristic parameters of breast cancer

注：“-”：無顯著差別；“↑”：轉(zhuǎn)錄水平增高；“↓”：轉(zhuǎn)錄水平下降；No:每組所含的樣本數(shù)目。

2.2 SHCBP1在不同分子亞型的乳腺癌患者中的表達(dá)不同

如表1所示，使用bc-GenExminer v4.2進(jìn)行Welch試驗(yàn)，根據(jù)不同的臨床病理特征，比較各組患者SHCBP1的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，≤51歲組與>51歲組間無顯著性差異(P=0.975)。淋巴結(jié)陽性(Nodal status+)的乳腺癌患者中SHCBP1 mRNA水平與淋巴結(jié)陰性者(Nodal status-)相比無顯著差異(P=0.053)。ER(+)(P=0.000)、PR(+)(P=0.000)與SHCBP1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān) (見表1)。相反，與HER2(-)患者相比，SHCBP1 mRNA水平在HER2(+)患者中表達(dá)較高(P=0.000)(見表1)。組間比較還表明，在三陰性乳腺癌(TNBC)中，SHCBP1 mRNA表達(dá)顯著高于非TNBC(P=0.000) ，而在Basal-like亞型中SHCBP1 mRNA表達(dá)顯著高于其他亞型(P=0.000)(見表1)。在分子亞型分析中，SHCBP1在HER-2亞型和Basal-like亞型中的表達(dá)明顯高于乳腺癌的Luminal A亞型和luminal B亞型(Dunnett-Tukey-Kramer’s test，P=0.000)(見圖2a)。而在諾丁漢預(yù)后指數(shù)(NPI) 分析中，NPI水平越高，SHCBP1的mRNA表達(dá)越高(P=0.000)(見圖2b)。在Scarff Bloom&Richardson分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(SBR)中，SBR分級(jí)越高，SHCBP1 mRNA水平越高(P=0.000)(見圖2c)。

圖2 SHCBP1在不同分子亞型乳腺癌患者中的表達(dá)Fig. 2 SHCBP1 expression in breast cancer patients with different molecular subtypes

2.3 SHCBP1的表達(dá)與乳腺癌患者的無轉(zhuǎn)移生存期(DMFS)預(yù)測(cè)

SHCBP1的表達(dá)增高可以預(yù)測(cè)乳腺癌患者的無轉(zhuǎn)移生存期(DMFS)較短，尤其是Luminal A亞型的乳腺癌患者中評(píng)估了SHCBP1對(duì)乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)后價(jià)值。Kaplan-Meier plotter分析表明，在乳腺癌患者中，SHCBP1 mRNA的高表達(dá)與DMFS的縮短有關(guān)(HR=1.85,P=0.000)(見圖3a)，尤其是在Luminal A亞型乳腺癌患者中(HR=1.96,P=0.000)(見圖3b)時(shí)。然而，在Luminal B亞型乳腺癌患者(HR= 1.06,P=0.75) (見圖3c)，HER-2(+)亞型乳腺癌患者(HR=1.28,P=0.44) (見圖3d)或Basal-like亞型乳腺癌患者(HR=0.9,P=0.69) (見圖3e)中，SHCBP1 mRNA的高表達(dá)或低表達(dá)與DMFS的縮短無顯著差異。

圖3 高表達(dá)SHCBP1的乳腺癌患者具有較短的DMFS，尤其是Luminal A亞型乳腺癌患者Fig.3 Breast cancer patients with high SHCBP1 >expression have shorter DMFS,especially those with Luminal A subtype breast cancer

Kaplan-Meier plotter分析表明:所有類型乳腺癌患者SHCBP1 mRNA的表達(dá)與DMFS相關(guān);Luminal A亞型乳腺癌患者1 mRNA表達(dá)與DMFS相關(guān);SHCBP1 mRNA表達(dá)與Luminal B亞型乳腺癌患者的DMFS沒有相關(guān)性;SHCBP1 mRNA表達(dá)與HER-2亞型乳腺癌患者的DMFS沒有相關(guān)性;SHCBP1 mRNA表達(dá)與Basal-like亞型乳腺癌患者的DMFS沒有相關(guān)性。

2.4 SHCBP1表達(dá)高的Luminal A亞型乳腺癌患者具有較短的無病生存期(DFS)

為進(jìn)一步探究SHCBP1在不同亞型乳腺癌中的預(yù)后情況，對(duì)GSE41994數(shù)據(jù)集[16]中的Luminal A亞型病人臨床數(shù)據(jù)展開分析，發(fā)現(xiàn)SHCBP1高表達(dá)的乳腺癌患者具有較差的DFS(HR=2.93,P=0.002)(見圖4a)，而在Luminal B亞型中，SHCBP1的表達(dá)與DFS的長(zhǎng)短無關(guān)(HR=1.32,P=0.786)(見圖4b)。由于HER-2(+)亞型，Basal-like亞型乳腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)樣本數(shù)量不足，因此無法分析SHCBP1的表達(dá)對(duì)這兩類亞型的乳腺癌DFS的影響。

圖4 高表達(dá)SHCBP1的Luminal A亞型乳腺癌患者具有較短的無病生存期(DFS)Fig.4 Patients with Luminal A subtype of breast cancer with high expression of SHCBP1 have a short DF

2.5 SHCBP1的表達(dá)升高可表現(xiàn)出更短的無復(fù)發(fā)生存率(RFS)

SHCBP1的表達(dá)升高可表現(xiàn)出更短的無復(fù)發(fā)生存率(RFS),尤其是在ER(+)、PR(+)、僅接受輔助化療,和僅接受輔助化療治療的ER(+)與接受包括或排除內(nèi)分泌治療乳腺癌患者中，且SHCBP1的高表達(dá)與較高的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。所有的乳腺癌患者的SHCBP1 mRNA高表達(dá)與RFS縮短顯著相關(guān)(HR=1.76,P=0.000)(見圖5a)，特別是在ER(+)亞型(HR=1.52,P=0.000)(見圖5b)和PR(+)亞型(HR=1.74,P=0.002)(見圖5c)的乳腺癌患者中。值得注意的是，對(duì)接受不同治療的乳腺癌患者，SHCBP1 mRNA的高表達(dá)與僅接受輔助化療的患者的RFS縮短顯著相關(guān)(HR=2.15,P=0.000)(見圖5d)。在ER(+)亞型中具有顯著相關(guān)性(HR=2.13,P=0.003)(見圖5e)，而在ER(-)亞型中無顯著相關(guān)性(HR=1.3,P=0.23)(數(shù)據(jù)未展示)。這些結(jié)果表明SHCBP1對(duì)乳腺癌耐藥性起關(guān)鍵的作用，可能與ER的表達(dá)有關(guān)。在接受內(nèi)分泌治療(HR=1.4,P=0.007)(見圖5f)或無內(nèi)分泌治療(HR=1.74,P=0.000)(見圖5g)的乳腺癌患者中，SHCBP1 mRNA的高表達(dá)與RFS的縮短顯著相關(guān)。在僅接受他莫昔芬治療的乳腺癌患者中，這種相關(guān)性并不顯著(HR=1.23,P=0.16)(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖5 Kaplan-Meier plotter分析表明SHCBP高表達(dá)的乳腺癌患者生存率低Fig.5 Low survival rate of breast cancer patients with high SHCBP1 expression indicated by Kaplan-Meier plotter

2.6 SHCBP1和CDC45 mRNA之間呈正相關(guān)

Oncomine分析SHCBP1的共表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)CDC45與SHCBP1顯著正相關(guān)(見圖6a)。研究發(fā)現(xiàn)，人類腫瘤來源細(xì)胞的CDC45蛋白水平始終較高，CDC45的表達(dá)與增殖細(xì)胞群密切相關(guān)[17]。利用bc-GenExMiner v4.2數(shù)據(jù)挖掘，證實(shí)了SHCBP1和CDC45 mRNA之間的確實(shí)存在正相關(guān)性(見圖6b)。

2.7 SHCBP1蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

僅僅通過共表達(dá)分析并不能完全揭示出SHCBP1作用于乳腺癌的機(jī)制。因此，通過STRING對(duì)SHCBP1進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，獲得了潛在的與SHCBP1作用的10個(gè)蛋白質(zhì)：KIF23、NCAPG、CCNA2、CDCA8、KIF20A、RACGAP1、CDK1、SHC1、BUB1B、TPX2。除SHC1外，其余蛋白質(zhì)均與細(xì)胞分裂密切相關(guān)。根據(jù)STRING分析，KIF23與SHCBP1具有最強(qiáng)的相互作用關(guān)系(Score=0.958)(見圖7)。

圖6 SHCBP1和CDC45的表達(dá)呈正相關(guān)Fig.6 Positive correlated of the expression of SHCBP1 and CDC45

圖7 SHCBP1的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Protein-protein interaction netaork of SHCBP1

3 討 論

Shc基因家族在哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡和耐藥性調(diào)控中具有重要作用[18]，SHCBP1是ShcA的結(jié)合伴侶基因。一個(gè)好的藥物靶點(diǎn)應(yīng)該具有高度特異性和對(duì)正常細(xì)胞毒性小的特點(diǎn)。通過慢病毒介導(dǎo)SHCBP1基因的敲除實(shí)驗(yàn)，Western blot檢測(cè)顯示，sgRNA感染乳腺癌細(xì)胞中SHCBP1蛋白表達(dá)明顯降低，sgRNA慢病毒敲除SHCBP1顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7的增殖，表明SHCBP1可能成為乳腺癌治療的有效靶點(diǎn)[10]。

根據(jù)圖2a所示， Luminal B亞型乳腺癌患者中SHCBP1 mRNA高表達(dá)，但Kaplan-Meier plotter及GSE41994數(shù)據(jù)集分析表明SHCBP1 mRNA表達(dá)與Luminal B亞型乳腺癌患者的DMFS,DFS沒有相關(guān)性，這里存在兩種可能：(1)SHCBP1在Luminal B亞型患者總體表達(dá)水平較高所以不能作為L(zhǎng)uminal B亞型的預(yù)后標(biāo)志物；(2) Luminal B亞型本身預(yù)后較差，因其低預(yù)后使得DMFS按SHCBP1區(qū)分不明顯。根據(jù)臨床研究，Luminal B亞型較Luminal A亞型具有更差的預(yù)后，但這是由于Luminal B型乳腺癌具有更多的不良預(yù)后因素，在腫瘤分期、組織分級(jí)及腫瘤大小等基線特征基本一致的情況下，Luminal A亞型與Luminal B亞型乳腺癌對(duì)預(yù)后的影響沒有差異[19]，Luminal B亞型并不能作為獨(dú)立的預(yù)后因素。因此，SHCBP1是由于在Luminal B亞型患者總體表達(dá)水平較高所以不能作為L(zhǎng)uminal B亞型的預(yù)后標(biāo)志物。

通過分析多種公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)與其他輔助因素協(xié)同作用導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)。這樣的規(guī)律在臨床對(duì)乳腺癌的診治中具有極大的價(jià)值。在確定患者的腫瘤亞型后，可以通過此規(guī)律來大致推測(cè)患者的預(yù)后。如患者的腫瘤是ER(-)或PR(-)亞型，就需要醫(yī)護(hù)人員更頻繁的平時(shí)監(jiān)護(hù)以及術(shù)后監(jiān)護(hù)，更密切地觀察患者情況，一旦出現(xiàn)預(yù)后不良的征兆，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并處理，以提升患者的存活率，延長(zhǎng)存活時(shí)間。而在對(duì)各種亞型的乳腺癌患者的預(yù)后分析中，如果為L(zhǎng)uminal A亞型，SHCBP1 mRNA高表達(dá)與DMFS(HR=1.96,P=0.000),DFS(HR=2.93,P=0.002)的縮短有關(guān)。所以對(duì)于結(jié)束住院治療的乳腺癌患者，應(yīng)定期復(fù)查，檢驗(yàn)醫(yī)師可通過SHCBP1的表達(dá)量來推斷Luminal A亞型乳腺癌患者的預(yù)后情況，這對(duì)于改善乳腺癌患者的預(yù)后有很大的價(jià)值。

通過共表達(dá)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中，SHCBP1可能與CDC45信號(hào)通路密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)CDC45在DNA復(fù)制的起始和延長(zhǎng)過程中起關(guān)鍵作用[20-21]，而CDC45在長(zhǎng)期靜止或衰老的細(xì)胞中沉默，但在不同組織來源的人癌細(xì)胞株中過度表達(dá)[17]。這提示SHCBP1可能通過調(diào)控CDC45表達(dá)來參與腫瘤的遷移和侵襲，但此前從未有過文獻(xiàn)表明CDC45與乳腺癌之間有關(guān)聯(lián)。因此，這非常有必要通過生物化學(xué)和分子生物學(xué)手段探究SHCBP1是否與CDC45作用共同參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程。

STRING相互作用網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)一步揭示了SHCBP1參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制：通過調(diào)節(jié)一些與細(xì)胞分裂關(guān)系密切的蛋白質(zhì)，來調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的分裂。分析表明，蛋白質(zhì)KIF23與SHCBP1相互作用關(guān)系最強(qiáng)，而已知研究證明KIF23 mRNA高表達(dá)與ER(-)乳腺癌患者的不良預(yù)后具有極強(qiáng)的相關(guān)性[22]；NCAPG可作為ER(+)乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志物[23]；CCNA2可作為ER(+)乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志物，其高表達(dá)與ER(+)乳腺癌的較差預(yù)后以及他莫昔芬抗性相關(guān)[24]。據(jù)圖7所示，以上三個(gè)基因都與SHCBP1的表達(dá)具有極高的相互作用關(guān)系。

利用多種數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，SHCBP1在乳腺癌組織中表達(dá)較高，且該基因高表達(dá)的Luminal A亞型乳腺癌患者預(yù)后較差。此外，通過共表達(dá)分析及蛋白質(zhì)分析，初步探究SHCBP1作用于乳腺癌的潛在機(jī)制。這些證據(jù)均表明SHCBP1是一種很有前景的乳腺癌預(yù)后指標(biāo)及潛在治療靶點(diǎn)。

4 結(jié) 論

1)SHCBP1的表達(dá)量可用于預(yù)測(cè)Luminal A亞型乳腺癌患者的預(yù)后情況。

2)SHCBP1可作為乳腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。

3)SHCBP1和CDC45 mRNA表達(dá)水平之間呈正相關(guān)，并可能通過與KIF23等10種蛋白相互作用來參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展。