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    中藥防風(fēng)抗流感病毒活性及不同極性部位的譜效相關(guān)性分析

    2020-05-16 04:24:24姜曉琳張繼秋徐瑞蕊蔣明浩亢倩麗鞏麗麗
    關(guān)鍵詞:防風(fēng)極性流感病毒

    姜曉琳,張繼秋,徐瑞蕊,蔣明浩,亢倩麗,楊 勇,鞏麗麗*

    1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,濟(jì)南 250355

    防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)(Saposhnikoviadivaricata(Trucz.) Schischk.)未抽花莖的干燥根。味辛、甘,微溫,歸膀胱、肝、脾經(jīng),有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙的功效[1,2]。防風(fēng)的化學(xué)成分主要包括色原酮類、香豆素類、有機(jī)酸、多糖類等[3,4]。Yao等[5]通過(guò)研究白芷、防風(fēng)、紫蘇葉單味藥材及配伍體外對(duì)呼吸道核胞病毒的影響,結(jié)果證明防風(fēng)具有抗呼吸道核胞病毒的活性,且與紫蘇配伍后效果顯著,但是關(guān)于其單一味藥抗病毒活性的藥效成分及作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)欲采用CPE法證實(shí)防風(fēng)單味藥的抗流感病毒活性及其抗流感病毒活性成分。近年來(lái)指紋圖譜技術(shù)用于中藥研究非常廣泛,能夠?qū)χ兴帍?fù)雜的化學(xué)成分進(jìn)行表征,但是無(wú)法體現(xiàn)與藥效的關(guān)聯(lián)性。中藥譜效關(guān)系學(xué)是將指紋圖譜與其藥效作用結(jié)合起來(lái),不僅可以使指紋圖譜中化學(xué)成分體現(xiàn)出相應(yīng)的藥效,而且還能闡明指紋圖譜特征與藥效的相互關(guān)系,確定相應(yīng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),從而使構(gòu)建的藥效指紋圖譜更有針對(duì)性的控制中藥質(zhì)量[6]。高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS)采用高效液相色譜對(duì)復(fù)雜混合物進(jìn)行快速分離,結(jié)合高性能四級(jí)桿的母離子選擇性與高分辨的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)Orbitrap檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品的定性和定量分析,具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)效率高等特點(diǎn)[7]。本實(shí)驗(yàn)建立防風(fēng)不同極性部位LC-MS指紋圖譜,比較不同極性部位的抗流感病毒活性,采用Spearman分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析及最小偏二乘回歸分析三種方法分析防風(fēng)不同極性部位與抗流感病毒活性的譜效關(guān)系,根據(jù)秩相關(guān)系數(shù)、關(guān)聯(lián)度及VIP值共同推斷出主要藥效成分,為防風(fēng)抗流感病毒藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會(huì)社);XMTD-204恒溫水浴鍋(天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠);1/10萬(wàn)電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);Centrifuge 5418離心機(jī)(Eppendorf公司);KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UltiMate 3000超高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo公司);UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS(美國(guó)Thermo公司);SD-CJ-ID生物安全柜(蘇州凈化設(shè)備廠);HF90 CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司);CKX-31倒置顯微鏡(olympus公司);TC20細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Bio-Rad公司);移液槍(Eppendorf公司)。

    1.2 材料

    防風(fēng)(批號(hào)2019.03.22),經(jīng)由山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室徐凌川教授鑒定為傘形科防風(fēng)屬植物防風(fēng)(Saposhnikoviadivaricata(Trucz.) Schischk.)的干燥根。環(huán)己烷(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);二氯甲烷(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);乙酸乙酯(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);正丁醇(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);甲醇(G,R,天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司);利巴韋林注射液(Rebavinrin injection,山東魯抗辰欣藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)1612246411,濃度50 mg/mL);酪氨酸(批號(hào)140609-200610,純度:99.57%)、咖啡酸(批號(hào)110885-201703,純度99.65%)、7-羥基香豆素(批號(hào)111739-200501,純度99.48%),均購(gòu)于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司;娃哈哈純凈水、蒸餾水;DMSO溶液(1427C108);DMEM培養(yǎng)基(Gibio公司);PBS緩沖溶液(Gibio公司);胰酶(Gibio公司);新生牛血清(ABW);青霉素和鏈霉素(Hyclone);MDCK細(xì)胞(由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所微生物室提供,本科室保存);H1N1病毒(2000年10月引自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所毒種室)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 防風(fēng)不同極性部位的制備

    稱取200 g防風(fēng)藥材,粉碎,過(guò)2和4號(hào)篩,得粗粉。加十倍量甲醇,超聲提取30 min,重復(fù)兩次,合并濾液,抽濾,得到濾液。減壓回收溶劑,得到浸膏。加入適量的蒸餾水,制成混懸液,然后依次用等量的環(huán)己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水各萃取兩次,得到各部位的萃取液。減壓回收各部位溶劑,得到各極性部位浸膏和粉末。

    2.2 防風(fēng)不同極性部位的抗病毒活性

    2.2.1 防風(fēng)不同極性部位供試品溶液的制備

    稱取防風(fēng)各極性部位浸膏適量,用DMEM培養(yǎng)基溶解,配成50 mg/mL的溶液。

    2.2.2 病毒毒力的測(cè)定

    將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK細(xì)胞用0.25%的胰酶消化,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/mL,每孔100 μL接種至96孔板,恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)長(zhǎng)至單層,棄掉培養(yǎng)液。依次加入10倍系列稀釋的H1N1病毒液100 μL,每個(gè)濃度重復(fù)四孔,同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照。在37 ℃,5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,各孔分別加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL,培養(yǎng)4 h,吸棄染液,加入DMSO溶液100 μL,室溫下脫色10 min,震蕩6 min,酶標(biāo)儀測(cè)490 nm下的OD值,根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算病毒的半數(shù)感染濃度TCID50。

    細(xì)胞存活率=各組OD值/正常細(xì)胞OD值×

    100%

    細(xì)胞比距=(高于50%病變率-50%)/

    (高于50%病變率-低于50%病率)×100%

    TCID50= Antilg(Ig高于50%CPE百分率病毒稀釋度+比距×稀釋因子對(duì)數(shù))

    2.2.3 藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用

    按照2.2.1中方法將防風(fēng)各極性部位藥物用DMEM培養(yǎng)基按2倍比稀釋10個(gè)濃度梯度,依次接種于MDCK細(xì)胞已經(jīng)長(zhǎng)成單層的96孔板中,每個(gè)濃度重復(fù)3孔,同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組,37 ℃,5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變程度,用MTT染色,用酶標(biāo)儀在490 nm下測(cè)定OD值,根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算細(xì)胞半數(shù)中毒濃度TC50,找到最大無(wú)毒濃度TC0。

    2.2.4 藥物體外抗病毒實(shí)驗(yàn)方法

    將1×104個(gè)/mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK細(xì)胞接種于96孔板上,每孔100 μL,待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,吸棄培養(yǎng)液,將藥物從最大無(wú)毒濃度開(kāi)始,按二倍比系列稀釋共12個(gè)濃度,設(shè)細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照、利巴韋林為陽(yáng)性對(duì)照(10 mg/mL),每個(gè)濃度重復(fù)3孔,除細(xì)胞對(duì)照外,各孔加入50 μL含100個(gè)TCID50的病毒液,混合均勻。37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察病毒對(duì)照組病變情況,待細(xì)胞出現(xiàn)90%及以上病變時(shí)采用CPE法記錄各組藥物抑毒情況,用MTT法測(cè)量OD值,根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算防風(fēng)各極性部位的半數(shù)有效濃度(EC50)及治療指數(shù)(TI),C為供試品初始濃度。

    EC50= [Antilog(高于50%CPE百分率病毒稀釋度的值-比距)]×C

    治療指數(shù)(TI)= 半數(shù)毒性濃度(TC50)/半數(shù)有效濃度(EC50)

    2.3 防風(fēng)不同極性部位LC-MS指紋圖譜的建立

    2.3.1 防風(fēng)不同極性部位供試品溶液的制備

    稱取防風(fēng)甲醇總提物及相當(dāng)于生藥量1 g的環(huán)己烷部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和萃取后水部位浸膏,用70%甲醇溶解,配成濃度分別為11.52、3.75、0.63、5.97、150.75 mg/mL的供試品溶液。

    2.3.2 LC-MS液質(zhì)條件

    Halo-C18柱(100 mm×2.1 mm,2.7 μm),流動(dòng)相0.05%甲酸水溶液(A)-0.05%甲酸乙腈溶液(B),梯度洗脫(0~4 min,5% B;4~8 min,5%→15% B;8~23 min,15%→75% B;23~28 min,75%→100% B;28~30 min,100% B),柱溫30℃,進(jìn)樣量3 μL,體積流量0.3 mL/min。源內(nèi)溫度320 ℃,輔助氣溫度350 ℃,S-lenS RF水平55%,分辨率70 000,質(zhì)譜掃描范圍m/z80~1 200。

    2.3.3 精密度試驗(yàn)

    取防風(fēng)甲醇總提物樣品制備供試品溶液1份,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,以7號(hào)峰為參照物峰,計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,其RSD值均小于3%,表明儀器精密度良好。

    2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

    取防風(fēng)甲醇總提物樣品制備供試品溶液6份,分別進(jìn)樣,記錄色譜圖,以7號(hào)峰為參照物峰,計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,其RSD值均小于3%,表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

    2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    取防風(fēng)甲醇總提物樣品制備供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,記錄色譜圖,以7號(hào)峰為參照物峰,計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,其RSD值均小于3%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.4 數(shù)據(jù)分析

    本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的Spearman分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析及偏最小二乘回歸分析采用Excel 2016、Simca-p 19.0軟件處理。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 抗流感病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    根據(jù)文獻(xiàn)[8],一般認(rèn)為TI值≥2.00,證明藥物有抗病毒活性,TI值≥4.00,其抗病毒成分有研究?jī)r(jià)值。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,防風(fēng)不同極性部位藥物對(duì)H1N1流感病毒均有不同程度的抑制作用,其中水部位藥物抗H1N1流感病毒活性最高,其TI值為54.32,甲醇總提物部位藥物抗H1N1流感病毒活性次之,其TI值為48.76,其他部位的抗H1N1流感病毒活性相對(duì)較弱,見(jiàn)表1

    3.2 數(shù)理統(tǒng)計(jì)與顯著性檢驗(yàn)

    本文表格中TC50、EC50由CPE觀察得到。采用SPSS 19.0軟件分析上述數(shù)據(jù)。選擇單因素方差分析,組間比較采用t檢驗(yàn),以P= 0.05為顯著性水準(zhǔn),分析結(jié)果見(jiàn)圖1。與陽(yáng)性對(duì)照藥利巴韋林(EC50為7.843 6 μg/mL,TI為36.25)比較,甲醇總提物與萃取水部位差異顯著(P< 0.05),抗流感病毒活性較強(qiáng)。

    3.3 樣品中成分的鑒定

    取“2.3.1”的供試品溶液,按照“2.3.2”的色譜條件進(jìn)行分析,得到防風(fēng)不同極性部位指紋圖譜,見(jiàn)圖2。使用Xcalibur 3.0軟件(Thermo公司,美國(guó))對(duì)高分辨質(zhì)譜信息進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及對(duì)照品的比對(duì)進(jìn)行峰的指認(rèn),最終確定了28個(gè)色譜峰所對(duì)應(yīng)的化合物,結(jié)果見(jiàn)表2。

    表1 防風(fēng)不同極性部位抗H1N1病毒活性的檢測(cè)結(jié)果

    圖1 防風(fēng)不同極性部位抗流感病毒TI值比較(t檢驗(yàn))Fig.1 Comparison of TI anti-influenza virus values in different polar parts of S.divaricata (t test)注:與S7比較:*P < 0.05。Note:Compared with S7,*P < 0.05.

    3.4 防風(fēng)不同極性部位抗流感病毒活性的譜效相關(guān)性分析

    3.4.1 防風(fēng)不同極性部位總離子流圖分析

    參考文獻(xiàn)及對(duì)照品,對(duì)照甲醇總提物色譜峰,環(huán)己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水部位分別鑒定出16、21、15、15、13個(gè)化合物,如表3。

    3.4.2 Spearman分析

    Spearman分析不僅能發(fā)現(xiàn)線性關(guān)系,也能發(fā)現(xiàn)單調(diào)的非線性關(guān)系;對(duì)分析的變量數(shù)據(jù)不需要正態(tài)性假設(shè),還可以適用于等級(jí)數(shù)據(jù)(無(wú)法定量的順序數(shù)據(jù));對(duì)異常數(shù)值敏感度低,因此,Spearman相關(guān)方法適用性更廣[17]。

    圖2 防風(fēng)不同極性部位在正離子模式下的UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS提取總離子流圖Fig.2 The extract ion chromatogram of in positive ion mode from S.divaricata different polar parts using UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS注:A:甲醇提取總部位;B:環(huán)己烷部位;C:二氯甲烷部位;D:乙酸乙酯部位;E:正丁醇部位;F:萃取后水部位。Note:A:Total part of methanol extraction;B:Cyclohexane part;C:Dichloromethane part;D.Ethyl acetate part;E:n-Butanol part;F:Water part after extraction.

    表2 防風(fēng)不同極性部位的LC-MS數(shù)據(jù)

    續(xù)表2(Continued Tab.2)

    No.tR(min)分子式Formula準(zhǔn)分子離子[M+H]+(m/z)測(cè)量值Calculated value質(zhì)譜數(shù)據(jù)Mass data(m/z)化學(xué)成分Compound2420.50C12H8O5233.044 4233.043 7174.045 5、218.021 7、235.063 45-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素[9]2520.51C19H20O5329.138 4329.138 283.049 7、229.084 8、247.095 3紫花前胡素[9]2620.54C17H16O5301.107 1301.107 169.071 0、218.021 2、233.044 6珊瑚菜素[9]2721.44C19H22O6347.148 9347.147 8217.048 0、259.094 03'-O-2-丁酰亥茅酚[10-13]2822.38C20H22O6359.148 9359.148 7200.236 5、279.158 73'-O-當(dāng)歸酰亥茅酚[10-13]

    注:*根據(jù)對(duì)照品確定的物質(zhì)。

    Note:*Substance identified by reference.

    表3 防風(fēng)不同極性部位化合物峰強(qiáng)度

    注:相應(yīng)保留時(shí)間下未檢測(cè)到的峰強(qiáng)度為“1”。

    Note:The peak intensity not detected at the corresponding retention time is "1".

    本實(shí)驗(yàn)將防風(fēng)不同極性部位化合物峰強(qiáng)度與抗流感病毒活性進(jìn)行相關(guān)性分析(P<0.05),參考文獻(xiàn)[18],計(jì)算Spearman秩相關(guān)系數(shù)(rs),如表4,|rs|≥0.8表示高度相關(guān),0.5≤|rs|<0.8表示中度相關(guān),0.3≤|rs|<0.5表示低度相關(guān),|rs|<0.3表示不相關(guān),rs為正表示正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)按照以上參數(shù)為標(biāo)準(zhǔn),確定1、5、6、7、10、11、12、13、20、24號(hào)峰與藥效作用相關(guān)。

    表4 Spearman秩相關(guān)系數(shù)(rs)

    3.4.3 灰色關(guān)聯(lián)度分析[19]

    本實(shí)驗(yàn)研究防風(fēng)不同極性部位化合物峰強(qiáng)度對(duì)流感病毒的抑制作用,將治療指數(shù)(TI)作為母序列,記為X0(k);不同極性部位化合物峰強(qiáng)度作為子序列,記為X1(k),X2(k),…,X28(k),n=1,2,…,6。采用歸一化法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理,Xi(k)=Xi(k)/Xi[SUM(1~k)],i=0,1,2,…,28。

    (1)關(guān)聯(lián)度系數(shù)計(jì)算

    ξi(k)=(△min+ρ*△max)/(△i(k)+ρ*max);△i(k)=∣Xi(k)-X0(k)∣

    △min=min∣X0(1)~Xi(k)∣,△max=max∣X0(1)~Xi(k)∣

    ρ為分辨系數(shù),0 ≤ρ≤ 1,通常取ρ=0.5

    將防風(fēng)不同極性部位化合物峰強(qiáng)度與抗流感病毒活性進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析,參考文獻(xiàn)[19],以γ≥0.75表示子序列對(duì)母序列有影響,計(jì)算關(guān)聯(lián)度γ,如表5。確定1、3、5、7、8、9、11、12、13、20、22、23、24、25、26、28號(hào)峰對(duì)抗流感病毒活性有影響。

    表5 灰色關(guān)聯(lián)度(γ)

    3.4.4 偏最小二乘回歸(PLSR)法分析

    偏最小二乘回歸(PLSR)分析法是從應(yīng)用領(lǐng)域中提出的一種新型多元數(shù)據(jù)分析方法。近十幾年來(lái),它在理論和應(yīng)用方面都已得到迅速的發(fā)展。偏最小二乘回歸分析主要適用于多因變量對(duì)多自變量的線性回歸建模,并可以有效地解決許多用普通多元性回歸無(wú)法解決的問(wèn)題[20]。本實(shí)驗(yàn)以防風(fēng)不同極性部位化合物峰強(qiáng)度為自變量,抗流感病毒活性為因變量,進(jìn)行譜效相關(guān)性分析。

    本實(shí)驗(yàn)利用SIMCA-P 19.0軟件,采用PLSR分析法進(jìn)行譜效相關(guān)性分析,計(jì)算得到28個(gè)特征峰與抗流感病毒活性的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)(圖2-A)和VIP值(圖2-B)。VIP>1時(shí),自變量在解釋因變量時(shí)具有重要意義[21]。由圖3可知,峰1、3、5、7、8、9、11、13、20、22、24、28的VIP值均大于1,且其回歸系數(shù)均為正相關(guān),故說(shuō)明這12個(gè)峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)對(duì)于細(xì)胞抗流感病毒作用有重要影響。

    4 討論

    本實(shí)驗(yàn)以防風(fēng)為研究對(duì)象,采用CPE法對(duì)防風(fēng)總提取物及不同極性部位進(jìn)行了體外抗流感病毒活性研究。根據(jù)測(cè)定的TI值,抗流感病毒活性順序?yàn)椋核课?甲醇總提物>正丁醇部位>環(huán)己烷部位>二氯甲烷部位>乙酸乙酯部位。為探究防風(fēng)中具體的抗流感病毒活性成分,本實(shí)驗(yàn)將防風(fēng)抗流感病毒TI值與不同極性部位的共有峰峰強(qiáng)度進(jìn)行譜效相關(guān)分析。采用Spearman簡(jiǎn)單相關(guān)對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步分析,而后運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度分析,但灰色關(guān)聯(lián)度分析對(duì)數(shù)據(jù)的要求較低,無(wú)法建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型。偏最小二乘回歸分析法集多元線性回歸、典型相關(guān)分析和主成分分析的基本功能于一體,可操作性高,建立的數(shù)學(xué)模型較為準(zhǔn)確,確保模型較好的精度所需包含的成分?jǐn)?shù)量,保證了模型的推廣性[22]。綜合上述分析方法的利弊,本實(shí)驗(yàn)聯(lián)用Spearman分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、偏最小二乘回歸分析三種方法,可以更全面地分析防風(fēng)不同極性部位與抗流感病毒活性的譜效關(guān)系,以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    本實(shí)驗(yàn)建立了防風(fēng)不同極性部位的LC-MS指紋圖譜,確定了28種化合物,將28種化合物對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度與抗流感病毒活性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)計(jì)算。由Spearman分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、偏最小二乘回歸分析方法共同得出1、5、7、11、13、20、24號(hào)峰對(duì)抗流感病毒活性有影響,即焦谷氨酸、divaricatacid、升麻苷、亥茅酚苷、補(bǔ)骨脂素、異嗪皮啶、5-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素。其中升麻苷、補(bǔ)骨脂素及5-羥基-8-甲氧基補(bǔ)骨脂素與文獻(xiàn)報(bào)道中發(fā)現(xiàn)的升麻苷、補(bǔ)骨脂素類化合物[23,24]具有一定的抗流感病毒能力相一致,進(jìn)一步論證了本實(shí)驗(yàn)的可靠性,由此可推測(cè),秩相關(guān)系數(shù)、關(guān)聯(lián)度、VIP值均高于升麻苷、補(bǔ)骨脂素的焦谷氨酸、divaricatacid、亥茅酚苷、異嗪皮啶同樣具有抗流感病毒活性,后期可利用細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)法對(duì)焦谷氨酸、divaricatacid、亥茅酚苷、異嗪皮啶四個(gè)單體成分的抗流感病毒活性進(jìn)行測(cè)定,進(jìn)一步確證其抗流感病毒活性。本實(shí)驗(yàn)為探究防風(fēng)的抗流感病毒作用機(jī)制提供參考依據(jù),為下一步深入研究防風(fēng)抗流感病毒活性物質(zhì)基礎(chǔ)及化學(xué)結(jié)構(gòu)提供初步方向。

    圖3 防風(fēng)PLSR標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)圖(A)和對(duì)藥效的VIP貢獻(xiàn)圖(B)Fig.3 PLSR normalized regression coefficient graph (A) and contribution of characteristic peaks of S.divaricata to VIP (B)

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