金香顆粒預(yù)防小鼠大腸桿菌性腹瀉的效果觀察

趙寶凱 ， 耿 健 ， 鐘 靈 ， 曹俊杰 ， 楊漢春

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 北京大偉嘉生物技術(shù)股份有限公司 ， 北京 海淀 100085 ； 3. 吉林大學(xué)動物科學(xué)院 ， 吉林 長春 130062)

在規(guī)?；i場中腹瀉導(dǎo)致仔豬死亡數(shù)量占疾病引起仔豬死亡的20%[1-2]，大腸桿菌是引起仔豬腹瀉的主要病原菌。在仔豬大腸桿菌性腹瀉的防治中普遍采用抗菌藥物、激素、化學(xué)合成藥物，這些藥物的長期使用極易產(chǎn)生耐藥性及造成藥物殘留風(fēng)險。已有中藥用于治療仔豬的大腸桿菌性腹瀉并取得滿意效果[3]。金香顆粒是通過現(xiàn)代化的制劑技術(shù)將傳統(tǒng)金香散原方制備成了一種利于規(guī)?；a(chǎn)和臨床使用的顆粒劑，提高臨床治療效果與使用方便性。本試驗通過分析金香顆粒對小鼠大腸桿菌性腹瀉的預(yù)防效果來評價金香顆粒的藥效作用，闡明其作用機理，為其用于防治仔豬腹瀉的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級昆明小鼠，體重(20±2) g，雌雄各半,購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2010-0001。分籠飼養(yǎng)，自由飲水，飼喂顆粒料。

1.1.2 藥物與主要試劑 金香顆粒[沈陽偉嘉牧業(yè)技術(shù)有限公司，將金絲桃苷、蜘蛛香兩味藥的提取清膏與石菖蒲細(xì)粉，與蔗糖粉和糊精(3∶1)的混合物為稀釋劑，利用濕法制粒法制備而成]，批號：20170217；白頭翁散(沈陽嘉偉牧業(yè)技術(shù)有限公司)，批號：20170227；氯化鈉注射液(四平巨能藥業(yè)有限公司)，批號：160711；依文思藍(lán)(上海源葉生物有限公司)，批號：M26S6L3204。小鼠髓過氧化物酶(MPO)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，批號：20170907；超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(南京建成生物工程研究所)，批號20170313。

1.1.3 試驗菌種 豬源致病性大腸桿菌O101，菌株為CVCC231，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 引起小鼠腹瀉的大腸桿菌菌數(shù)確定 參照文獻[4]，用5個不同菌液數(shù)量進行感染模型的建立。選取試驗鼠30只，雌雄各半，隨機分為6組，每組5只，小鼠腹腔注射0.6 mL的大腸桿菌菌懸液，分別給菌1×109、7×108、5×108、3×108、1×108CFU(菌落形成單位)，空白組腹腔注射0.6 mL 生理鹽水作為對照。在注射4 h后，統(tǒng)計各組腹瀉率與死亡率。

1.2.2 試驗分組及處理 選取60只小鼠，雌雄各半，隨機平均分為6組，分別為高劑量組灌服金香顆粒3.2 g/(kg·bw)、中劑量組灌服金香顆粒1.6 g/(kg·bw)、低劑量組灌服金香顆粒0.8 g/(kg·bw)、藥物對照組灌服白頭翁散0.64 g/(kg·bw)、感染不給藥組(生理鹽水)和空白對照組(生理鹽水)，每組10只小鼠。分別對金香顆粒用藥組和藥物對照組小鼠進行預(yù)防性給藥，每只灌服0.5 mL相應(yīng)濃度的藥物混懸液，1 次/d，連續(xù)5 d；感染不給藥組和空白對照組，每只灌服生理鹽水0.5 mL，1 次/d，連續(xù)5 d。末次給藥30 min后，各組小鼠腹腔注射5×108CFU大腸桿菌O101菌液，0.6 mL/只，空白對照組注射同體積的無菌培養(yǎng)基。

1.2.3 金香顆粒對小鼠大腸桿菌腹瀉模型的效果 在小鼠腹腔注射大腸桿菌后，統(tǒng)計各組小鼠的稀便次數(shù)、總便次數(shù)、稀便大小，計算出稀便率、稀便級和腹瀉指數(shù)。

稀便級：稀便的程度，以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小分為 4 級。直徑<1 cm為1級，1～<2 cm 為2級，2～<3 cm為3級，≥3 cm為4級。污跡為較規(guī)則圓形者測其直徑，不規(guī)則形狀則測量其最長和近似圓的直徑的平均數(shù)。

腹瀉指數(shù)=稀便率×平均稀便級

1.2.4 病理組織學(xué)觀察 在腹腔注射大腸桿菌4 h后，處死、剖檢，取小鼠小腸組織，經(jīng) 10%中性福爾馬林溶液固定，制作石蠟切片，常規(guī)H.E.染色，進行組織病理學(xué)檢查。

1.2.5 金香顆粒對大腸桿菌性腹瀉小鼠腸道蠕動的影響 60只試驗鼠分組及給藥方式按照1.2.2。接種大腸桿菌30 min后每只小鼠灌服碳素墨水0.1 mL。 20 min后處死小鼠并剖檢，測量幽門到墨水運行最遠(yuǎn)端以及幽門到回盲部的長度。

1.2.6 金香顆粒對大腸桿菌性腹瀉小鼠的腹膜炎性滲出的影響 60只試驗鼠分組及給藥方式按照1.2.2進行。接種大腸桿菌30 min后，每只小鼠尾靜脈注射0.5%依文思蘭生理鹽水溶液0.1 mL，然后腹腔注射0.7%乙酸0.2 mL，30 min后處死。收集生理鹽水腹腔沖洗液并定容至10 mL，經(jīng)10 000 r/min 離心5 min，取離心后上清液用酶標(biāo)儀檢測樣品OD610 nm值，計算出沖洗液中依文思蘭含量。

1.2.7 金香顆粒對大腸桿菌性腹瀉小鼠小腸組織中MPO和SOD的影響 60只試驗小鼠分組以及給藥方式與1.2.2相同。接種大腸桿菌30 min后，取小鼠小腸組織，制備5%的組織勻漿。按MPO試劑盒說明書，進行小腸組織MPO活性的測定。取小腸組織勻漿上清液，測定腸道SOD值，操作方法按試劑盒說明書進行。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用ANOVA多重比較分析中的LSD檢驗(t檢驗)分析數(shù)據(jù)顯著性。

2 結(jié)果

2.1 小鼠腹瀉模型建立 不同劑量組腹瀉率及死亡率如表1所示，5×108CFU組死亡率為0，腹瀉率為100%；上述結(jié)果顯示，5×108CFU的菌落數(shù)為最佳接種劑量，該劑量既不引起小鼠死亡又能使所有小鼠發(fā)生腹瀉。

表1 不同給菌量小鼠的死亡率與腹瀉率

2.2 金香顆粒對小鼠腹瀉的預(yù)防作用 如表2所示，與感染不給藥組相比，高劑量組與藥物對照組的稀便率與腹瀉指數(shù)極顯著降低(P<0.01)。高劑量組與藥物對照組相對比，其腹瀉率、稀便率、腹瀉指數(shù)均比較低。上述結(jié)果表明，金香顆粒對小鼠大腸桿菌性腹瀉具有很好的預(yù)防效果，且顯著優(yōu)于對照藥物白頭翁散。

表2 各組臨床指標(biāo)統(tǒng)計比較

2.3 組織病理學(xué)結(jié)果 如中插彩版圖1所示，大腸桿菌引起的腹瀉小鼠的小腸(中插彩版圖1E)與空白對照組小鼠(中插彩版圖1F)相比，內(nèi)層細(xì)胞排列松散稀疏，小腸內(nèi)部結(jié)構(gòu)混亂并且出現(xiàn)膨脹，密度不均一，并出現(xiàn)大量空泡。小鼠腸道的上述組織病學(xué)變化顯示，5×108CFU的菌落數(shù)可以引起小鼠腸道的損傷，從而引起腹瀉。高劑量組(中插彩版圖1A)、中劑量組(中插彩版圖1B)與藥物對照組(中插彩版圖1D)的小腸上皮結(jié)構(gòu)相似，排列密集整齊，細(xì)胞變性微小，未見組織空泡。低劑量組(中插彩版圖1C)見腸絨毛上皮細(xì)胞有部分脫落，排列稀松。上述結(jié)果顯示，高、中劑量組與藥物對照組都可以降低大腸桿菌腹瀉所引起的腸道組織的病理學(xué)變化，并且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。

2.4 金香顆粒對腸道蠕動的影響 對小鼠碳素墨水推進率進行測定，結(jié)果如表3所示，感染不給藥組的碳素墨水推進率比空白對照組相比有明顯升高(P<0.05)，表明大腸桿菌感染可以顯著加快腸道蠕動而引起腹瀉。與感染不給藥組相比，高劑量組及藥物對照組的碳素墨水推進率顯著降低(P<0.05)。表明金香顆粒可以通過降低腸道的蠕動從而減少腹瀉發(fā)生，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。

表3 小鼠腸道碳素墨水推進率

2.5 金香顆粒對炎性滲出的抑制作用 金香顆粒對小鼠腹腔依文思藍(lán)滲出濃度的影響結(jié)果如表4所示，與感染不給藥組相比，高、中、低劑量組、藥物對照組的依文思藍(lán)濃度有顯著降低(P<0.01)。表明金香顆粒抑制小鼠腹腔依文思藍(lán)滲出濃度呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，可以通過抑制炎性滲出從而降低腹瀉率。

表4 小鼠腹腔依文思藍(lán)濃度

2.6 金香顆粒對腹瀉模型小鼠腸道中MPO含量的影響 如表5所示，感染不給藥組與空白對照組相比，小鼠腸道中MPO的含量呈現(xiàn)極顯著升高(P<0.01)。高劑量和中劑量組腸道中MPO的含量顯著低于感染不給藥組(P<0.05)。隨著金香顆粒的使用劑量提高，腸道中的MPO的含量越低。表明高、中劑量組可以顯著降低大腸桿菌腹瀉小鼠腸道組織MPO的含量水平。

表5 小鼠腸道中MPO的含量

2.7 金香顆粒對腹瀉模型小鼠腸道中SOD含量的影響 由表6中可以看出，感染不給藥組與空白對照組相比，小鼠腸道中SOD的含量有極顯著降低(P<0.01)。與感染不給藥組相比，高、中劑量組、藥物對照組小鼠腸道中SOD的含量均極顯著升高(P<0.01)。上述結(jié)果表明，高、中劑量組能夠顯著提高腹瀉模型小鼠腸道SOD含量，有助于消除炎性引起的損傷。

表6 小鼠腸道中SOD的含量

3 討論

金香顆粒主要由貫葉金絲桃、石菖蒲、蜘蛛香三味藥物組成。本試驗通過小鼠大腸桿菌性腹瀉預(yù)防試驗，腸道蠕動試驗，小鼠腹腔依文思藍(lán)滲出試驗和腸道內(nèi)MPO和SOD含量的測定來評價金香顆粒對大腸桿菌性腹瀉的預(yù)防作用及其機制。

在小鼠腹瀉預(yù)防試驗中，金香顆粒高劑量組與感染不給藥組相比，稀便率與腹瀉指數(shù)極顯著降低(P<0.01)，這說明金香顆粒對大腸桿菌性小鼠腹瀉起到了明顯的預(yù)防作用，這可能與藥物成分的作用功效有關(guān)，對貫葉金絲桃很多臨床研究發(fā)現(xiàn)，其提取物金絲桃素和一些黃酮類物質(zhì)具有很好對抗菌消炎作用[5]，蜘蛛香提取物對大腸桿菌有抑菌作用[6]。石菖蒲提取物對大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.25 g/mL[7]。3種藥物組方聯(lián)合用藥，可以起到抗菌消炎作用，因此對大腸桿菌性腹瀉表現(xiàn)出預(yù)防效果。

腸道運動增強是腹瀉發(fā)生發(fā)展的重要因素。在有毒有害物質(zhì)的刺激作用下，腸道發(fā)生反射性蠕動加強，致使腸道內(nèi)容物快速通過腸道后排，以稀便、水便的方式排出體外，發(fā)生腹瀉[8]。本試驗發(fā)現(xiàn)，高、中劑量的金香顆粒能夠顯著降低小鼠小腸的運動，從而減緩內(nèi)容物在腸道中的推進速度，表明金香顆?？赏ㄟ^抑制腸道蠕動來減緩腹瀉的發(fā)生。這可能與藥物成分有明顯的抑菌作用相關(guān)[9]，因為金香顆粒抑制大腸桿菌繁殖，減少毒素產(chǎn)生，減弱由于毒素刺激而引起的運動加快，抑制腸道的運動狀態(tài)對腹瀉具有減緩作用[10]。這些結(jié)果也與近幾年關(guān)于蜘蛛香和石菖蒲的藥理作用研究相符。蜘蛛香中分離發(fā)現(xiàn)了大量新的環(huán)烯醚萜類物質(zhì)，可對實驗大鼠腸應(yīng)激綜合征(IBS)具有明顯改善作用，可抑制IBS大鼠胃腸功能亢進[11]。石菖蒲的根莖中主要成分是揮發(fā)油，能夠雙向調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、可以起到鎮(zhèn)靜、調(diào)節(jié)胃腸道等的作用，直接抑制家兔離體腸肌自發(fā)性和至痙劑引起的痙攣收縮[12]。

在炎癥反應(yīng)初期中性粒細(xì)胞最早到達(dá)感染或損傷部位，并在炎癥部位聚集[13]，被激活后會釋放MPO，腸道組織中MPO含量體現(xiàn)炎癥的嚴(yán)重程度。大腸桿菌性腹瀉腸道病理變化主要表現(xiàn)為卡他性炎癥，炎癥發(fā)展的程度與疾病的嚴(yán)重程度與轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，金香顆粒高、中劑量可以明顯抑制腹瀉小鼠腸道中MPO的上升。說明金香顆粒通過抑制MPO的異常升高和中性粒細(xì)胞在組織中的浸潤的機制預(yù)防大腸桿菌性腹瀉。

本試驗結(jié)果表明，金香顆粒對大腸桿菌引起的腹瀉具有很好預(yù)防作用，并且可以通過調(diào)節(jié)胃腸蠕動、減炎性滲出、抗炎、抑制炎癥產(chǎn)生的自由基等作用來預(yù)防腹瀉的發(fā)生。本試驗為金香顆粒預(yù)防大腸桿菌性腹瀉的作用機理提供了理論基礎(chǔ)，為后期的臨床研究提供了數(shù)據(jù)支持。