半枝蓮新克羅烷型二萜成分逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性研究

李錦梅，李丹丹，嚴(yán) 威，陳宣欽，李洪梅，李蓉濤，劉 丹

昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明650500

腫瘤細(xì)胞接觸抗癌化學(xué)藥物后產(chǎn)生的耐藥性，特別是多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)，這被認(rèn)為是腫瘤治療期間導(dǎo)致化療失敗的重要原因[1]。腫瘤多藥耐藥的機(jī)制比較復(fù)雜[2]，其中，ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運蛋白超家族與多藥耐藥密切相關(guān)，以P-糖蛋白(P-gp)過表達(dá)引起的藥物外排是產(chǎn)生MDR的主要機(jī)制[3]。

半枝蓮(ScutellariabarbataD.Don)為唇形科黃芩屬植物，中醫(yī)常以其全草入藥[4]，臨床用于治療癌癥，如人子宮平滑肌瘤、哺乳動物和卵巢癌的抗腫瘤治療等[5]。半枝蓮的藥理研究證實，其提取物在體外和體內(nèi)是肝癌的有效抑制劑[6]。從半枝蓮中分離得到的葉綠素a的衍生物，可以通過抑制P-糖蛋白的表達(dá)，并誘導(dǎo)HepG2的細(xì)胞周期阻滯來降低耐藥性[7]。本文從半枝蓮中分離獲得6個新克羅烷型二萜化合物，發(fā)現(xiàn)化合物1、2、3、6具有體外逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的活性，并對相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 提取和分離

半枝蓮干燥全草50 kg粉碎，95%乙醇冷浸提取三次，每次間隔24 h，合并提取液，減壓濃縮直至無乙醇味后用水溶解成混懸液，并用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取3次，減壓濃縮后回收溶劑，分別得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。氯仿萃取物用2 kg硅膠(100～200目)拌樣，10 kg硅膠(200～300目)填柱，用石油醚/丙酮(20∶1、10∶1、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、1∶1)梯度洗脫，應(yīng)用薄層色譜檢測合并得到8個餾分，即餾分A～H。F餾分(37.5 g)利用MCI脫色素后，反復(fù)利用正向柱和反向柱色譜及凝膠柱純化后，通過半制備HPLC的到化合物1(14.1 mg)、2(1.3 mg)、3(10.5 mg)、4(1.8 mg)、5(4.0 mg)和6(2.0 mg)，經(jīng)NMR核磁數(shù)據(jù)分析及參考文獻(xiàn)比對，確定化合物結(jié)構(gòu)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2和HepG2/Adr細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基(10%的胎牛血清和1%的青/鏈霉素雙抗)置于37 ℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長情況。耐藥細(xì)胞添加0.1 μg/mL Adr以維持耐藥性。

1.2.3 抗腫瘤活性測定

將對數(shù)生長期的HepG2和HepG2/Adr細(xì)胞,以1×104/孔接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，化合物1～6(20 μM)處理細(xì)胞48 h后，每孔加入20 μL(5 mg/mL)MTT，并于培養(yǎng)箱中孵育4 h，除去MTT和培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床避光搖勻，15分鐘之后使用SpetraMax M2酶標(biāo)儀，在490 nm下測量吸光值。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥測定

這類城市的人口及土地規(guī)模比例基本處于較為適宜的程度，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度的提高，有利于提升城市居民的生活品質(zhì)。所以此類城市，可適當(dāng)增加城市建成區(qū)的面積，方便轉(zhuǎn)接大城市或特大城市的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)移，以中高端產(chǎn)業(yè)發(fā)展為主。同時，應(yīng)積極借鑒中外大城市發(fā)展的經(jīng)驗，積極解決已經(jīng)出現(xiàn)的城市問題。

HepG2/Adr細(xì)胞接種到96孔板中，將濃度為0.1、1、10、30、60 μM的Adr分別與20 μM的化合物共同處理48小時。用“1.2.3”中MTT方法檢測細(xì)胞活度。其中，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(RF)值：單獨阿霉素的IC50/化合物與阿霉素聯(lián)用時的IC50，每個Adr濃度設(shè)置3個復(fù)孔，維拉帕米(20 μM)作為陽性對照。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)阿霉素積累

將HepG2/Adr細(xì)胞以1×104/孔的密度接種在96孔板中，并分成以下組：阿霉素(40 μM)處理組；化合物(20 μM)與阿霉素(40 μM)聯(lián)合用藥組；阿霉素(40 μM)與維拉帕米(20 μM)聯(lián)合用藥組。給藥后培養(yǎng)箱中孵育6 h，冰預(yù)冷的PBS避光洗滌細(xì)胞三次，使用倒置熒光顯微鏡觀察阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的積累情況，并采用SpetraMax M2酶標(biāo)儀測量細(xì)胞內(nèi)阿霉素的熒光值，激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為560 nm。

1.2.6 Western blotting分析

HepG2/Adr和HepG2細(xì)胞分別以密度3×105個/孔接種于12孔板，培養(yǎng)24 h并進(jìn)行藥物處理，48 h后收集細(xì)胞，裂解收集蛋白，上樣之后，利用聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)膜(硝酸纖維素膜：NC膜)，脫脂奶粉4 ℃室溫封閉1 h，低溫孵育一抗過夜(一抗按照1∶1 000比例稀釋)，次日，用PBST緩慢蕩洗3次，每次6 min；最后，用PBS洗膜1次，室溫孵育二抗1 h(二抗按照1∶2 000比例稀釋)，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑(試劑A和試劑B按照 1∶1 的比例)，使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯影，并用Image J對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果和分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色無定型粉末;C33H35NO7，ESI-MS：m/z557；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：1.36(1H，m，Ha-1)，1.66(1H，m，Hb-1)，2.12(1H，m，Ha-2)，1.96(1H，m，Hb-2)，5.22(1H，br s，H-3)，5.90(1H，d，J=10.1 Hz，H-6)，5.70(1H，d，J=10.1 Hz，H-7)，2.40(1H，br d，J=12.0 Hz，H-10)，6.42(1H，d，J=16.7 Hz，H-11)，6.46(1H，d，J=16.7 Hz，H-12)，5.92(1H，br s，H-14)，5.02(2H，br s，H-16)，1.09(3H，s，H-17)，1.70(3H，s，H-18)，1.39(3H，s，H-19)，1.28(3H，s，H-20)，2.79(H，br s，H-OH)，7.97(2H，dd，J=7.5，1.0 Hz，H-3′′，H-7′′)，7.47(2H，d，J=7.7 Hz，H-4′′，H-6′′)，7.60(1H，d，J=7.5 Hz，H-5′′)，9.14(1H，br s，H-3′′′)，8.68(1H，br d，J=4.8 Hz，H-5′′′)，7.23(1H，dd，J=4.7，7.7 Hz，H-6′′′)，8.07(1H，br d，J=7.7 Hz，H-7′′′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：19.3(CH2，C-1)，26.2(CH2，C-2)，123.(CH，C-3)，140.7(C，C-4)，43.4(C，C-5)，75.8(CH，C-6)，76.2(CH，C-7)，76.9(C，C-8)，48.3(C，C-9)，42.8(CH，C-10)，146.8(CH，C-11)，121.9(CH，C-12)，162.2(C，C-13)，115.0 9(CH，C-140)，174.1(C，C-15)，70.7(CH2，16)，22.5(CH3，C-17)，20.1(CH3，C-18)，17.4(CH3，C-19)，15.4 9(CH3，C-20)，165.1(C，C-1′′)，130.8(C，C-2′′)，129.6(CH，C-3′′，C-7′′)，128.9(CH，C-4′′，C-6′′)，133.8(CH，C-5′′)，164.1(C，C-1′′′)，126.1(C，C-2′′′)，150.8(CH，C-3′′′)，153.5(CH，C-5′′′)，123.3(CH，C-6′′′)，136.2(CH，C-7′′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]對照基本一致，故確定化合物1為scutebarbatine Y。

化合物2白色無定型粉末;C33H35NO7，ESI-MS：m/z557；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：1.35(1H，m，Ha-1)，1.66(1H，m，Hb-1)，2.04(2H，m，H-2)，5.25(1H，br s，H-3)，5.93(1H，d，J=10.8 Hz，H-6)，5.72(1H，d，J=10.8 Hz，H-7)，2.36(1H，br d，J=11.6 Hz，H-10)，6.46(1H，d，J=16.9 Hz，H-11)，6.40(1H，d，J=16.9 Hz，H-12)，5.94(1H，br s，H-14)，5.00(2H，br s，H-16)，1.07(3H，s，H-17)，1.68(3H，s，H-18)，1.41(3H，s，H-19)，1.28(3H，s，H-20)，8.99(1H，br s，H-3′′)8.62(1H，br d，J=4.6 Hz，H-5′′)，7.25(1H，dd，J=4.6，8.0 Hz，H-6′′)，8.15(1H，d，J=8.0 Hz，H-7′′)，8.84(2H，m，H-3′′′，H-7′′′)，7.34(2H，m，H-4′′′，H-6′′′)，7.49(1H，br t，J=7.6 Hz，H-5′′′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：19.8(CH2，C-1)，26.7(CH2，C-2)，123.2(CH，C-3)，140.7(C，C-4)，43.3(C，C-5)，76.2(CH，C-6)，75.5(CH，C-7)，76.2(C，C-8)，48.4(C，C-9)，42.4(CH，C-10)，140.7(CH，C-11)，120.2(CH，C-12)，164.3(C，C-13)，117.7(CH，C-14)，174.6(C，C-15)，73.7(CH2，C-16)，22.6(CH3，C-17)，20.1(CH3，C-18)，17.3(CH3，C-19)，14.1(CH3，C-20)，164.3(C，C-1′′)，126.0(C，C-2′′)，150.7(CH，C-3′′)，153.3(CH，C-5′′)，123.2(CH，C-6′′)，136.7(CH，C-7′′)，164.7(C，C-1′′′)，130.5(C，C-2′′′)，129.7(CH，C-3′′′，C-7′′′)，128.4(CH，C-4′′′，C-6′′′)，133.5(CH，C-5′′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]對照基本一致，故確定化合物2為scutebarbatine B。

化合物3白色無定型粉末;C33H35NO7，ESI-MS：m/z557；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：1.60(1H，m，Ha-1)，1.74(1H，m，Hb-1)，2.08(2H，m，H-2)，5.26(1H，br s，H-3)，5.90(1H，d，J=9.8 Hz，H-6)，5.73(1H，d，J=9.8 Hz，H-7)，2.41(1H，br d，J=12.3 Hz，H-10)，6.19(1H，d，J=17.0 Hz，H-11)，6.25(1H，d，J=17.0 Hz，H-12)，6.06(1H，br s，H-14)，4.80(1H，br d，Ha-16)，4.86(1H，br d，Hb-16)，1.17(3H，s，H-17)，1.58(3H，s，H-18)，1.42(3H，s，H-19)，1.28(3H，s，H-20)，9.20(1H，br s，H-3′′)，8.82(1H，br s，H-5′′)，7.45(1H，d，J=8.0 Hz，H-6′′)，8.26(1H，d，J=8.0 Hz，H-7′′)，7.84(2H，d，J=7.4 Hz，H-3′′′，H-7′′′)，7.35(2H，d，J=7.8 Hz，H-4′′′，H-6′′′)，7.48(1H，d，J=7.4 Hz，H-5′′′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：19.8(CH2，C-1)，26.1(CH2，C-2)，123.1(CH，C-3)，140.7(C，C-4)，43.3(C，C-5)，76.5(CH，C-6)，75.4(CH，C-7)，77.3(C，C-8)，50.8(C，C-9)，42.6(CH，C-10)，143.8(CH，C-11)，120.3(CH，C-12)，164.4(C，C-13)，117.9(CH，C-14)，174.4(C，C-15)，73.9(CH2，C-16)，22.7(CH3，C-17)，20.1(CH3，C-18)，17.5(CH3，C-19)，18.4(CH3，C-20)，165.0(C，C-1′′)，126.1(C，C-2′′)，151.7(CH，C-3′′)，154.3(CH，C-5′′)，123.4(CH，C-6′′)，138.4(CH，C-7′′)，164.8(C，C-1′′′)，128.6(C，C-2′′′)，129.9(CH，C-3′′′，C-7′′′，128.3(CH，C-4′′′，C-6′′′)，133.4(CH，C-5′′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對照基本一致，故確定化合物3為scutebartine F。

化合物4白色無定型粉末;C25H38O8，ESI-MS：m/z466；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：4.34(1H，dd，J=4.7，11.7 Hz，H-6)，4.38(1H，dd，J=5.6，11.8 Hz，H-11)，2.22(1H，m，H-13)，4.96(1H，d，J=5.6 Hz，H-15)，5.78(1H，d，J=5.3 Hz，H-16)，2.16(1H，d，J=3.9 Hz，Ha-18)，2.96(1H，dd，J=12.1 Hz，Ha-18)，4.35(1H，m，Ha-19)，4.87(1H，d，J=3.9，2.3 Hz，Ha-19)，0.90(3H，s，H-20)，1.94(3H，s，CH3CO)，2.10(3H，s，CH3CO)，3.32(3H，s，OCH3)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：22.2(CH2，C-1)，25.0(CH2，C-2)，39.6(CH2，C-3)，65.1(C，C-4)，45.5(C，C-5)，72.1(CH，C-6)，33.5(CH，C-7)，36.0(CH，C-8)，40.1(C，C-9)，48.3(CH，C-100)，83.3(CH，C-11)，32.1(CH2，C-12)，40.5(CH，C-13)，32.8(CH2，C-14)，104.9(CH，C-150，109.2(CH，C-16)，14.1(CH3，C-17)，48.5(CH2，C-18)，61.8(CH2，C-19)，16.3(CH3，C-20)，170.1(C=O，CH3CO)，21.2(CH3，CH3CO)，170.7(C=O，CH3CO)，21.2(CH3，CH3CO)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]對照基本一致，故確定化合物4為clerdinin B。

化合物5白色無定型粉末;C26H40O8，ESI-MS：m/z480；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：2.11(1H，m，H-1)，1.59(1H，m，H-1)，1.84(1H，m，H-20)，1.40(1H，m，H-2)，0.97(1H，m，H-3)，2.10(1H，m，H-3)，4.64(1H，dd，J=11.4，4.6 Hz，H-6)，1.42(1H，m，H-7)，1.66(1H，m，H-7)，0.90(1H，s，H-20)，1.42(1H，m，H-8)，1.61(1H，m，H-10)，3.97(1H，dd，J=12.0，4.0 Hz，H-11)，1.73(1H，m，H-12)，1.46(1H，m，H-12)，3.01(1H，m，H-13)，2.19(1H，m，H-14)，1.63(1H，m，H-14)，5.10(1H，d，J=4.8 Hz，H-15)，5.67(1H，d，J=5.4 Hz，H-16)，0.82(3H，s，H-17)，2.95(1H，dd，J=3.6，2.4 Hz，Ha-18)，2.20(1H，d，J=3.6 Hz，Ha-18)，4.37(1H，J=12.0 Hz，Ha-19)，4.85(1H，d，J=12.0 Hz，Ha-190)，0.92(3H，s，H-20)，1.90(3H，s，OCOCH3)，2.37(2H，dq，J=7.6，1.6 Hz，CH3CH2CO)，1.15(3H，t，J=7.6 Hz，CH3CH2CO)，3.30(3H，s，OCH3)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：22.7(CH2，C-1)，24.7(CH2，C-2)，31.9(CH2，C-3)，65.0(C，C-4)，45.4(C，C-5)，70.4(CH，C-6)，33.4(CH，C-7)，36.9(CH，C-8)，40.4(C，C-9)，48.5(CH，C-10)，85.1(CH，C-11)，31.4(CH2，C-12)，39.6(CH，C-13)，35.4(CH2，C-14)，103.6(CH，C-15)，109.4(CH，C-16)，16.4(CH3，C-17)，48.5(CH2，C-18)，62.9(CH2，C-19)，14.9(CH3，C-20)，170.1(C=O，CH3CO)，21.5(CH3，CH3CO)，174.2(C=O，CH3CH2CO)，27.5(CH2，CH3CH2CO)，15.1(CH3，CH3CH2CO)，55.3(CH3，15-OMe)。 以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]對照基本一致，故確定化合物5為scutellin A。

化合物6白色粉末;C33H35NO8，ESI-MS：m/z573；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：1.71(1H，m，Ha-1)，2.17(1H，m，Hb-1)，5.73(1H，m，H-2)，5.76(1H，br d，J=9.6 Hz，H-3)，6.41(1H，d，J=10.1 Hz，H-6)，5.92(1H，d，J=10.1 Hz，H-7)，2.36(1H，d，J=12.6 Hz，H-10)，6.41(1H，d，J=17.0 Hz，H-11)，6.44(1H，d，J=17.0 Hz，H-12)，5.94(1H，br s，H-14)，5.00(2H，s，H-16)，1.07(3H，s，H-17)，1.42(3H，s，H-18)，1.29(3H，s，H-19)，1.56(3H，s，H-20)，8.98(1H，br s，H-3′′)，8.63(1H，br d，J=4.6 Hz，H-5′′)，7.25(1H，dd，J=7.8，4.6 Hz，H-6′′)，8.03(1H，d，J=7.8 Hz，H-7′′)，7.86(2H，m，H-3′′′，H-7′′′)，7.34(2H，m，H-4′′′，H-6′′′)，7.49(1H，t，J=7.4 Hz，H-5′′′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：26.2(CH2，C-1)，123.1(CH，C-2)，133.5(CH，C-3)，77.0(C，C-4)，43.4(C，C-5)，75.8(CH，C-6)，76.8(CH，C-7)，77.8(C，C-8)，48.3(C，C-9)，42.8(CH，C-10)，146.6(CH，C-11)，122.0(CH，C-12)，162.0(C，C-13)，115.4(CH，C-14)，174.0(C，C-15)，70.7(CH2，C-16)，20.1(CH3，C-17)，22.6(CH3，C-18)，15.5(CH3，C-19)，17.1(CH3，C-20)，164.7(C，C-1′′)，125.3(C，C-2′′)，150.7(CH，C-3′′)，153.5(CH，C-5′′)，123.3(CH，C-6′′)，136.7(CH，C-7′′)，165.8(C，C-1′′′)，128.4(C，C-2′′′)，129.9(CH，C-3′′′，C-6′′′)，128.4(C，C-4′′′，C-7′′′)，133.4(CH，C-5′′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]對照基本一致，故確定化合物6為scutebarbatine C。

2.2 抗腫瘤活性的測定

本文利用MTT法評估了化合物對HepG2和HepG2/Adr細(xì)胞的抗腫瘤活性。結(jié)果如表1所示，化合物1～6在20 μM濃度下對HepG2和HepG2/Adr細(xì)胞沒有明顯殺傷作用，細(xì)胞的存活率均大于80%，即在<20 μM濃度下,該系列化合物也未有明顯的細(xì)胞毒性。

圖1 半枝蓮中新克羅烷型二萜化合物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of neo-clerodane diterpenoids from S.barbata

表1 化合物對HepG2和HepG2/Adr細(xì)胞的細(xì)胞活力影響

2.3 逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥測定

化合物1～6對HepG2/Adr細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果如表2所示，20μM化合物在與阿霉素聯(lián)用時，化合物1、2、3、6可以逆轉(zhuǎn)阿霉素對HepG2/Adr細(xì)胞的耐藥性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(RI)范圍為14.04～39.42，陽性藥物維拉帕米(陽性對照)的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(RI)為87.18。其中，化合物1和3的逆轉(zhuǎn)作用較為明顯，化合物2和6也表現(xiàn)出一定的逆轉(zhuǎn)活性。以上結(jié)果表明，化合物1、2、3、6具有體外逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用。

2.4 耐藥株HepG2/Adr細(xì)胞中P-糖蛋白的表達(dá)

根據(jù)報道，P-糖蛋白過表達(dá)引起藥物外排是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR的最主要機(jī)制之一。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測敏感株HepG2和耐藥株HepG2/Adr中P-糖蛋白的表達(dá)差異，結(jié)果證實，耐藥株HepG2/Adr中P-糖蛋白的表達(dá)顯著增加(如圖2)。

表2 HepG2/Adr細(xì)胞中阿霉素與化合物聯(lián)用的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)

圖2 HepG2和HepG2/Adr細(xì)胞中MDR1的表達(dá)Fig.2 Expression of MDR1 in HepG2 cells and HepG2/Adr cells

2.5 化合物對P-糖蛋白表達(dá)的影響

采用蛋白質(zhì)印跡法，考察半枝蓮新克羅烷型二萜對P-糖蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：化合物1～6處理HepG2/Adr細(xì)胞48 h，無論是單獨給藥還是與阿霉素聯(lián)合給藥，對P-糖蛋白的表達(dá)都未有明顯的影響(見圖3：A～D)，與對照組沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法評估MDR1的表達(dá)Fig.3 Western blotting to assess the expression of MDR1注：A和B：半枝蓮新克羅烷型二萜化合物1～6單獨給藥48小時對MDR1表達(dá)的影響；C和D：半枝蓮新克羅烷型二萜化合物1～6與阿霉素聯(lián)合給藥48 h對MDR1表達(dá)的影響。Note:A and B:The effect of neo-clerodane diterpenoids from S.barbata compounds 1-6 on MDR1 expression for 48 hours alone;C and D:The effect of neo-clerodane diterpenoids from S.barbata compounds 1-6 on the expression of MDR1 in combination with Adr for 48 hours.

2.6 細(xì)胞內(nèi)阿霉素積累實驗

采用熒光追蹤實驗研究化合物1～6對阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的積累的影響。結(jié)果顯示，Adr單獨處理HepG2/Adr細(xì)胞，Adr在細(xì)胞內(nèi)積累量極低，當(dāng)陽性藥物維拉帕米與Adr聯(lián)合用藥時，Adr在細(xì)胞內(nèi)的積累量明顯增加。當(dāng)用化合物1～6與Adr聯(lián)合用藥時，Adr在細(xì)胞內(nèi)的積累量同樣出現(xiàn)不同程度的增加，化合物1和3與Adr聯(lián)用時，Adr在HepG2/Adr細(xì)胞中內(nèi)積累增加最為明顯，其次為化合物2和6(見圖4：A和B)。

3 討論

圖4 阿霉素在HepG2/Adr細(xì)胞中的積累Fig.4 The accumulation of Adr in HepG2/Adr cell注：A：通過熒光顯微鏡觀察阿霉素的積累變化(200×)；B：HepG2/Adr細(xì)胞中Adr累積的熒光值(與Adr組比較：*P<0.05，**P<0.01，比例尺=300 μM。Note:A:The accumulation of Adr was measured by fluorescence microscopy;B:Fluorescence values of Adr accumulation in HepG2/Adr cells (Compared with the Adr group:*P<0.05,**P<0.01),scale bar=300 μm.

腫瘤的多藥耐藥是癌癥化療中普遍存在的問題，逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的多藥耐藥是克服化療藥物抗性和改善化療效果的有效方法[14]。目前的研究發(fā)現(xiàn)增加藥物外排的ABC家族轉(zhuǎn)運蛋白如P-糖蛋白(MDR1/ABCB1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP1/ABCC1)和乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白(BCRP/ABCG2)等在腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性方面發(fā)揮作用[15]；此外，多種酶類如蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT或PKB)、整聯(lián)蛋白連接激酶(ILK)等[16，17]以及細(xì)胞凋亡信號通路抑制，如凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2過表達(dá)以及p53基因突變等也與腫瘤多藥耐藥密切相關(guān)[18]。其中，以P-糖蛋白為代表的ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族所引起的藥物外排是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的最重要的原因[19]。P-糖蛋白是一種分子量約為170 kD的跨膜糖蛋白，具有能量依賴性“外排泵”的功能。P-糖蛋白一方面與藥物結(jié)合，另一方面通過與ATP結(jié)合，ATP供能，使細(xì)胞內(nèi)藥物泵出細(xì)胞外，減少了抗癌藥物在細(xì)胞內(nèi)的積累使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性[20]。因此，抑制P糖蛋白的表達(dá)或者干擾P-糖蛋白的外排功能均能有效的逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性[21]。本文從半枝蓮中分離鑒定了6個新克羅烷型二萜：scutebarbatine Y(1)、scutebarbatine B(2)、suctebartine F(3)、clerdinin B(4)、scutellin A(5)、scutehennanine D(6)(如圖1)。其中，化合物4為首次從半枝蓮中分離獲得。體外逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性研究發(fā)現(xiàn)，化合物1、2、3和6均顯示出可以逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞HepG2/Adr對Adr的耐藥性；蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示，在HepG2/Adr細(xì)胞中，P-糖蛋白的表達(dá)明顯升高，這可能是其產(chǎn)生耐藥性的主要原因。然而實驗發(fā)現(xiàn)幾種半枝蓮新克羅烷型二萜并不影響P-糖蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步我們通過熒光實驗發(fā)現(xiàn)，化合物確實能夠促進(jìn)阿霉素在耐藥細(xì)胞中的積累，減少藥物的外排，即干擾了P-糖蛋白對Adr的外排作用。因此，幾種化合物極可能是通過作為競爭性底物或干擾ATP功能抑制P-糖蛋白的外排功能來實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的。