小鼠精子發(fā)生中環(huán)形RNA生成和功能分析

宋逸釩，倪 挺，魏 剛

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

不孕不育日漸成為現(xiàn)代社會生殖健康面臨的嚴(yán)重問題，其中男性不育約占50%。從生物學(xué)的角度來看，男性生殖問題的關(guān)鍵是如何產(chǎn)生正常的生殖細(xì)胞，而精子發(fā)生又是生殖細(xì)胞產(chǎn)生的核心環(huán)節(jié)。深入研究并認(rèn)知精子發(fā)生的分子機(jī)制，對人類的生殖健康、男性的生育調(diào)節(jié)、男性不育的診治均有十分重要的理論和實踐意義。臨床樣品上發(fā)現(xiàn)的與精子發(fā)生障礙相關(guān)的遺傳突變通常需要在小鼠等重要模式動物中進(jìn)行功能驗證和機(jī)制探索，因此對于小鼠精子發(fā)生不同時期細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控研究可為人類精子發(fā)生調(diào)節(jié)機(jī)制的闡明提供重要線索。除了信使RNA，新近研究還發(fā)現(xiàn)了不少lncRNA(long non-coding RNA，長非編碼RNA)在生殖細(xì)胞增殖、分化過程中起到重要作用[1]。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)作為lncRNA家族的一個新成員，其是否在精子發(fā)生過程中發(fā)揮特定的生物學(xué)功能也引起了廣泛的關(guān)注。

circRNA和過去研究的許多種類RNA不同，其序列并不以基因組外顯子正常的順序排列組成，而是RNA的5’末端和3’末端頭尾相連，形成一個像質(zhì)粒一樣共價閉合的單鏈環(huán)狀分子[2]。按形成circRNA的序列在原始母基因中的類別，circRNA可分為外顯子、內(nèi)含子和基因間區(qū)域來源，其中，目前發(fā)現(xiàn)的circRNA絕大多數(shù)來源于外顯子[2]。研究表明外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子中的反向重復(fù)序列(比如人中的Alu序列)可促進(jìn)兩個線性外顯子的反向成環(huán)而形成circRNA[3]。

近年來的研究也不斷發(fā)現(xiàn)：circRNA具有多種基因調(diào)控功能，如高豐度的circRNA可以競爭所在母基因正常的剪接或可變剪接，從而使得正常剪接的RNA水平下降，引起下游的一系列反應(yīng)[4]；circRNA可作為microRNA(miRNA)海綿吸附特定miRNA，繼而影響該miRNA對其下游靶基因的調(diào)控[5]。此外，circRNA上的m6A(腺嘌呤6位甲基化)修飾可以促進(jìn)翻譯[6]。circRNA還可以通過結(jié)合RNA結(jié)合蛋白(RBP)[7]后與Pol II互作調(diào)控宿主基因的表達(dá)[8]等方式體現(xiàn)其功能。但是在精子發(fā)生過程中，circRNA的生成機(jī)制和下游功能尚不清楚。

精子發(fā)生是一個高度有序的過程，它的每一個階段都被精細(xì)調(diào)控。目前已知有一些RNA結(jié)合蛋白如ELAVL1/HuR、hnRNP G-T、NANOS2等在精子發(fā)生過程中起著重要調(diào)控作用[7,9-10]。同時，多種miRNA如miR-21[11]、miR-17-92簇[12]、mir-184[13]等也被證實在精子發(fā)生過程中起重要調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)circRNA在睪丸中高度富集[14]，與合作者的研究也發(fā)現(xiàn)小鼠精子發(fā)生過程中l(wèi)ncRNA和circRNA均表現(xiàn)出了顯著的表達(dá)變化[15]，提示circRNA在精子發(fā)生過程中也可能起著重要作用，其上游的形成機(jī)制值得深入研究。利用之前發(fā)表的數(shù)據(jù)，系統(tǒng)分析了小鼠精子發(fā)生五個時期(小鼠精原干細(xì)胞、原始精原細(xì)胞、前細(xì)線期精母細(xì)胞，粗線期精母細(xì)胞及圓形精子細(xì)胞)中的circRNA及其可能成環(huán)機(jī)制，并分析探討了隨精子發(fā)生不同時期表達(dá)顯著變化的circRNA行使功能的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

所用數(shù)據(jù)來自于本實驗室之前發(fā)表的數(shù)據(jù)[15]，其生物學(xué)樣本均來自于DBA/2和C57BL6兩種品系的老鼠產(chǎn)生的雜交后代，樣本獲取、RNA提取及RNA文庫構(gòu)建流程參見文獻(xiàn)[15]。原始數(shù)據(jù)也可從NCBI SRA數(shù)據(jù)庫下載(SRP067167)。每個時期樣品(處理)均有兩份生物學(xué)重復(fù)，各樣本及它們對應(yīng)的原始reads數(shù)據(jù)見表1。為了讓后續(xù)分析更加精準(zhǔn)，利用NGSQCToolkit[16]去除了原始測序數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量reads，并用fastuniq對質(zhì)量過濾后的reads進(jìn)行去冗余。

表1 參試樣本信息及測序reads數(shù)Table 1 Reference sample information and sequencing reads

1.2 小鼠精子發(fā)生過程中差異表達(dá)circRNA分析

CIRI[17]是一款常用的從RNA-seq測序數(shù)據(jù)中預(yù)測鑒定circRNA的軟件，使用CIRI的默認(rèn)參數(shù)，預(yù)測各參試樣本中的circRNA，并將得到的circRNA和CIRCpedia數(shù)據(jù)庫[18]中的circRNA進(jìn)行比對分析。采用sailfish-cir軟件[19](默認(rèn)參數(shù))對circRNA在各時期的表達(dá)進(jìn)行定量分析。同時，借助sailfish_cir計算出的circRNA read數(shù)目，分析獲得到各個時期的環(huán)形-線性比。最后，為了確保circRNA差異表達(dá)分析的可靠性，僅對Ribozero文庫來源的circRNA使用Next maSigPro[20]分析五個時期中差異表達(dá)的circRNA，并采用R中的clusterProfiler包[21]對差異表達(dá)circRNA的來源基因進(jìn)行了Gene Ontoloty(GO)功能類分析。

1.3 小鼠精子發(fā)生過程中circRNA上游生成機(jī)制分析

為了分析在小鼠精子發(fā)生過程中哪些因素可能影響了外顯子型circRNA的生成，首先分析了circRNA側(cè)翼內(nèi)含子的長度，并將它和隨機(jī)抽取的內(nèi)含子的長度進(jìn)行比較。借助RepeatMasker[22]分析獲得基因組上重復(fù)序列，并歸類到幾種常見的反向重復(fù)序列類型；從它們在基因組中的位置信息判定哪些circRNA的側(cè)翼內(nèi)含子含有反向重復(fù)序列，并計算每種重復(fù)序列在circRNA側(cè)翼內(nèi)含子中的反向互補(bǔ)配對情況。

1.4 小鼠精子發(fā)生過程中circRNA功能機(jī)制預(yù)測

使用CIRI-FULL[23]和CIRI-AS[24]從基因組信息中獲取circRNA的序列信息。隨后用miRanda-3.3a預(yù)測circRNA中miRNA的結(jié)合位點(diǎn)(設(shè)置miRanda的參數(shù)為-sc 170 -en 25，相比較miRanda的默認(rèn)參數(shù)-sc 140和-en 1，提升了score和energy閾值，減少了預(yù)測結(jié)果的假陽性)。結(jié)合circRNA序列信息和m6A基序(RRm5ACH)，利用IRESfinder[25]和自己編寫的程序搜索circRNA上的m6A潛在位點(diǎn)預(yù)測circRNA作為翻譯模板的可能性。結(jié)合POSTAR2數(shù)據(jù)庫[26]收集的RBP結(jié)合基序，搜索circRNA中潛在的RBP結(jié)合位點(diǎn)。

2 結(jié)果分析

2.1 小鼠精子發(fā)生5個時期中的環(huán)形RNA

利用CIRI2系統(tǒng)分析了小鼠精子發(fā)生各參試樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)30 960個circRNA，其中有14 920個(48.2%)circRNA可被CIRCpedia數(shù)據(jù)庫中的circRNA交互驗證(見圖1a)。由于CIRCpedia數(shù)據(jù)庫中只收集了小鼠睪丸的circRNA，并未收集完整小鼠精子發(fā)生各個時期的所有數(shù)據(jù)[18]，因此推測余下的 circRNA(約50%)可能是小鼠精子發(fā)生特有的circRNA。RNaseR處理可以大量去除線性RNA從而富集circRNA，分析結(jié)果顯示，ribozero文庫來源的RNA-seq數(shù)據(jù)鑒定出的circRNA的數(shù)量在5個不同細(xì)胞類型中變化幅度不大；而在精原干細(xì)胞中，RNaseR處理文庫中發(fā)現(xiàn)的circRNA數(shù)要大大多于從ribozero文庫中發(fā)現(xiàn)的circRNA數(shù)目(見圖1b)，這也提示了CIRI發(fā)現(xiàn)circRNA的可靠性。

對精子發(fā)生各個時期的circRNA進(jìn)行序列來源分析發(fā)現(xiàn)，它們絕大多數(shù)主要來源于外顯子區(qū)域，即外顯型circRNA(見圖1c)。由于circRNA可能通過競爭性剪接影響所在母基因的正常線性mRNA的生成，計算了各時期環(huán)形-線性比，發(fā)現(xiàn)十個樣本的環(huán)形線性比均小于3%(見圖1d)。但有趣的是，圓形精子細(xì)胞中環(huán)形線性比要明顯高于其他精子發(fā)生時期(見圖1d)。因為circRNA不易降解，所以推測圓形精子細(xì)胞中的circRNA增多更可能是circRNA上游生成機(jī)制的改變引起的。

2.2 精子發(fā)生過程中差異表達(dá)的circRNA及其所在基因的功能富集分析

分析小鼠精子發(fā)生不同時期circRNA本身的豐度差異和所屬母基因的功能情況可為circRNA在精子發(fā)生中的功能推測提供重要線索。判別差異表達(dá)的基礎(chǔ)是對circRNA豐度的定量，之前circRNA定量都是直接計算circRNA反向剪切連接處的讀長(Junction reads)數(shù)目，Li等開發(fā)了sailfish-cir軟件[19]，該軟件應(yīng)用改進(jìn)過的EM(Expectation-Maximization)算法對circRNA進(jìn)行定量，能校正多種已知的系統(tǒng)性偏差，也克服了之前定量方法存在依賴測序深度、數(shù)據(jù)離散的缺陷，提高了circRNA定量的準(zhǔn)確度。采用sailfish-cir算法對小鼠精子發(fā)生不同時期circRNA的穩(wěn)態(tài)表達(dá)量進(jìn)行了定量，隨后我們使用maSigPro基于線性回歸的方法分析了在不同時期樣本中表達(dá)量顯著不同(P≤0.001，軟件默認(rèn)差異判斷標(biāo)準(zhǔn))的circRNA，共得到409個差異表達(dá)circRNA。從這409個差異circRNA的熱圖中可以看出，circRNA表達(dá)量上升和下降的趨勢表現(xiàn)出了極高的一致性，并且組間差異較小(見圖2a)。為了探索這些差異表達(dá)的circRNA與小鼠精子發(fā)生過程的聯(lián)系，對這些circRNA來源的母基因做了基因本體(GO)富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們富集的生物學(xué)過程包括精子發(fā)生、纖毛運(yùn)動和形態(tài)、微管束的形成和運(yùn)動以及染色質(zhì)修飾和組蛋白修飾等(見圖2b)，暗示相應(yīng)circRNA可能在精子發(fā)生中起作用。上述結(jié)果暗示circRNA在精子發(fā)生過程中呈動態(tài)變化且所在基因與精子發(fā)生功能具有相關(guān)性。

圖1 小鼠精子發(fā)生各時期細(xì)胞中circRNA的數(shù)目、類型及環(huán)形線性比
Fig.1 Number,type,and circular-linear ratio of circRNA in mouse spermatogenesis

注：(b)中1和2指同一細(xì)胞類型的兩個生物學(xué)重復(fù)。RNaseR指對SSC細(xì)胞進(jìn)行RNaseR酶處理去除線性RNA的樣品。(c)中外顯子來源即exon、內(nèi)含子來源即intron、基因間區(qū)域即intergenic。

圖2 小鼠精子發(fā)生不同時期circRNA的差異表達(dá)及所在基因功能富集分析Fig.2 Differential expression of circRNA and functional enrichment analysis of the gene in mouse spermatogenesis at different stages

2.3 小鼠精子發(fā)生中circRNA的上游生成機(jī)制分析

已有研究表明，在人細(xì)胞中側(cè)翼內(nèi)含子中反向重復(fù)序列的配對可促進(jìn)外顯子來源的circRNA的生成，外顯子型circRNA的兩個側(cè)翼內(nèi)含子中Alu重復(fù)序列的反向配對(Inverted repeated across，即IRacross)數(shù)目與同一內(nèi)含子內(nèi)部的Alu序列的配對(Inverted repeated within，即IRwithin)數(shù)目之間的競爭是circRNA形成的重要因素(見圖3)，IRacross配對數(shù)目越大，越能促進(jìn)circRNA的生成[3]。

圖3 circRNA形成及側(cè)翼內(nèi)含子中重復(fù)序列反向互補(bǔ)配對示意圖Fig.3 CircRNA formation and reverse complementary repeated sequences in flanking introns

注：一個circRNA由綠色和藍(lán)色兩個exon組成，位于兩個側(cè)翼內(nèi)含子中的重復(fù)序列反向互補(bǔ)配對(IRacross)可以促進(jìn)circRNA的生成，而位于同一內(nèi)含子中的重復(fù)序列反向互補(bǔ)配對(IRwithin)則會抑制circRNA的生成。

小鼠中除了SINE/Alu序列，還有SINE序列(SINE/B2和SINE/B4)、LINE/L1、ERVL-MaLR和ERVK等內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的重復(fù)序列。那么小鼠精子發(fā)生過程中這些不同類型的重復(fù)序列間的互補(bǔ)配對是否也對circRNA的形成有貢獻(xiàn)呢？為了回答這個問題，對小鼠精子發(fā)生中外顯子來源的circRNA的側(cè)翼內(nèi)含子進(jìn)行了系統(tǒng)分析。首先將circRNA側(cè)翼內(nèi)含子的長度和隨機(jī)抽取的內(nèi)含子進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠精子發(fā)生相關(guān)細(xì)胞中所存在的circRNA的側(cè)翼內(nèi)含子的長度明顯比隨機(jī)抽取的內(nèi)含子更長(見圖4a)(Wilcoxon Signed Rank Test，P<0.001)。接著評估外顯子來源的circRNA兩個側(cè)翼的內(nèi)含子之間所形成的反向互補(bǔ)配對的數(shù)目，結(jié)果顯示，小鼠精子發(fā)生過程中circRNA側(cè)翼內(nèi)含子中各種類型的IRacross數(shù)目均顯著多于隨機(jī)獲取的內(nèi)含子中的IRacross數(shù)目(見圖4b)，提示小鼠精子細(xì)胞中多種重復(fù)序列對circRNA的形成均有潛在貢獻(xiàn)。比較了circRNA的側(cè)翼內(nèi)含子和隨機(jī)抽取的內(nèi)含子中IRacross-IRwithin差值，發(fā)現(xiàn)成環(huán)的外顯子中該值也顯著大于對照(見圖4c)，進(jìn)一步提示側(cè)翼內(nèi)含子中反向重復(fù)序列的配對可能是小鼠精子發(fā)生過程中細(xì)胞內(nèi)circRNA生成的重要促進(jìn)因素。

2.4 circRNA下游功能預(yù)測

在小鼠精子發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)了許多circRNA，這些circRNA在精子發(fā)生進(jìn)程中的潛在生物學(xué)功能是值得探討的問題。circRNA可以通過多種方式來發(fā)揮其生物學(xué)功能，如促進(jìn)所在基因的轉(zhuǎn)錄、競爭所在基因成熟mRNA的產(chǎn)生、作為microRNA(miRNA)的分子海綿、作為多個蛋白質(zhì)結(jié)合的分子海綿、作為翻譯模板等[5-6]。主要從兩個層面來分析這些circRNA潛在的功能，即作為miRNA分子海綿的circRNA和具有翻譯潛能的circRNA，同時對circRNA和RBP的互作進(jìn)行了初步分析。

2.4.1 circRNA與miRNA結(jié)合作為miRNA“海綿”的功能預(yù)測

精子發(fā)生中miRNA可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)進(jìn)而影響精子發(fā)生進(jìn)程，如miR-19a、miR-19b通過調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)來影響原始生殖細(xì)胞的增殖[27-28]， miR-122a通過結(jié)合TNP2對精子生成的后期階段發(fā)揮調(diào)控作用[29]等。那么研究發(fā)現(xiàn)的409個精子發(fā)生中差異表達(dá)的circRNA中有多少可能通過miRNA分子海綿的方式起作用呢？利用miRanda-3.3a[30]對這409個差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行了miRNA結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)137個circRNA具有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，涉及124個miRNA。值得提及的是，研究發(fā)現(xiàn)具有miRNA結(jié)合位點(diǎn)的circRNA中都只有一個miRNA結(jié)合位點(diǎn)(見圖5a)。雖然早期的研究曾報導(dǎo)circRNA可結(jié)合很多的miRNA，但研究表明，只有一個miRNA結(jié)合位點(diǎn)的circRNA也可調(diào)控相應(yīng)miRNA的效應(yīng)濃度并對表型產(chǎn)生影響[31]。發(fā)現(xiàn)MMU_CIRCpedia_39694(chr4:45987462|45990230)這個circRNA來源于精子發(fā)生相關(guān)基因TDRD7，預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)它可以結(jié)合mmu-miR-7042-5p，從而有可能減少該miRNA對有功能的TDRD7線性mRNA的影響。精子發(fā)生過程中這些潛在的circRNA-miRNA互作在小鼠精子發(fā)生中的調(diào)控作用有待后續(xù)實驗進(jìn)一步驗證。

圖4 circRNA側(cè)翼內(nèi)含子長度及其中的反向互補(bǔ)配對的重復(fù)序列分析Fig.4 Length of circRNA flanking introns and repeated sequence analysis of their reverse complemen tary pairs

2.4.2 circRNA上的m6A基序促進(jìn)翻譯的功能預(yù)測

有研究表明，一些circRNA可作為翻譯模板產(chǎn)生蛋白質(zhì)，這些可被翻譯的circRNA具有m6A修飾和特定的基序(RRm5ACH)，這一特征可招募翻譯起始復(fù)合物并促進(jìn)核糖體組裝，使circRNA最終可以翻譯出蛋白質(zhì)[6]。為了考察精子發(fā)生過程中是否存在具有潛在翻譯功能的circRNA，以普通的mRNA序列作為對照組，對全體circRNA、差異表達(dá)的circRNA和來自精子發(fā)生相關(guān)基因的差異表達(dá)circRNA分別進(jìn)行m6A基序預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)全體circRNA中有85%的序列含有RRm5ACH基序，而作為對照的全部mRNA的序列中該基序的比例僅為69%，兩者間存在顯著差異(見圖5b左，p值 < 0.001，Wilcoxon Signed Rank Test)。而使用IRESfinder[25]發(fā)現(xiàn)所有circRNA中有46%的序列含有IRES(Internal ribosome entry site，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))位點(diǎn)，而作為對照的全部mRNA的序列中僅有32%，兩者間亦存在顯著差異(見圖5b右，p值 < 0.001，Wilcoxon Signed Rank Test)。這一結(jié)果暗示精子發(fā)生過程中的部分circRNA有潛在的蛋白編碼功能。對相應(yīng)circRNA進(jìn)行更為深入的實驗和功能驗證或許有可能為深入理解精子發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制開辟新的視角。

2.4.3 circRNA與RNA結(jié)合蛋白(RBP)的互作分析

circRNA可與RBP結(jié)合從而影響特定的生物過程。Du等發(fā)現(xiàn)circ-FOXO3與CDK2蛋白結(jié)合可抑制細(xì)胞周期進(jìn)程[32]，Abdelmohsen等發(fā)現(xiàn)circ-PABPN1可競爭性結(jié)合HuR并進(jìn)而抑制HuR與PABPN1的mRNA結(jié)合，從而降低PABPN1翻譯效率[33]。NF90/NF110能和成熟的circRNA直接結(jié)合形成circRNA-蛋白復(fù)合體(circRNP)，并在抗病毒過程中發(fā)揮重要的免疫功能[34]。小鼠精子發(fā)生過程中的circRNA是否也有結(jié)合RBP的潛力？為了回答這個問題，利用公共數(shù)據(jù)庫中的RBP數(shù)據(jù)庫POSTAR2對精子發(fā)生過程中的circRNA進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有10 517個circRNA具有RBP結(jié)合位點(diǎn)，其中除了約3 547個circRNA只有1個RBP結(jié)合位點(diǎn)外，其余circRNA都有2個以上的潛在RBP結(jié)合位點(diǎn)(見圖5c)，甚至部分circRNA有10個以上的潛在RBP結(jié)合位點(diǎn)(見圖5c)，如chr19:5800494|5800738含有31個，chr17:39845133|39845215含有30個。另外，除了一個circRNA可以結(jié)合多個RBP，一個RBP也可能被多個circRNA所吸附。比如我們發(fā)現(xiàn)總共有558個circRNA含有MSI2蛋白結(jié)合位點(diǎn)，而MSI2蛋白被報導(dǎo)在精子發(fā)生過程中起重要作用[35]。上述結(jié)果強(qiáng)烈暗示，circRNA可能通過“RBP海綿”的作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞中相應(yīng)RBP的效應(yīng)濃度。circRNA-RBP互作在精子發(fā)生中的作用很值得后續(xù)深入研究。

圖5 小鼠精子發(fā)生相關(guān)細(xì)胞中circRNA的m6A基序及miRNA、RBP結(jié)合位點(diǎn)分析Fig.5 Analysis of m6

3 討 論

circRNA是一種特殊形式的內(nèi)源性RNA，其閉環(huán)結(jié)構(gòu)使之可能逃脫細(xì)胞內(nèi)核酸外切酶的作用，并可能通過多種方式發(fā)揮其生物學(xué)功能。circRNA的上游生成機(jī)制雖已在人類細(xì)胞中進(jìn)行了分析和部分功能證明，但小鼠精子發(fā)生過程中大量產(chǎn)生的circRNA是否通過類似的機(jī)制生成仍不清楚。通過系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)各種類型的反向重復(fù)序列(SINE/L1、SINE/B2、SINE/B4、ERVL-MaLR和ERVK)在小鼠精子發(fā)生過程中產(chǎn)生的circRNA側(cè)翼內(nèi)含子中均有富集(見圖4b、4c)，提示它們也可能具有類似人circRNA側(cè)翼內(nèi)含子中Alu序列促進(jìn)circRNA生成的功能。本研究結(jié)果拓展了外顯子型circRNA生成機(jī)制的順式作用元件類別，為理解circRNA生成的分子調(diào)控機(jī)制提供了新的線索，但具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的實驗驗證(如在circRNA表達(dá)載體中引入這些不同類別的重復(fù)序列)。

目前尚未有circRNA在小鼠精子發(fā)生中起作用的報道。雖然我們發(fā)現(xiàn)了精子發(fā)生過程中有大量的circRNA產(chǎn)生，并初步推測了其形成機(jī)制，但它們中哪些circRNA對精子發(fā)生有調(diào)控作用，以何種方式起作用仍不清楚。功能驗證需要尋找有潛能的候選circRNA，而本研究預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)的部分circRNA的miRNA海綿功能、翻譯模板潛能預(yù)測和RBP分子海綿等可為篩選功能性circRNA提供有價值的參考線索。雖然生信分析不能直接證明這些circRNA在精子發(fā)生中的作用，但其分析結(jié)果暗示部分circRNA有可能通過多種方式來參與精子發(fā)生的調(diào)節(jié)，后續(xù)的研究可在此基礎(chǔ)上篩選候選circRNA，通過設(shè)計反向引物并結(jié)合定量PCR(qRT-PCR)驗證相應(yīng)circRNA的存在，繼而構(gòu)建circRNA過表達(dá)載體并注射小鼠睪丸，使得相應(yīng)細(xì)胞中過表達(dá)該circRNA；或者在小鼠中通過基因編輯刪除配對的反向重復(fù)序列來下調(diào)circRNA的產(chǎn)生，從而驗證其是否具有調(diào)控精子發(fā)生表型的功能。