豬鏈球菌抗氧化應(yīng)激蛋白YED和AHH的鑒定

王碩玥，梁子敬，陳琳，吳宗福

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

豬鏈球菌(Streptococcussuis)是革蘭陽(yáng)性菌，豬的重要致病菌，可引發(fā)豬的腦膜炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥等，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。該菌也是一種重要的人畜共患病原，世界各地都有人感染豬鏈球菌的報(bào)道；在我國(guó)出現(xiàn)的2次暴發(fā)，1998年的江蘇和2005年的四川，分別造成14人和39人死亡。該菌血清型眾多，迄今報(bào)道可感染人的血清型有9種，分別為2型、4型、5型、9型、14型、16型、21型、24型和31型，其中血清2型對(duì)豬和人致病性最強(qiáng)[2-4]。

細(xì)菌的有氧新陳代謝和宿主的免疫活性細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，可產(chǎn)生活性氧，如超氧化物、過(guò)氧化氫(H2O2)、羥自由基等[5]。產(chǎn)生的活性氧可對(duì)細(xì)菌的蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和DNA等大分子造成損傷[6]；另外，產(chǎn)生的H2O2還可與Fe2+通過(guò)芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)氧化能力的羥基自由基，對(duì)細(xì)菌具有殺傷作用[7]。為避免受活性氧的損傷，不同的細(xì)菌具有不同的抗氧化應(yīng)激策略：有些可分泌毒素，損傷巨噬細(xì)胞，或者抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧；有些能表達(dá)超氧化物歧化酶(SOD)可將超氧化物轉(zhuǎn)化為H2O2，進(jìn)而被過(guò)氧化氫酶轉(zhuǎn)化為水和氧；有些則利用谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，將谷胱甘肽(GSH)和H2O2氧化為G-S-S-G和水，進(jìn)而G-S-S-G被谷胱甘肽還原酶還原為GSH；有些可產(chǎn)生特殊的抗氧化劑直接結(jié)合活性氧，起到抗氧化作用，如銅綠假單胞菌產(chǎn)生的藻朊酸鹽；另外，有些還可過(guò)表達(dá)熱休克蛋白起到抗氧化應(yīng)激的作用[5,8]。目前對(duì)豬鏈球菌抗氧化應(yīng)激機(jī)制的了解還很有限。

本研究通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的比較蛋白組學(xué)方法，尋找H2O2應(yīng)激條件下的差異表達(dá)蛋白，并從中選擇2個(gè)新發(fā)現(xiàn)的抗氧化應(yīng)激蛋白通過(guò)基因敲除、H2O2應(yīng)激及小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬和存活等試驗(yàn)，驗(yàn)證其生物學(xué)功能，研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示豬鏈球菌的抗氧化應(yīng)激機(jī)制和致病機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

THB(Todd-Hewitt Broth)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司；綿羊血購(gòu)自北京鼎國(guó)生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；2×Rapid Taq Master Mix、DNA片段回收試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 菌株、細(xì)胞和培養(yǎng)條件

豬鏈球菌2型毒力株P(guān)1/7 由本實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)菌菌株在THB液體或THA平板(5%瓊脂粉)中于37 ℃培養(yǎng)箱或搖床(180 r/min)下培養(yǎng)。小鼠巨噬細(xì)胞 RAW 264.7(ATCC TIB-71)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于37 ℃，5%CO2下培養(yǎng)。

1.3 全菌蛋白提取及LC-MS/MS分析

將P1/7凍存菌劃于血平板復(fù)蘇，挑取單菌落，在5 mL THB培養(yǎng)液于37 ℃，180 r/min下培養(yǎng)8 h，按1∶100轉(zhuǎn)接至20 mL THB(1∶50加血清)培養(yǎng)至OD600≈0.6，加入H2O2(終濃度20 mmol/L)作用20 min后，于4 ℃，8 000 r/min下離心10 min，去上清液，10 mL PBS洗滌3次，液氮速凍后于-80 ℃保存。對(duì)照組不經(jīng)H2O2處理。取菌體沉淀加入適量SDT裂解液(4% SDS、100 mmol/L Tris-HCl pH 7.6、100 mmol/L 二硫蘇糖醇)，轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有適量石英砂的2 mL離心管中，應(yīng)用MP勻漿儀進(jìn)行勻漿破碎(6.0 m/s，60 s，2次)。然后超聲(80 W，運(yùn)行10 s，間歇15 s，循環(huán)10次)，沸水浴15 min。14 000g離心40 min，取上清采用0.22 μm濾膜過(guò)濾，收集濾液。采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，分裝樣品，-80 ℃保存。每個(gè)菌株3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

樣品送至上海中科新生命生物科技有限公司，進(jìn)行FASP酶解及LC-MS/MS分析。差異蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)為與對(duì)照組相比，差異表達(dá)倍數(shù)超過(guò)2倍且P<0.05。

1.4 YED、AHH缺失株的構(gòu)建

缺失株的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[9]，引物見(jiàn)表1，由南京擎科生物有限公司合成。采用兩步篩選法，第一步通過(guò)Spc耐受為正向篩選，第二步以蔗糖敏感(sacB)作為反向篩選，經(jīng)染色體基因組自身同源重組完成無(wú)痕替換。

1.4.1 Spc耐受正向篩選

以P1/7基因組為模板，以ΔYED-A、ΔYED-B(ΔAHH-A、ΔAHH-B)為引物擴(kuò)增上游臂ΔYED-AB(ΔAHH-AB)；以SacB-F、Spc-R為引物擴(kuò)增sacB-spc片段；以ΔYED-C、ΔYED-D(ΔAHH-C、ΔAHH-D)為引物擴(kuò)增下游臂ΔYED-CD(ΔAHH-CD)；以ΔYED-AB、sacB-spc、ΔYED-CD(ΔAHH-AB、sacB-spc、ΔAHH-CD)為模板，以ΔYED-A、ΔYED-D(ΔAHH-A、ΔAHH-D)為引物進(jìn)行融合PCR，反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 22 s(30個(gè)循環(huán))；72 ℃ 10 min。將PCR融合產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用DNA片段回收試劑盒切膠回收。挑取P1/7單菌落于37 ℃，180 r/min下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，按1∶40轉(zhuǎn)接至20 mL THB培養(yǎng)至OD600=0.04 ～ 0.05(約20 ～ 60 min)；取100 μL菌液，添加5 μL信號(hào)肽(GNWGTWVEE)，10 μL上述 PCR三段融合產(chǎn)物；于37 ℃下靜置培養(yǎng)2 h，涂布于TS平板(含100 μg/mL spc的THA)；次日挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定[10]。

1.4.2 sacB反向篩選

以P1/7基因組為模板，用ΔYED-A、ΔYED-B1(ΔAHH-A、ΔAHH-B1)為引物擴(kuò)增上游臂ΔYED-AB1(ΔAHH-AB1)；以ΔYED-C1、ΔYED-D(ΔAHH-C1、ΔAHH-D)為引物擴(kuò)增下游臂ΔYED-C1D(ΔAHH-C1D)；以ΔYED-AB1、ΔYED-C1D(ΔAHH-AB1、ΔAHH-C1D)為模板，以ΔYED-A、ΔYED-D(ΔAHH-A、ΔAHH-D)為引物進(jìn)行融合PCR，反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min(30個(gè)循環(huán))；72 ℃ 10 min。將PCR融合產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用DNA片段回收試劑盒切膠回收。挑取P1/7有痕缺失株ΔYED和ΔAHH單菌落于37 ℃，180 r/min下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，按1∶40轉(zhuǎn)接至20 mL THB培養(yǎng)至OD600=0.04～0.05(約20～60 min)；取100 μL菌液，添加5 μL信號(hào)肽，10 μL上述PCR兩段融合產(chǎn)物；于37 ℃下靜置培養(yǎng)2 h，涂布于THA平板(含10%蔗糖)；次日挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，且擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序[10]。

表1 引物

引物名稱(chēng)引物序列(5′-3′)擴(kuò)增產(chǎn)物ΔYED-ACTTGGGAGAAGACCAGAGGCAGAAAΔYED-BCTTCAAGGAGTTTTCAGCATTATCCGACAGAAAAGACGCGATTGGGCCAG第一步:YED上游同源臂ΔYED-CATTCATTCTAATTGGTAATCAGATTAAGATTTTTAAGATTCCTTTCGTAΔYED-DCCACATCATACTGACGAGTGTAG第一步:YED下游同源臂ΔYED-B1AATCTTAAAAATCTTGACAGAAAAGACGCGATTGGGCCAG第二步:YED上游同源臂ΔYED-C1AAGATTTTTAAGATTCCTTTCGTA第二步:YED下游同源臂ΔYED(inter)-XTTTCTGAGTTGCCTCGTCΔYED(inter)-YTGCAAAACATGATGCGCCAA鑒定ΔYED無(wú)痕缺失株ΔYED-FACAGGAAAACAACTACCAΔYED-RAGTCTTCACGGTCCAAAAΔYED無(wú)痕缺失株測(cè)序ΔAHH-ACTTGAAGCAATACCTATCGCΔAHH-BCTTCAAGGAGTTTTCAGCATTATCCTTGCCTCTGATACTAGGTTT第一步:AHH上游同源臂ΔAHH-CATTCATTCTAATTGGTAATCAGATTGGCTAGATGCTTCATGGTΔAHH-DCGCCAGATTCATTTTCAG第一步:AHH下游同源臂ΔAHH-B1ATGAAGCATCTAGCCTTGCCTCTGATACTAGGTTT第二步:AHH上游同源臂ΔAHH-C1GGCTAGATGCTTCATGGT第二步:AHH下游同源臂ΔAHH(inter)-XCAAGCAAGTCCGATACCACΔAHH(inter)-YCCCTAGACAAATTAGCCAGT鑒定ΔAHH無(wú)痕缺失株ΔAHH-FTTAACACAGTCCCAAAGGCTAΔAHH-RGTGCAACATTTGTGTCTGAΔAHH無(wú)痕缺失株測(cè)序SacB-FGGATAATGCTGAAAACTCCTTSpc-RAATCTGATTACCAATTAGAATGAATATsacB-spc片段

1.5 P1/7、ΔYED和ΔAHH菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

挑取P1/7、ΔYED和ΔAHH單菌落于37 ℃，180 r/min下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，按1∶100轉(zhuǎn)接至100 mL THB培養(yǎng)，每隔1 h測(cè)量OD600，分別繪制各菌株的生長(zhǎng)曲線。每個(gè)菌株3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.6 抗氧化應(yīng)激試驗(yàn)

挑取P1/7、ΔYED和ΔAHH單菌落于37 ℃，180 r/min下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，按1∶100轉(zhuǎn)接至5 mL THB(1∶50加血清)培養(yǎng)至OD600≈0.6；各取500 μL菌液，THB稀釋10倍，即 5 mL，加入20 μL 30% H2O2(終濃度40 mM)分別作用0 min、20 min，各取100 μL經(jīng)PBS作10倍比稀釋?zhuān)x擇3個(gè)合適濃度，涂布于THA平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。相對(duì)存活率%=CFU20 min/CFU0 min。每個(gè)菌株3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.7 RAW264.7吞噬與存活試驗(yàn)

挑取P1/7、ΔYED和ΔAHH單菌落于37 ℃，180 r/min下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，按1∶100轉(zhuǎn)接至5 mL THB培養(yǎng)至OD600≈0.6。各取5 mL菌液，于4 ℃，8 000 r/min離心5 min，用PBS洗2次，DMEM重懸至OD600≈0.6。取5×105～7×105/mL RAW264.7細(xì)胞鋪入24孔板(每孔中有500 μL含10%血清的DMEM培養(yǎng)液)，生長(zhǎng)12 ～18 h(約80%)。吸凈液體，DMEM洗3遍，并用臺(tái)盼藍(lán)法計(jì)算出每孔所含的細(xì)胞數(shù)。然后以感染比(細(xì)菌∶細(xì)胞)≈100∶1的比例將菌液分別添加到24孔板中。室溫下800g離心10 min，于37 ℃，5% CO2下孵育1 h。用不含血清的DMEM洗RAW267.4細(xì)胞3遍，在含100 μg/mL慶大霉素和5 μg/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)1 h、3 h后，洗滌3次，1 mL ddH2O裂解細(xì)胞，對(duì)每孔進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。吞噬率為抗生素處理1 h后巨噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)占原始接菌數(shù)的比值。將抗生素處理1 h后的巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)作為100%，計(jì)算3 h細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活率。胞內(nèi)存活率%=CFU3 h/CFU1 h。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，均采用t檢驗(yàn)分析，*表示差異性顯著(P<0.05)，**表示差異性極顯著(P<0.01)；***表示差異性極顯著(P<0.001)。

2 結(jié)果

2.1 LC-MS/MS比較蛋白組學(xué)分析

提取豬鏈球菌全菌蛋白，以THB培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌作為對(duì)照，經(jīng)H2O2處理后，LC-MS/MS共鑒定出54個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中28個(gè)蛋白在H2O2處理組中上調(diào)表達(dá)，26個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá)。這些差異表達(dá)的蛋白主要參與代謝、生物合成、抗應(yīng)激等過(guò)程。將全部的差異表達(dá)蛋白逐一經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)有10種蛋白可能與豬鏈球菌抗氧化應(yīng)激有關(guān)(見(jiàn)表2)。其中黃素蛋白、精氨酸脫亞胺酶和氨基甲酸激酶已有文獻(xiàn)報(bào)道與該菌抗氧化應(yīng)激有關(guān)；另外7個(gè)蛋白是可能的抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白：YbaB/EbfC家族核苷相關(guān)蛋白(YED)、2-氨基-4-羥基-6-羥甲基二氫蝶啶二磷酸激酶(AHH)、硫氧還蛋白(SSU0223)、UvrC蛋白(SSU0702)、核苷DNA結(jié)合蛋白(SSU1458)、3-氧代酰基-[?；d體蛋白]合酶3(SSU1607)、碳酸酐酶(SSU1820)。本研究選擇YED和AHH進(jìn)行深入研究，并驗(yàn)證其是否具有抗氧化應(yīng)激特性。

2.2 YED、AHH對(duì)豬鏈球菌生長(zhǎng)特性的影響

成功構(gòu)建YED與AHH的基因缺失株ΔYED和ΔAHH。將野生株P(guān)1/7、ΔYED和ΔAHH在100 mL THB 培養(yǎng)液中于37℃，180 r/min下培養(yǎng)，每隔1 h檢測(cè)OD600吸光值。如圖1所示，生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明各菌株在THB中無(wú)顯著差異。

表2 差異表達(dá)蛋白

基因名蛋白名稱(chēng)表達(dá)倍數(shù)(H2O2/對(duì)照)P值SSU0175黃素蛋白3.41950.0120SSU0223硫氧還蛋白4.84480.0010SSU1458類(lèi)核DNA結(jié)合蛋白21.74320.0000SSU0580精氨酸脫亞胺酶0.45000.0226SSU16073-氧代酰基-[?；d體蛋白]合酶30.45780.0254SSU0184YbaB/EbfC家族核苷相關(guān)蛋白(YED)+SSU0702UvrC蛋白+SSU09862-氨基-4-羥基-6-羥甲基二氫蝶啶二磷酸激酶(AHH)+SSU1820碳酸酐酶+SSU0583氨基甲酸激酶-

注：+表示該蛋白在H2O2處理組特有；-表示該蛋白在對(duì)照組特有

圖1 P1/7、ΔYED和ΔAHH的生長(zhǎng)曲線

2.3 YED、AHH對(duì)豬鏈球菌抗氧化應(yīng)激能力的影響

為驗(yàn)證YED、AHH對(duì)豬鏈球菌抗氧化應(yīng)激能力的影響，將P1/7、ΔYED和ΔAHH在含有H2O2(終濃度為40 mmol/L)的THB培養(yǎng)基中，于37℃下作用20 min。如圖2所示，與野生株P(guān)1/7相比，ΔYED和ΔAHH對(duì)抗H2O2應(yīng)激能力極顯著降低。

注：**P<0.01

2.4 RAW264.7吞噬與存活試驗(yàn)

采用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞，探究YED、AHH對(duì)豬鏈球菌抗巨噬細(xì)胞吞噬和在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的影響。如圖3A所示，RAW264.7細(xì)胞對(duì)野生株和2個(gè)缺失株ΔYED與ΔAHH的吞噬率無(wú)顯著差異(P>0.05)；存活試驗(yàn)(圖3B)顯示，經(jīng)抗生素處理3 h后，與P1/7相比，缺失株ΔYED和ΔAHH在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活率極顯著下降(P<0.001)。

注：與P1/7組相比，***P<0.001

圖3 P1/7、ΔYED和ΔAHH的吞噬率(A)及其在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)存活率(B)

3 討論

本研究采用蛋白質(zhì)組方法，鑒定豬鏈球菌抗氧化應(yīng)激蛋白。發(fā)現(xiàn)的54個(gè)差異表達(dá)蛋白中，有3個(gè)報(bào)道與豬鏈球菌抗氧化應(yīng)激有關(guān)。由基因SSU0175編碼的黃素蛋白，在H2O2應(yīng)激條件下顯著上調(diào)表達(dá)，該蛋白又稱(chēng)為NADH 氧化酶(Nox)[11]；該基因缺失后豬鏈球菌對(duì)抗H2O2應(yīng)激能力、在血液中存活能力、對(duì)豬和小鼠的致病力均顯著降低[12]。經(jīng)H2O2處理，顯著下調(diào)的蛋白中有2個(gè)蛋白(精氨酸脫亞胺酶和氨基甲酸激酶)報(bào)道與豬鏈球菌的氧應(yīng)激有關(guān)，這兩個(gè)蛋白分別由SSU0580和SSU0583基因編碼，屬于精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)(ADS)[13]；豬鏈球菌在低氧條件下ADS上調(diào)表達(dá)，而在高氧條件下ADS下調(diào)表達(dá)[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)7個(gè)新蛋白可能與豬鏈球菌新的抗氧化應(yīng)激相關(guān)。YED蛋白為YbaB/EbfC家族核苷相關(guān)蛋白，屬于DNA結(jié)合蛋白，在原核生物中廣泛分布[15]；流感嗜血桿菌、大腸桿菌和伯氏疏螺旋體中的該蛋白參與修復(fù)受損的DNA構(gòu)象[16]；伯氏疏螺旋體該蛋白過(guò)表達(dá)后顯著影響該菌4.5%基因的表達(dá)，包括與DNA重組、復(fù)制及修復(fù)相關(guān)的基因，感染相關(guān)基因和細(xì)菌適應(yīng)性相關(guān)基因[17]，后者以較高的突變率幫助細(xì)菌迅速適應(yīng)外界環(huán)境[18]；變鉛青鏈霉菌缺失含該基因的操縱子后，對(duì)于DNA損傷劑的敏感性增強(qiáng)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，YED基因缺失后，豬鏈球菌在H2O2應(yīng)激下的存活率降低，說(shuō)明YED與該菌抗氧化應(yīng)激有關(guān)。推測(cè)H2O2造成DNA損傷后，豬鏈球菌通過(guò)上調(diào)表達(dá)YED蛋白，參與修復(fù)受損傷的DNA，抵御氧化應(yīng)激。AHH蛋白是2-氨基-4-羥基-6-羥甲基二氫蝶啶二磷酸激酶，參與四氫葉酸的合成；四氫葉酸作為一碳單位(C1)的供體，參與蛋氨酸、嘌呤及胸腺嘧啶的生成[19]；酵母菌lba57蛋白以葉酸為輔因子，參與鐵硫簇蛋白的合成和修復(fù)；大腸桿菌Iba57同源基因ygfZ的缺失，對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感，且降低鐵硫簇蛋白的活性[20-21]，而后者在細(xì)菌中參與多種重要生物學(xué)過(guò)程，如DNA修復(fù)、基因調(diào)控、代謝等[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，AHH基因缺失可導(dǎo)致豬鏈球菌在H2O2應(yīng)激下存活能力下降，說(shuō)明AHH參與該菌抗氧化應(yīng)激。推測(cè)H2O2應(yīng)激條件下，豬鏈球菌通過(guò)上調(diào)表達(dá)AHH蛋白，參與鐵硫簇蛋白的合成和修復(fù)，從而有利于抗氧化應(yīng)激。另外5種蛋白本研究未做功能分析。SU0223基因表達(dá)的蛋白是一種硫氧還蛋白，通過(guò)其活性中心二硫鍵參與氧化還原反應(yīng)；SSU0702編碼的UvrC蛋白和SSU1458編碼的DNA結(jié)合蛋白參與受損傷DNA的修復(fù)[23-24]；SSU1820基因編碼的是碳酸酐酶，能清除氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞[25]；SSU1607所編碼的3-氧代?；?[?；d體蛋白]合酶3，在H2O2應(yīng)激條件下顯著下調(diào)表達(dá)，該酶的功能是催化生成?；d體蛋白，銅綠假單胞菌的?；d體蛋白通過(guò)抑制過(guò)氧化氫酶的活性，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)[26]。這5個(gè)蛋白是否參與H2O2應(yīng)激及在豬鏈球菌致病中的作用值得后續(xù)深入研究。

巨噬細(xì)胞將致病菌吞入后形成吞噬體，經(jīng)一系列成熟過(guò)程，最終形成吞噬溶酶體，清除致病菌[27]。其中產(chǎn)生活性氧是巨噬細(xì)胞清楚病原菌的主要方式之一：巨噬細(xì)胞中的NADPH氧化酶可催化產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)，對(duì)細(xì)菌的蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和DNA造成損傷[6]；在酸性的吞噬溶酶體內(nèi)，O2-可迅速轉(zhuǎn)化為H2O2或與一氧化氮反應(yīng)生成過(guò)氧亞硝酸鹽，從而對(duì)細(xì)菌發(fā)揮殺傷作用[6]；另外，產(chǎn)生的H2O2還可與Fe2+通過(guò)芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)氧化能力的羥基自由基，發(fā)揮殺菌功能[7]。本研究發(fā)現(xiàn)YED和AHH參與豬鏈球菌抗氧化應(yīng)激，因此這2個(gè)蛋白促進(jìn)豬鏈球菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活可能主要通過(guò)抗氧化應(yīng)激方式發(fā)揮作用。

綜上，本研究通過(guò)鑒定在H2O2應(yīng)激條件下的差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)7個(gè)新的蛋白可能參與豬鏈球菌抗氧化應(yīng)激，為揭示豬鏈球菌的抗氧化應(yīng)激機(jī)制提供參考；其中YED和AHH與豬鏈球菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)存活相關(guān)，提示它們?cè)谪i鏈球菌致病過(guò)程中發(fā)揮作用。