2018年安徽省部分地區(qū)散養(yǎng)雞群球蟲感染情況調(diào)查

郭海婷，林瑞慶，張衡，施之強(qiáng)，朱興全，耿照玉，李中原1,*

(1.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/廣西腦與認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541199；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；4.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

雞球蟲病是一種由艾美耳球蟲感染雞腸道上皮細(xì)胞引發(fā)的寄生性疾病，以出血性腸炎、雛雞感染易死亡和病原易產(chǎn)生耐藥為主要特征[1]。目前，全球公認(rèn)7種雞球蟲，分別為堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina)、布氏艾美耳球蟲(E.brunetti)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)、和緩艾美耳球蟲(E.mitis)、毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)、早熟艾美耳球蟲(E.praecox)和柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)，其中后者毒力最強(qiáng)。艾美耳球蟲對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害極大且容易暴發(fā)，全世界每年因雞球蟲感染所造成的經(jīng)濟(jì)損失不可估量[2]。加之，我國(guó)為養(yǎng)禽大國(guó)，禽類飼養(yǎng)方式多樣，家禽產(chǎn)品在人們生活中已不可或缺[3]。及時(shí)掌握艾美耳球蟲感染現(xiàn)狀對(duì)有效治療雞球蟲病、預(yù)防球蟲流行和保障人們生活質(zhì)量均有意義重要。

安徽省地處我國(guó)中東部，為暖溫帶和亞熱帶過(guò)渡區(qū)，地跨淮河、長(zhǎng)江和錢塘江三大水系，自然環(huán)境非常適合艾美耳球蟲孳生與繁殖，是我國(guó)華東地區(qū)雞球蟲病重點(diǎn)監(jiān)測(cè)省份之一[3]。此外，安徽省養(yǎng)雞規(guī)模大，除地面平養(yǎng)、網(wǎng)上平養(yǎng)和籠養(yǎng)外，散養(yǎng)雞較為常見(jiàn)并且一直深受消費(fèi)者青睞。值得注意的是，散養(yǎng)雞尤其是完全開(kāi)放式散養(yǎng)雞為艾美耳球蟲重要傳染源，在雞球蟲流行病學(xué)中作用不容忽視，與雞球蟲病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系緊密[4]。鑒于以往相關(guān)報(bào)道存在數(shù)據(jù)陳舊和調(diào)查區(qū)域狹窄等不足，不能及時(shí)、有效地反映安徽省雞球蟲的感染現(xiàn)狀[5-6]。因此，本研究于2018年5—6月間從亳州市譙城區(qū)等5個(gè)行政區(qū)的11個(gè)村落中隨機(jī)采集散養(yǎng)雞新鮮糞樣1 000份，經(jīng)提取基因組，運(yùn)用分子生物學(xué)方法對(duì)安徽省部分地區(qū)散養(yǎng)雞球蟲的感染現(xiàn)狀及各蟲株間混合感染類型進(jìn)行調(diào)查，以為我國(guó)華東地區(qū)雞球蟲病的防控與監(jiān)測(cè)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 雞球蟲公認(rèn)種DNA

早熟艾美耳球蟲DNA為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，其他6種公認(rèn)種DNA為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院林瑞慶副研究員惠贈(zèng)。

1.2 樣品采集

2018年5—6月，分別從安徽省亳州市譙城區(qū)、蚌埠市固鎮(zhèn)縣、合肥市肥東縣、安慶市潛山縣和宣城市宣州區(qū)5個(gè)行政區(qū)的11個(gè)村落中隨機(jī)采集14～60日齡散養(yǎng)雞群(未用球蟲疫苗)新鮮糞樣共計(jì)1 000份，隨即置于2.5%重鉻酸鉀溶液，輕搖混勻后4 ℃暫存?zhèn)溆?。其中，各采樣點(diǎn)散養(yǎng)雞數(shù)目均不低于500只/行政區(qū)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已公布的核苷酸序列，合成通用引物P1/P2(表1)，用PCR擴(kuò)增雞球蟲卵囊轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(internal transcribed spacer 1，ITS1)基因片段的方法，篩選出待檢糞樣中的雞球蟲陽(yáng)性樣品，其中，以雞球蟲標(biāo)準(zhǔn)株DNA為模板所得的預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為：堆型艾美耳球蟲502 bp、布氏艾美耳球蟲545 bp、巨型艾美耳球蟲546 bp和420 bp、和緩艾美耳球蟲621 bp和495 bp、毒害艾美耳球蟲689 bp、早熟艾美耳球蟲540 bp以及柔嫩艾美耳球蟲665 bp。隨后按照已報(bào)道文獻(xiàn)[7]，另委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成7對(duì)特異性引物即P3～P16(見(jiàn)表1)，進(jìn)一步對(duì)待檢糞便中所有雞球蟲ITS1陽(yáng)性樣品進(jìn)行鑒定與分型。

表1 檢測(cè)雞球蟲所用引物序列及預(yù)期片段大小

引物核酸序列(5′-3′)擴(kuò)增對(duì)象產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpP1AAGTTGCGTAAATAGAGCCCTCP2AGACATCCATTGCTGAAAGITS1-P3AGTCAGCCACACAATAATGGCAAACATGP4AGTCAGCCACAGCGAAAGACGTATGTGE.acervulina811P5CCGCCCAAACAGCAAGAGACAGAP6CCGCCCAAACGAAGGTGGAATE.brunetti601P7ACGAGAGGCAATGAAAGCAAACTGTP8ACGAGAGGCAGAGGACCGTGTACAE.maxima615P9AGTCAGCCACCAGTAGAGCCAATATTTP10AGTCAGCCACAAACAAATTCAAACTCTACE.mitis460P11AAGAGGCCAGTGGTGATTCACGGTATP12AAGAGGCCAGCAGAAACAGAAATGATTACE.necatrix702P13GGGTAACGCCACATCCAATGCGATATAGP14GGGTAACGCCTCCAACGCTCGCE.praecox1108P15AGTCAGCCACAGCGGGGATGP16AGTCAGCCACGTACTATCTAAACCAACCAE.tenella590

注：-代表數(shù)據(jù)未列出

1.4 DNA提取

所得糞樣經(jīng)12 000 r/min離心1 min洗滌3次后用來(lái)提取基因組，抽提方法參考Omega bio-tek公司E.Z.N.A.?Stool DNA Kit使用說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 PCR擴(kuò)增

鑒定雞球蟲感染類型和擴(kuò)增ITS1片段的PCR反應(yīng)體系均為：Premix rTaq 12.5 μL，上游/下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，補(bǔ)加ddH2O至25.0 μL；同設(shè)空白對(duì)照組。ITS1擴(kuò)增條件為95.0 ℃預(yù)變性5 min；95.0 ℃變性30 s，53.5 ℃退火30 s，72.0 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)；72.0 ℃總延伸10 min。鑒定球蟲感染類型的PCR擴(kuò)增條件為：95.0 ℃預(yù)變性5 min；95.0 ℃變性45 s，58.6 ℃退火30 s，72.0 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72.0 ℃總延伸5 min。所得產(chǎn)物運(yùn)用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 序列測(cè)定

測(cè)序工作亦由生工生物工程(上海)股份有限公司負(fù)責(zé)完成。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Microsoft Excel 2016工具和SPSS 22.0軟件分區(qū)統(tǒng)計(jì)各散養(yǎng)雞群中球蟲總體感染情況及公認(rèn)蟲株間混合感染類型，感染率比較時(shí)采用2 × 2列聯(lián)表即χ檢驗(yàn)進(jìn)行，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞球蟲公認(rèn)種ITS1片段的PCR擴(kuò)增

為檢測(cè)所得散養(yǎng)雞群糞樣中球蟲的整體感染情況，參考已公布序列，合成用來(lái)特異性擴(kuò)增雞球蟲ITS1基因片段的通用引物P1/P2并進(jìn)行PCR反應(yīng)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。凝膠電泳和測(cè)序結(jié)果顯示，分別以堆型、布氏、巨型、和緩、毒害、早熟和柔嫩艾美耳球蟲公認(rèn)種DNA為模板，可依次獲得長(zhǎng)度為502 bp(堆型)、545 bp(布氏)、546 bp和420 bp(巨型)、621 bp和495 bp(和緩)、689 bp(毒害)、540 bp(早熟)以及665 bp(柔嫩)的單一或成對(duì)條帶，且空白對(duì)照組無(wú)此類條帶出現(xiàn)，與預(yù)期結(jié)果相一致，其中電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，運(yùn)用所設(shè)通用引物P1/P2對(duì)雞球蟲ITS1基因片段進(jìn)行的PCR擴(kuò)增能夠用來(lái)評(píng)價(jià)待檢樣品中雞球蟲的總體感染情況。

M.DNA Marker；1～7.依次為堆型、布氏、巨型、和緩、毒害、早熟和柔嫩艾美耳球蟲公認(rèn)種DNA PCR產(chǎn)物；8.空白對(duì)照

圖1 通用引物特異擴(kuò)增雞球蟲公認(rèn)種ITS1基因片段

2.2 PCR擴(kuò)增雞球蟲公認(rèn)種的特異性片段

依照文獻(xiàn)[7]，另合成7對(duì)特異性引物，分別用于鑒定散養(yǎng)雞群球蟲陽(yáng)性糞樣中各蟲株的混合感染類型。為檢測(cè)所用引物的特異性程度，分別用7對(duì)引物即P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/P10、P11/P12、P13/P14和P15/P16對(duì)堆型、布氏、巨型、和緩、毒害、早熟及柔嫩艾美耳球蟲公認(rèn)種基因組進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，同設(shè)陰性對(duì)照組即其他6種標(biāo)準(zhǔn)株DNA混合物和空白對(duì)照組。電泳和測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增以上7種雞球蟲公認(rèn)種DNA時(shí)，分別可獲得長(zhǎng)度為811 bp、601 bp、615 bp、460 bp、702 bp、1 108 bp和590 bp的單一條帶，且陰性對(duì)照和空白對(duì)照組均無(wú)此類條帶出現(xiàn)，與已報(bào)道文獻(xiàn)[7]結(jié)論相符，其中電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。由此可見(jiàn)，所合成的7對(duì)引物均特異性強(qiáng)，適合用來(lái)鑒定雞球蟲陽(yáng)性樣品中各蟲株間混合感染情況。

A～G.分別為堆型、布氏、巨型、和緩、毒害、早熟和柔嫩艾美耳球蟲公認(rèn)種特異性引物的擴(kuò)增結(jié)果；M.DNA Marker；1.陽(yáng)性DNA；2.其他6種標(biāo)準(zhǔn)株DNA混合物；3.空白對(duì)照

圖2 7種雞球蟲公認(rèn)種特異性片段的PCR擴(kuò)增

2.3 總感染情況

從安徽省5個(gè)行政區(qū)的11個(gè)村落中共采集散養(yǎng)雞糞樣1 000份，單個(gè)區(qū)、縣散養(yǎng)雞數(shù)目均不低于500只。表2結(jié)果顯示，共檢出雞球蟲陽(yáng)性病例111份，包含雞的全部艾美耳球蟲公認(rèn)種，總感染率為11.10%。其中：合肥市肥東縣球蟲感染率最高(40.23%)，其次為亳州市譙城區(qū)(8.44%)、蚌埠市固鎮(zhèn)縣(6.57%)、宣城市宣州區(qū)(3.19%)，安慶市潛山縣最低(1.00%)。差異顯著性分析結(jié)果顯示，除蚌埠市固鎮(zhèn)縣所得散養(yǎng)雞糞樣分別與亳州市譙城區(qū)、宣城市宣州區(qū)之間，以及宣城市宣州區(qū)與安慶市潛山縣之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.550、2.409、2.305，P>0.05)外，其他各調(diào)查點(diǎn)間雞球蟲的總感染率均差異明顯(亳州譙城與合肥肥東、安慶潛山、宣城宣州：χ2=57.202、12.493、4.970；蚌埠固鎮(zhèn)與合肥肥東、安慶潛山：χ2=63.837、8.602；合肥肥東與安慶潛山、宣城宣州：χ2=92.118、74.738，P<0.05)。

2.4 混合感染

由表3可見(jiàn)，亳州市譙城區(qū)19份陽(yáng)性樣品中包含單一蟲種感染病例10份和混合感染病例9份，其中布氏艾美耳球蟲與巨型、毒害、早熟艾美耳球蟲共同感染病例各1份、3份、2份，毒害與早熟艾美耳球蟲共同感染1份；檢出3種蟲種混合感染病例2份，即布氏或巨型艾美耳球蟲分別與毒害和早熟艾美耳球蟲共感染各1例。

蚌埠市固鎮(zhèn)縣雞球蟲混合感染程度不強(qiáng)，僅檢出1份混合感染病例即堆型艾美耳球蟲與毒害艾美耳球蟲，其他13份均屬于單一蟲種感染類型。

合肥市肥東縣散養(yǎng)雞球蟲檢出率最高且感染類型復(fù)雜，除檢出2種蟲種混合感染病例13份和3種蟲種混合感染病例12份外，還檢測(cè)到4種雞球蟲共同感染病例2份(布氏艾美耳球蟲與毒害艾美耳球蟲與早熟艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲或柔嫩艾美耳球蟲各1例)，剩余43份陽(yáng)性樣品均屬單一蟲種感染類型。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，安慶市潛山縣散養(yǎng)雞球蟲感染率最低，2份樣品呈球蟲陽(yáng)性，并無(wú)混合感染情況出現(xiàn)。宣城市宣州區(qū)6份陽(yáng)性樣品中包括單一蟲種感染病例2份和混合感染病例4份，其中2種混合感染3份、3種蟲種共同感染1份。

表2 安徽省部分地區(qū)散養(yǎng)雞群球蟲的總體感染情況

行政區(qū)樣品數(shù)感染率/%艾美耳球蟲各蟲株檢出率/%堆型布氏巨型和緩毒害早熟柔嫩亳州譙城2258.44-6.670.89-3.562.22-蚌埠固鎮(zhèn)2136.570.472.35-0.473.290.47-合肥肥東17440.23-13.222.30-38.519.201.72安慶潛山2001.00-0.50--0.50--宣城宣州1883.19-2.660.53--2.66-合計(jì)100011.100.104.900.700.108.302.700.30

注：-代表無(wú)數(shù)據(jù)

表3 安徽省部分地區(qū)散養(yǎng)雞群球蟲的混合感染狀況

行政區(qū)蟲株堆型布氏巨型和緩毒害早熟柔嫩亳州譙城布氏-8/191/19-3/192/191/19-巨型-?--1/19-毒害-?--2/191/19-蚌埠固鎮(zhèn)布氏-5/14-----和緩---1/14---毒害1/14---6/14--早熟-----1/14-合肥肥東布氏-1/70毒害-8/70早熟-1/70 3/70 -1/70 -?-41/70-4/707/70 1/701/70 --1/701/70 安慶潛山布氏-1/2-----毒害----1/2--宣城宣州布氏-1/6早熟-?1/6--3/6---1/6-

注：*表示數(shù)據(jù)已被統(tǒng)計(jì)，-代表無(wú)數(shù)據(jù)

3 討論

作為我國(guó)生態(tài)養(yǎng)雞的一種主要形式，散養(yǎng)雞常在林下、村邊、溪旁和田間等開(kāi)放區(qū)域活動(dòng)，多以粗糧、草種和昆蟲為食，運(yùn)動(dòng)量大，活動(dòng)范圍廣，肉、蛋產(chǎn)品均營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，是農(nóng)民朋友脫貧攻堅(jiān)和發(fā)家致富的重要經(jīng)濟(jì)來(lái)源[8]。值得注意的是，艾美耳球蟲環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，分布范圍廣，高溫多雨季節(jié)里易暴發(fā)，卵囊常藏匿于飼料、飲水或土壤之中，一旦攝入即可感染，是散養(yǎng)雞最為常見(jiàn)且危害極大的一種寄生性原蟲[9]?？梢?jiàn)，及時(shí)掌握散養(yǎng)雞群艾美耳球蟲感染現(xiàn)狀對(duì)雞球蟲病防治和農(nóng)民創(chuàng)收均意義重大。

如前所述，安徽省為我國(guó)華東地區(qū)雞球蟲病重點(diǎn)監(jiān)測(cè)省份，省內(nèi)村落密集，自然生態(tài)環(huán)境適合球蟲孳生繁殖，散養(yǎng)雞尤其是完全開(kāi)放式散養(yǎng)雞資源非常豐富。加之，散養(yǎng)雞艾美耳球蟲流行病學(xué)地位重要和以往報(bào)道已不能及時(shí)有效地反映該省散養(yǎng)雞球蟲感染現(xiàn)狀[5]。因此，本研究選擇在高溫多雨季節(jié)即5—6月間，從安徽省亳州市譙城區(qū)、蚌埠市固鎮(zhèn)縣、合肥市肥東縣、安慶市潛山縣和宣城市宣州區(qū)5個(gè)行政區(qū)11個(gè)村落14～60日齡散養(yǎng)雞群中隨機(jī)采集新鮮糞樣，經(jīng)提取DNA和特異性PCR擴(kuò)增，對(duì)安徽省上述地區(qū)散養(yǎng)雞球蟲感染現(xiàn)狀及其所屬類型進(jìn)行調(diào)查和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，所得1 000份雞糞樣品中共檢出艾美耳球蟲陽(yáng)性病例111份，總感染率為11.10%，其中譙城、固鎮(zhèn)、肥東、潛山和宣州各為19例、14例、70例、2例和6例，感染率分別為8.44%、6.57%、40.23%、1.00%和3.19%，均低于同期以往報(bào)道[10]。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，固鎮(zhèn)所得糞樣分別與譙城、宣州間以及宣州與潛山間差異不明顯，其他調(diào)查點(diǎn)之間雞球蟲感染率則差異顯著，表明安徽省不同行政區(qū)間散養(yǎng)雞球蟲的感染率差異較大。

為了鑒定散養(yǎng)雞群中球蟲陽(yáng)性樣品所屬感染類型，本研究還依照已報(bào)道文獻(xiàn)[7]，另合成7對(duì)參考引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，此次調(diào)查一次性檢出了雞的全部艾美耳球蟲公認(rèn)種，其中布氏艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲和早熟艾美耳球蟲為優(yōu)勢(shì)感染蟲種，調(diào)查點(diǎn)蚌埠固鎮(zhèn)和合肥肥東分別為堆型、和緩2種艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲的唯一檢出地；除蚌埠固鎮(zhèn)和安慶潛山散養(yǎng)雞球蟲感染類型較為單一外，其他調(diào)查點(diǎn)以2種及以上蟲株共感染方式為主，未檢到5種及以上蟲株混合感染類型。

需要說(shuō)明的是，在鑒定球蟲陽(yáng)性樣品所屬類型前，為檢測(cè)所用引物是否特異，分別以堆型艾美耳球蟲、布氏艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、早熟艾美耳球蟲及柔嫩艾美耳球蟲公認(rèn)種DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，同設(shè)陰性對(duì)照即其他6種標(biāo)準(zhǔn)株DNA混合物和空白對(duì)照。電泳和測(cè)序結(jié)果顯示，所得條帶長(zhǎng)度均與預(yù)期一致，且對(duì)照組無(wú)此類條帶，用上述引物對(duì)雞糞陰性樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)亦無(wú)條帶出現(xiàn)，表明所合引物特異性強(qiáng)，適合用來(lái)鑒定雞球蟲混合感染類型。

綜上，本研究通過(guò)對(duì)安徽省部分地區(qū)散養(yǎng)雞群球蟲的感染現(xiàn)狀進(jìn)行調(diào)查，為日后安徽省甚至整個(gè)華東地區(qū)散養(yǎng)雞群球蟲病的監(jiān)測(cè)與防控提供了重要依據(jù)。