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    運輸應(yīng)激對小鼠脾臟HSP70、TNF-α及IL含量的影響

    2020-05-17 10:17:38王安平彭侃霖彭瑞妮李國生鄭文亞
    中國獸醫(yī)雜志 2020年12期
    關(guān)鍵詞:脾臟細胞因子畜禽

    王安平 , 彭侃霖 , 肖 鵬 , 彭瑞妮 , 李國生 , 鄭文亞,2,3

    (1. 宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院 , 江西 宜春 336000 ; 2. 江西省高等學(xué)校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 , 江西 宜春 336000 ; 3. 江西綠科農(nóng)牧科技有限公司 , 江西 宜春 336000)

    隨著國內(nèi)集約化養(yǎng)殖程度不斷提高,畜禽的長途運輸十分常見,而運輸本身是一種應(yīng)激壓力[1]。運輸涉及到動物隔離、活動受限、身體失衡、環(huán)境溫度和濕度的波動、飼料和水的缺乏以及其他應(yīng)激誘導(dǎo)因素[2]。這些因素共同作用在畜禽上,誘導(dǎo)動物產(chǎn)生應(yīng)激,對畜禽的免疫、呼吸、消化和神經(jīng)等系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響,降低畜禽的經(jīng)濟價值,給養(yǎng)殖場造成經(jīng)濟損失。

    白細胞介素-2(IL-2)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)是由Th1細胞產(chǎn)生的細胞因子,二者都為促炎因子;白細胞介素-4(IL-4)和白細胞介素-6(IL-6)是由Th2細胞合成的細胞因子,IL-4有抗炎作用,而IL-6是具有促炎和抗炎雙重作用的細胞因子[4]; 熱休克蛋白70(HSP70)參與細胞的應(yīng)激保護,在應(yīng)激條件下表達會增加,具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用。本試驗以小鼠為實驗動物,模擬運輸應(yīng)激對脾臟的影響,探究熱休克蛋白(HSP70)、白細胞介素(IL-2、IL-4和IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)水平的變化與運輸之間的關(guān)聯(lián),并篩選出可能的應(yīng)激評判分子指標(biāo),為降低畜禽運輸應(yīng)激提供有價值的參考。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 選用清潔級雄性8~9周齡ICR小鼠30只,體重(30±5)g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±1)℃,采食和飲水自由。適應(yīng)性飼喂10 d后進行試驗。

    1.2 主要儀器及試劑 小鼠IL-2、IL-4、IL-6、HSP-70、TNF-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒,均購自青島生物科技有限公司。飛鴿牌低速臺式離心機(型號:TDL-60B),購自上海安亭科學(xué)儀器廠;美國酶標(biāo)讀數(shù)儀(型號:Awareness Chromate 4300)和超低溫冰箱(ThermoScientific),均購自江西省立康科技有限公司;微量振蕩器(型號:MH-2),購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司;恒溫培養(yǎng)震蕩器(型號:ZWY-211C),購自上海智城分析儀器制造有限公司。

    1.3 試驗設(shè)計 將30只小鼠隨機均分成3組,對照組、處理組1和處理組2,對照組不處理,將處理組1和處理組2的小鼠分裝至有蓋鼠籠中,放入恒溫培養(yǎng)震蕩器中,在35 ℃、160 r/min條件下分別持續(xù)處理2 h和6 h。處理結(jié)束后立即處死,無菌摘取脾臟放入液氮速凍,然后放入-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 檢測指標(biāo)及方法 細胞因子IL-2、IL-4、IL-6 和TNF-α以及HSP70含量均采用雙抗夾心法,參照ELISA試劑盒說明書進行檢測,用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值),以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo),濃度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出線性回歸方程,根據(jù)脾臟樣品測得的OD值,計算出細胞因子和HSP70的含量。

    1.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,試驗數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,P<0.05為差異顯著,P>0.05為差異不顯著;對各組數(shù)據(jù)進行LSD多重比較,同一行中小寫字母標(biāo)記相同的組之間表示差異不顯著(P>0.05);同一行中小寫字母標(biāo)記不同的組之間則表示差異顯著(P<0.05)

    2 結(jié)果

    應(yīng)激后小鼠出現(xiàn)明顯的運輸應(yīng)激臨床癥狀,如不安、狂躁、顫抖,被毛雜亂等。通過檢測細胞因子IL-2、IL-4、IL-6 和TNF-α以及HSP70含量,結(jié)果顯示,與對照組相比,處理組1和處理組2的IL-2含量均有升高趨勢,但差異均不顯著(P>0.05);處理組1的IL-4含量與對照組相比顯著降低(P<0.05),處理組2的含量下降,但無顯著差異(P=0.083);處理組1、2與對照組之間IL-6和HSP70含量均無顯著差異(P>0.05);處理組1與對照組相比TNF-α含量有升高趨勢,但差異不顯著(P>0.05),處理組2的含量則顯著升高(P<0.05)。見表1。

    表1 小鼠脾臟IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和HSP70的水平

    3 討論

    本試驗以小鼠為對象,模擬了實際運輸過程中應(yīng)激源對動物生理狀態(tài)的影響。試驗結(jié)果顯示,模擬運輸后,小鼠出現(xiàn)明顯的臨床癥狀,細胞因子水平發(fā)生了變化,這提示運輸應(yīng)激影響著動物的狀態(tài)。在實際運輸中,應(yīng)激源來源眾多,對機體的影響較為復(fù)雜,畜禽比如??赡芤虼耸艿蕉喾N損傷,尤其是犢牛在應(yīng)激條件下免疫力下降,極易感染多種傳染性疾病[5]。牛呼吸道系統(tǒng)疾病(BRD)是一個復(fù)雜的疾病,其特征是原發(fā)性病毒感染,然后是繼發(fā)性細菌感染。BRD涉及的病毒有牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)和皰疹病毒1型(BoHV-1)等[6]。BoHV-1又稱牛傳染性鼻氣管炎病毒,是造成牛經(jīng)濟損失的重要病毒之一。有研究表明,BRD的發(fā)病機制是BoHV-1先感染肺部,促炎細胞因子(IL-2、TNF-α)顯著升高,細菌隨后侵襲肺部,數(shù)小時內(nèi)發(fā)生膿毒癥,死亡率為30%~70%[7-9]。BRSV的發(fā)病機制與細胞因子的不同表達譜有關(guān),其抵抗力可能與促炎細胞因子的表達水平有關(guān),尤其是TNF-α、IL-4和IL-6[10]。因此應(yīng)該重視運輸應(yīng)激給畜禽如牛、羊帶來的健康問題,研究細胞因子與運輸應(yīng)激引起疾病的關(guān)系,為更好的預(yù)防疾病提供可靠依據(jù)。

    脾臟是重要的外周免疫器官,有產(chǎn)生淋巴細胞的功能,觀察應(yīng)激后脾臟細胞因子表達的變化及其調(diào)控機制,可以進一步深入闡明運輸應(yīng)激對小鼠免疫功能的影響。本試驗結(jié)果顯示,與對照組相比,運輸應(yīng)激2 h組脾臟組織中IL-4含量顯著降低(P<0.05), 運輸應(yīng)激6 h組也降低(P=0.083),而IL-4是輔助體液免疫和抗炎的主要細胞因子,說明機體的體液免疫受到一定抑制,且對脾臟可能產(chǎn)生一定的炎性反應(yīng)。司鴻飛[11]的研究表明,從分離出來的淋巴細胞內(nèi)檢測,架子牛運輸組與不運輸組相比,IL-4濃度極顯著降低,也證實了運輸應(yīng)激對機體免疫系統(tǒng)的影響。有研究表明,運輸應(yīng)激會導(dǎo)致試驗肉牛血清中促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、IFN-γ、IL-2濃度升高,TNF-α濃度降低[12]。運輸后豬的免疫機能發(fā)生變化,但運輸應(yīng)激對免疫機能的影響存在一定的時效性[13]。袁建彬等[14]的研究表明,不同時間的運輸應(yīng)激可導(dǎo)致肝臟和脾臟中HSP70與C反應(yīng)蛋白(CRP)的濃度升高,可作為肉牛運輸應(yīng)激候選診斷標(biāo)志物,說明脾臟對運輸應(yīng)激的影響有一定的標(biāo)志意義。本試驗發(fā)現(xiàn),與對照組相比,運輸應(yīng)激6 h組脾臟組織中TNF-α含量顯著升高(P<0.05), 2 h時其變化并不顯著,說明隨著運輸時間的延長,其對TNF-α含量變化有一定影響,TNF-α在一定的病理狀態(tài)(如慢性炎性疾病)下產(chǎn)生增多,其增高預(yù)示著對正常免疫功能的破壞,且脾臟可能產(chǎn)生了一定的病理變化。

    綜上所述,運輸應(yīng)激會導(dǎo)致小鼠脾臟中IL-4含量降低和TNF-α含量升高,其中2 h運輸應(yīng)激導(dǎo)致IL-4含量顯著降低,6 h的運輸應(yīng)激導(dǎo)致TNF-α含量顯著升高,這提示運輸對小鼠免疫功能有影響,脾臟IL-4和TNF-α的水平可以作為小鼠運輸應(yīng)激的候選評判分子指標(biāo)。

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