1株禽4型腺病毒JS株的分離鑒定

陳雨晴，曹潔，王玉峰，宋素泉，閆麗萍

(教育部動(dòng)物健康與食品安全國(guó)際聯(lián)合試驗(yàn)室/江蘇省動(dòng)物免疫工程試驗(yàn)室/江蘇省陸生野生動(dòng)物疫源疫病檢測(cè)中心/南京農(nóng)業(yè)大學(xué)免疫研究所/南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬成員，是呈二十面體對(duì)稱(chēng)的無(wú)囊膜雙股DNA病毒[1-2]。它由核蛋白、衣殼蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成。其中Hexon是病毒表面含量最多的蛋白，常用于做禽腺病毒的進(jìn)化分析[3]。根據(jù)血清交叉中和試驗(yàn)和基因組分析顯示禽腺病毒可分為A～E 5個(gè)種，12個(gè)血清型(1～7、8a、8b、9～11)。其中，血清1型(fowl adenovirus serotype 1，F(xiàn)AdV-1)和血清4型(fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4)主要引起禽類(lèi)的肌胃糜爛或潰瘍和心包積液肝炎綜合征(hydropericardium hepatitis syndrome，HHS)。而血清2、7、8a、8b、11型則在世界范圍內(nèi)引起包涵體肝炎(inclusion body hepatitis, IBH)[4]。HHS在雞群中的感染率很高，其中肉雞的死亡率在10%～100%之間[5]。該病一般發(fā)生于3～5周齡肉雞中，其癥狀主要表現(xiàn)為心臟表面被黃色透明液體包裹，心臟畸形且變軟，心包黃染伴有出血點(diǎn)。一般患有心包積液的病雞其肝臟也伴有病變，如肝臟腫大充血、腎臟腫大出血等[6]。

禽腺病毒主要感染蛋雞、肉雞、鵝和鴕鳥(niǎo)。2007年之前，IBH在我國(guó)多呈散發(fā)，并未造成嚴(yán)重?fù)p失；2007至2014年，IBH呈地方性流行，個(gè)別雞場(chǎng)發(fā)病率可達(dá)30%，死亡率15%；從2015年開(kāi)始，F(xiàn)AdV-4在我國(guó)大范圍流行并引起了IBH和HHS，造成雞群大量死亡，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。經(jīng)流行病學(xué)分析顯示FAdV-4主要在我國(guó)北部和東部流行[8]。由于有一些弱毒感染雞群后不導(dǎo)致雞群發(fā)病，而水禽又是FAdV的天然儲(chǔ)存庫(kù)，這些因素可能是導(dǎo)致FAdV-4大流行的原因[1]。2015年以來(lái)已有一些文獻(xiàn)報(bào)道了高毒力禽腺病毒，但其研究大多在流行病學(xué)調(diào)查、進(jìn)化分析以及治療上[9-10]，少有文章對(duì)病毒的致病力進(jìn)行研究。本研究從江蘇省某發(fā)病雞場(chǎng)分離獲得1株禽腺病毒，并將其分離后進(jìn)行致病性試驗(yàn)，為進(jìn)一步預(yù)防和治療該病提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株及試驗(yàn)動(dòng)物

取病雞肝臟0.1 g用無(wú)菌PBS進(jìn)行研磨，制備成肝臟組織勻漿后-20 ℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min 離心10 min，取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆?。將上清?∶1 000感染雞肝癌細(xì)胞(LMH)，48 h后80%細(xì)胞變圓脫落，收集上清凍于-80 ℃。21日齡SPF雞由廣西麗原生物有限公司提供。

1.2 主要試劑

DMEM粉末購(gòu)自Gibco公司；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase和HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit購(gòu)自Vazyme公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自KPL公司；引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒分離

LMH用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。將處理好的病料接種于長(zhǎng)滿單層的LMH細(xì)胞，在37 ℃吸附1 h后棄上清，加入細(xì)胞維持液(DMEM+ 2%FBS)，于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)，連續(xù)在LMH細(xì)胞上傳代3次后，將病毒進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行致病性試驗(yàn)。

1.4 病毒DNA的提取

將病毒按1∶1 000接種LMH細(xì)胞，待80%左右細(xì)胞出現(xiàn)病變后，將細(xì)胞凍融2次后分裝于保種管中，按上海生工柱式病毒DNA提取試劑盒說(shuō)明提取DNA，于-40 ℃保存。

1.5 FAdV-4 Hexon基因的PCR和序列測(cè)定

以GenBank中的FAdV-4全基因組序列(GenBank登錄號(hào)KU558760)為參考，使用Primer Premier 5軟件，設(shè)計(jì)覆蓋Hexon基因的引物(Hexon-F：5′-ATGGCGGCCCTCACGCCCG-3′；Hexon-R：5′-TTACACGGCGTTGCCTGTGGCGAAA-3′)，擴(kuò)增片段大小為2 814 bp。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。以提取的病毒DNA為模板，加入合成的引物，按照Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase說(shuō)明書(shū)配置50 μL PCR體系進(jìn)行Hexon結(jié)構(gòu)蛋白基因DNA的擴(kuò)增。PCR結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠鑒定，切下目的條帶，按照AXYGEN瓊脂糖凝膠回收試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行DNA的回收。將回收的基因片段送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 FAdV-4 Hexon基因序列進(jìn)化樹(shù)分析

利用MEGA 7.0軟件將分離株的Hexon基因核酸序列與GenBank收錄的不同時(shí)期和地點(diǎn)的禽腺病毒的核酸序列進(jìn)行遺傳演化分析。具體參考毒株信息見(jiàn)表1。

表1 參考毒株信息

毒株血清型基因型GenBank登錄號(hào)年份國(guó)家ON1C4GU188428.12011加拿大JSJ13C4KM096544.12013中國(guó)HB1510C4KU587519.12016中國(guó)HNJZC4KU5587602015中國(guó)SCnj1601C4KY927938.12018中國(guó)SDJN0105C4MN1024132019中國(guó)SCcz1501C4KY9279362017中國(guó)HNSQC4KX640910.12016中國(guó)PK-01C4EU931693.12008印度KR5C4HE608152.12012澳大利亞U26221.1C10U26221.12000美國(guó)K181/10A1JN181575.12012韓國(guó)CELOA1U46933.11996澳大利亞340B5KC493646.12013澳大利亞X11D11AF339920.12001比利時(shí)764D9AF508958.22004比利時(shí)685D2AF508947.12004比利時(shí)CR119E6AF508954.22016比利時(shí)

1.7 病毒滴度的測(cè)定

LMH細(xì)胞傳至96孔板細(xì)胞單層80%～90%，將病毒液稀釋至10-2～10-10，每一稀釋度接種8孔，每孔100 μL，對(duì)照組加100 μL細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，37 ℃孵育1 h后換成含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液，觀察3～5 d，記錄細(xì)胞病變情況，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.8 病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定

按MOI=0.01的病毒量接種長(zhǎng)滿單層LMH細(xì)胞的12孔板，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 h 后換成含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液，分別在接種病毒后的不同時(shí)間點(diǎn)(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h)收取細(xì)胞上清，37 ℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min 離心15 min，收取上清液，測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收取上清的TCID50，共重復(fù)3次。

1.9 病毒對(duì)雞的致病性試驗(yàn)

選用純化后第4代毒株測(cè)定分離株對(duì)21日齡SPF雞的致病力，測(cè)定時(shí)分別各選取SPF雞30只，隨機(jī)分成3組(表2)，每組10只，采取肌肉注射或口服方法分別用含有106.0個(gè)TCID50的病毒液進(jìn)行攻毒。觀察14 d，記錄臨床癥狀和鼻、咽拭子排毒情況。采集的鼻拭子放入1 mL PBS中，凍融一次后，充分振蕩，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液提取DNA，進(jìn)行qPCR檢測(cè)是否排毒，引物5′-AGTGTGTATGTGCGTTGGGTAG-3和 5′-CATTGTCATAACGATGGTGTAG-3′[11]。

表2 FAdV-4 動(dòng)物試驗(yàn)分組

組別毒種毒量接種方式ⅠPBS-肌注5只,口服5只ⅡF4200μL 106.0TCID50肌注ⅢF4200μL 106.0TCID50口服

2 結(jié)果

2.1 病毒分離與純化

肝組織樣品處理液接種于長(zhǎng)滿單層的LMH細(xì)胞36 h后就能觀察到細(xì)胞病變，病變細(xì)胞初期呈網(wǎng)格狀，病變范圍逐漸擴(kuò)大，細(xì)胞出現(xiàn)融合，有明顯的合胞體，最后變圓脫落，待病變穩(wěn)定后獲得一株純化的病毒，命名為JS株。

2.2 病毒Hexon基因序列分析

以提取的分離株病毒DNA為模板，用合成的引物分別擴(kuò)增出2 814 bp大小的特異性條帶，測(cè)序結(jié)果表明是FAdV-4 Hexon基因序列，與GenBank收錄的不同時(shí)期和不同地點(diǎn)分離的FAdV-4 Hexon的基因進(jìn)化樹(shù)分析(圖1)，結(jié)果顯示：毒株FAdV-4 JS與我國(guó)主要流行的Ⅰ群禽腺病毒C基因型毒株(CH/HNJZ/2015、JSJ13、SDJN0105、HNSQ、HB15101、SCnj1601等)以及印度株P(guān)K-01的同源性最高，在同一分支上；與加拿大分離株ON1以及澳大利亞分離株KR5共屬于一個(gè)大的分支，同源性為96%。表明JS株為我國(guó)FAdV-4國(guó)內(nèi)流行株。

圖1 FAdV-4 Hexon基因進(jìn)化樹(shù)分析

2.3 病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

FAdV-4 JS株在LMH細(xì)胞上生長(zhǎng)良好，以0.01 MOI接種病毒72 h后病毒滴度為107.0TCID50/0.1 mL，最高達(dá)到108.0TCID50/0.1 mL(圖2)。

2.4 對(duì)雞的致病性

第Ⅱ組雞從攻毒后第2天開(kāi)始有發(fā)病死亡，其中死亡2只，其他7只雞均有不同程度的精神萎靡，沉郁等癥狀；攻毒后第3天又死亡7只，另1只有精神輕度沉郁，且隨時(shí)間推移，該雞恢復(fù)正常，死亡率為90%。第Ⅰ組和Ⅲ組雞沒(méi)有出現(xiàn)任何癥狀，死亡率為0。對(duì)其進(jìn)行打分并繪制折線圖，其中精神，無(wú)癥狀0分，輕度沉郁1分，非常沉郁2分，極度虛脫3分，死亡4分，結(jié)果見(jiàn)圖3。

解剖病死雞，發(fā)現(xiàn)第Ⅱ組雞均有不同程度的心包積液，肝臟黃染肥大，腎腫大且有點(diǎn)狀出血，脾臟出血腫大等明顯癥狀。剖檢第Ⅲ組雞，發(fā)現(xiàn)其肝臟黃染，但其他部位未見(jiàn)明顯病變。

試驗(yàn)結(jié)束后每組隨機(jī)挑選3只剖殺，對(duì)其心、肝、脾、肺、腎以及氣管、法氏囊進(jìn)行熒光定量試驗(yàn)，結(jié)果顯示：病毒主要靶器官為肝臟，且肌肉注射比口服感染效果更嚴(yán)重，口服感染組的病毒RNA載量基本在檢測(cè)線(100拷貝數(shù)/mg)附近(圖4)。

在攻毒后第1、3、5、7、9、11、13天采集咽肛拭子，進(jìn)行熒光定量檢測(cè)其排毒情況，結(jié)果顯示攻毒后第Ⅱ組與第Ⅲ組雞的咽肛拭子均有排毒，其中第Ⅱ組雞的排毒情況在攻毒后第3～5天到達(dá)排毒高峰期，隨后降低(表3)。

圖2 JS株在LMH細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線

圖3 SPF雞存活率(上)及狀態(tài)評(píng)分分析(下)

注：拷貝數(shù)低于100拷貝數(shù)/mg為陰性

圖4 病毒的組織分布情況

表3 攻毒后咽肛拭子排毒情況

組別第1天第3天第5天第7天第9天第11天第13天咽肛咽肛咽肛咽肛咽肛咽肛咽肛Ⅰ--------------Ⅱ+++++//////////Ⅲ+++++++++±±±-----

注：“/”表示第Ⅱ組僅剩1只雞，數(shù)據(jù)不具有代表性?！?+”表示強(qiáng)陽(yáng)性，熒光定量計(jì)算的拷貝數(shù)大于1 000拷貝數(shù)/mg；“+”表示弱陽(yáng)性，熒光定量計(jì)算的拷貝數(shù)在100～1 000拷貝數(shù)/mg；“±”表示弱陽(yáng)性，熒光定量計(jì)算的拷貝數(shù)在100～150拷貝數(shù)/mg；“-”表示陰性，熒光定量計(jì)算的拷貝數(shù)小于100 拷貝數(shù)/mg

3 討論

2013年以來(lái)我國(guó)出現(xiàn)FAdV-4感染的疾病報(bào)告，且在2015年暴發(fā)心包積液肝炎綜合征。本研究室2017年從江蘇省某發(fā)病雞場(chǎng)分離獲得1株4型禽腺病毒，命名為JS株。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與我國(guó)近期流行株相似。同時(shí)，通過(guò)測(cè)定了病毒的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)它可以很好地在LMH細(xì)胞上繁殖，病毒滴度高達(dá)108.0TCID50/100 μL，但從河南省感染的病禽肝臟組織中分離的HNJZ株在LMH上的毒價(jià)僅為106.5TCID50/100 μL[11]、SD0828在雞胚成纖維細(xì)胞上的毒價(jià)為105.3TCID50/100 μL[12]、SD1511在雞胚腎細(xì)胞上的毒價(jià)為103.2TCID50/100 μL[13]以及SDJN0105株在雞胚上的毒價(jià)為105.0TCID50/100 μL[3]，這些毒株均沒(méi)有本次分離的JS株毒價(jià)高。本試驗(yàn)分離到1株在LMH細(xì)胞上生長(zhǎng)良好的病毒株，有助于后續(xù)進(jìn)行滅活疫苗的研究。將F4代病毒通過(guò)肌肉注射或口服感染的途徑對(duì)21日齡SPF雞進(jìn)行攻毒，發(fā)現(xiàn)口服感染組的雞群并沒(méi)有產(chǎn)生精神沉郁或死亡癥狀，解剖后觀察到雞的肝臟黃染，并無(wú)其他變化；而肌注組的SPF雞在攻毒后24 h已出現(xiàn)輕度沉郁的癥狀，并在攻毒后3～5 d達(dá)到死亡高峰，引起了90%的死亡率。剖檢可看到很明顯的心包積液癥狀。這與已報(bào)道的CH/HNJZ/2015株的致病力有所不同[11]。盡管JS株與CH/HNJZ/2015株在Hexon基因水平上同源性達(dá)99%，但口服感染后呈現(xiàn)出不同的致病力，其中CH/HNJZ/2015株口服感染0.2 mL 105.0TCID50的病毒后，在攻毒后第5天達(dá)到100%死亡，而JS株在口服感染0.2 mL 106.0TCID50的病毒后，雞群沒(méi)有死亡也沒(méi)有明顯的臨床癥狀。剖檢后可看到肝臟黃染，無(wú)心包積液。2株病毒在Hexon基因水平上同源性高卻有不同的致病力，可以考慮可能是其他基因水平上的差別導(dǎo)致了兩株病毒毒力的不同。

已有研究通過(guò)不同感染方式調(diào)查FAdV-4對(duì)雞的致病力，發(fā)現(xiàn)口服感染致病力低于肌肉感染，這可能是由于口服感染時(shí)消化道對(duì)病毒具有一定的消化作用，影響了病毒的活性及在機(jī)體內(nèi)的吸附作用[6,13]。本試驗(yàn)在2種感染方式的雞的咽拭子中都檢測(cè)到了排毒，這也證實(shí)了該病毒可能經(jīng)空氣-消化道傳播[13]。

對(duì)腺病毒在雞體內(nèi)的分布情況也進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)肝臟中的病毒含量最高，且各組織臟器中病毒均有分布，這與其他研究結(jié)果一致，這也解釋了為何FAdV-4可在LMH細(xì)胞上更好繁殖?？诜腥窘M雞沒(méi)有死亡但咽拭子也有排毒情況，說(shuō)明不同的感染方式對(duì)雞的致病力不同，這一點(diǎn)與已有文獻(xiàn)報(bào)道相同[14]。本研究分離獲得了1株在LMH細(xì)胞上具有較高病毒滴度和高致病力的FAdV-4，為后續(xù)研究JS株的致病機(jī)理及制備針對(duì)FAdV-4的滅活疫苗奠定基礎(chǔ)。