養(yǎng)殖場除臭酵母發(fā)酵條件的優(yōu)化

許麗娟 王升平 雷平 王玉梅 于志敏 李榮

摘 要：為了規(guī)?；a(chǎn)除臭酵母菌JM-1，以菌體活菌數(shù)為指標(biāo)，通過單因素試驗和正交試驗對其發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明：酵母菌JM-1的最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度30℃，初始pH值 5.0，接種量4%，500 mL三角瓶裝液量150 mL。在此條件下培養(yǎng)24 h，釀酒酵母的發(fā)酵菌數(shù)超過7.42×108 CFU/mL，與優(yōu)化前的6.11×108 CFU/mL相比較，活菌數(shù)提高了21.1%。

關(guān)鍵詞：酵母菌;發(fā)酵條件;正交試驗;發(fā)酵菌數(shù)

中圖分類號：Q939.99文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1006-060X（2020）03-0001-03

Abstract： In order to obtain the optimal fermentation condtions of a strain of JM-1， the fermentation conditions were optimized by single?factor experiment and orthogonal experiment， using the number of viable bacteria in the fermentation as an index. The optimal fermentation conditions were： culture temperature 30℃， initial pH value 5.0， inoculum size 4%， and liquid filling quantity 150 mL in the 500 mL?conical flask. In these conditions， the number of viable bacteria exceed 7.42×108 CFU/mL， which was increased by 21.1% compared to that before optimization.

Key words： saccharomycetes; fermentation conditions; orthogonal experiment; the number of viable bacteria

隨著我國農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟的結(jié)構(gòu)調(diào)整，養(yǎng)殖業(yè)朝著規(guī)?；?、集約化的方向快速發(fā)展。但由其規(guī)?；B(yǎng)殖所產(chǎn)生的大量廢棄物引起的惡臭污染卻成為主要污染源[1]。它不僅影響畜禽的正常生長，而且還影響?zhàn)B殖區(qū)及周邊農(nóng)村的生態(tài)環(huán)境，已成為制約畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸[2]。美國、德國等一些發(fā)達國家在幾十年前就開始對惡臭污染進行了研究和治理，取得了較多的成果[3]。近年來，我國養(yǎng)殖業(yè)雖然在廢棄物無害化處理和資源化利用方面取得了明顯的成果，但臭氣污染問題卻未得到解決[4]。養(yǎng)殖場的惡臭氣體對人畜健康影響最大的主要是氨氣（NH3）和硫化氫（H2S）。這些有害氣體如果得不到及時處理或處理不徹底，將會給養(yǎng)殖人員帶來不快、引起人和家畜的呼吸道疾病，而且進入大氣后會造成酸雨和增加自然生態(tài)系統(tǒng)中氮的負荷，具有大氣污染和有害氣體污染兩重性。因此，如何有效的減少養(yǎng)殖場的惡臭成為人們關(guān)注的熱點問題。

目前惡臭治理的方法有化學(xué)法、物理法和生物除臭法，或是這幾種方法的組合。而生物除臭法因具有廣泛適用范圍、較低的運行費用、便于維護管理以及不會產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點，成為脫臭技術(shù)的發(fā)展方向[5]。

酵母菌在有氧或無氧的條件下都能生存，具有良好的生態(tài)適應(yīng)性。它在厭氧條件下產(chǎn)生的乙醇能有效抑制有害微生物的活動，同時散發(fā)出的酒香味還可以掩蓋部分臭味[1]，因此其可在養(yǎng)殖場惡臭氣體治理方面發(fā)揮重要作用。在前期研究的基礎(chǔ)上，以前期篩選到的除臭酵母JM-1為材料，通過單因素試驗和正交試驗初步優(yōu)化其發(fā)酵條件，以期為菌劑的規(guī)?；a(chǎn)和實際應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌 種 試驗所用除臭酵母為釀酒酵母（JM-1），由湖南省微生物研究院環(huán)保微生物室自行分離和保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：葡萄糖 20.0 g/L，酵母膏 10.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，蒸餾水配制，pH值6.2～6.4;發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖 2%，磷酸二氫鉀 0.1%，氯化鈉 0.01%，硫酸鎂 0.05%，麥芽汁 0.3%，硫酸銨 0.5%，氯化鈣 0.01%，酵母浸膏 0.02%，其余為水，pH值6.0～6.2。

1.2 除臭酵母JM-1最佳發(fā)酵條件的確定

1.2.1 最佳培養(yǎng)溫度的確定 將酵母JM-1按1%接種量接于裝有100 mL YPD培養(yǎng)基容量為500 mL的三角瓶中，分別置于20、25、30、35、40 ℃5個不同溫度，轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床培養(yǎng)24 h，用平板計數(shù)法計數(shù)活菌數(shù)。

1.2.2 最佳初始pH值的確定 將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，按1%的接種量進行接種，選擇單因素試驗確定的最佳溫度，180 r/min培養(yǎng)24 h后計數(shù)活菌數(shù)。

1.2.3 最佳接種量的確定 在獲得最佳初始pH值和培養(yǎng)溫度以后，分別按照2%、4%、6%、8%、10%的接種量進行接種，在單因素試驗確定的最佳溫度，180 r/min條件下培養(yǎng)24 h后計數(shù)活菌數(shù)。

1.2.4 最佳裝液量的確定 按最佳接種量分別接入裝有10、100、150、200、250 mL YPD培養(yǎng)基容量為500 mL的三角瓶中，選擇最佳溫度，180 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3 除臭酵母JM-1發(fā)酵條件正交優(yōu)化試驗

發(fā)酵條件優(yōu)化采用4因素3水平L9（34）正交試驗，共設(shè)有9個處理，每個處理有3個重復(fù)試驗。根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選擇培養(yǎng)溫度、初始pH值、接種量、裝液量做正交試驗，篩選出優(yōu)化組合。

1.4 活菌數(shù)

活菌數(shù)采用平板涂布法計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)運用SPSS18.0軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 最佳培養(yǎng)溫度 不同溫度對酵母JM-1生長的影響結(jié)果如圖1所示，JM-1在25～35℃內(nèi)生長良好，菌體數(shù)也較高，在30℃時菌體數(shù)最高，為5.85×108 CFU/mL。低于或高于該溫度范圍，菌體長勢差，菌體數(shù)量低，這可能是由于溫度較低時，微生物生長緩慢，代謝活性差，因此菌體量少;高溫時，菌體的代謝活動受到抑制，從而影響菌株的生長和繁殖，導(dǎo)致菌量少。從圖1可看出，JM-1的最佳生長溫度為30℃。

2.1.2 最佳初始pH值 由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為7.0時，JM-1菌株長勢差;而初始pH值為5.0時，菌體生長最好，活菌數(shù)達6.00×108 CFU/mL;且初始pH值為3.0～4.0時，菌體生長依然旺盛，活菌數(shù)也高。說明該菌株在低pH值下也能生長良好。

2.1.3 最佳接種量 在獲得最佳初始pH值和培養(yǎng)溫度后，對菌株分別采用5個接種量（2%、4%、6%、8%、10%），180 r/min，培養(yǎng)24 h，測定菌數(shù)。結(jié)果見圖3，一定范圍內(nèi)，菌株發(fā)酵的菌數(shù)隨著接種量的增加而增加，當(dāng)接種量超過6%時，活菌數(shù)出現(xiàn)下降趨勢。在接種量為2%和4%時，活菌數(shù)分別為5.93×108 CFU/mL和6.11×108 CFU/mL，相差不大。從經(jīng)濟角度出發(fā)，可選擇2%的接種量。

2.1.4 最佳裝液量 裝液量對酵母菌體數(shù)的影響實際上反映的是溶解氧對酵母菌體數(shù)的影響。裝液量對酵母JM-1菌體數(shù)的影響見圖4，由圖可知，菌液裝量為100 mL時，菌體數(shù)達6.05×108 CFU/mL。當(dāng)在容量為500 mL的三角瓶中裝入50～250 mL培養(yǎng)液時，菌體均能很好的生長。但隨著裝液量增多，活菌數(shù)略有下降。由此可見，裝液量雖然對菌體的生長有影響，但影響不大，這也在一定程度上說明該菌在有氧和缺氧條件下都能生長。

2.2 正交試驗結(jié)果

在以上單因素試驗的基礎(chǔ)上，綜合考慮各發(fā)酵條件對酵母JM-1脫氨性能影響，為了得出初步優(yōu)化的發(fā)酵條件，以活菌數(shù)為指標(biāo)，設(shè)置L9（34）正交表進行優(yōu)化試驗，共9個處理，每個處理重復(fù)3次。因素及水平設(shè)計見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

由表2的試驗結(jié)果可知，菌株JM-1發(fā)酵條件的最佳組合為A2B2C2D2（最優(yōu)組合未在正交試驗組合中），即培養(yǎng)溫度30℃，初始pH值 5.0，500 mL三角瓶裝液量150 mL，接種量4%，培養(yǎng)24 h，酵母的發(fā)酵菌數(shù)超過7.42×108 CFU/mL。根據(jù)表2的試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。由表2的極差分析和表3的方差分析可知，所考察的各個因子中初始pH值和接種量對活菌數(shù)的影響相當(dāng)大，均達到極顯著水平。其中，影響酵母JM-1活菌數(shù)的主次因素依次為：接種量>裝液量>初始pH值>培養(yǎng)溫度，即D因素（接種量）為影響酵母菌體數(shù)的最主要因素，其次是C因素（裝液量）和B因素（初始pH值），而A因素（培養(yǎng)溫度）的影響最小。

3 結(jié)論與討論

畜禽養(yǎng)殖已成為農(nóng)村經(jīng)濟新的增長點和重要的支柱產(chǎn)業(yè)。隨著各地規(guī)?；男笄蒺B(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖業(yè)的環(huán)境污染總量、污染程度也發(fā)生了極大變化。畜禽養(yǎng)殖業(yè)所產(chǎn)生的惡臭污染已成為不可忽視的重大污染源。

在沒有人工干預(yù)的情況下，對環(huán)境中污染物進行降解主要是依賴環(huán)境中本身存在的土著微生物進行自然凈化，但微生物生長緩慢導(dǎo)致降解速度慢。因此，直接接種培養(yǎng)馴化后的菌種可加速污染物的降解[6-8]。

該文將前期獲得的養(yǎng)殖場除臭酵母菌JM-1的發(fā)酵溫度、初始pH值、裝液量和接種量進行優(yōu)化試驗。單因素試驗研究表明，酵母菌JM-1在培養(yǎng)溫度25～35℃，初始pH值在4.0～6.0內(nèi)均能很好的生長。對發(fā)酵條件進行正交試驗，獲得最佳發(fā)酵工藝條件為：培養(yǎng)溫度 30℃，初始pH值5.0，500 mL錐形瓶裝液量150 mL，接種量4%。在此條件下培養(yǎng)24 h，酵母菌的發(fā)酵菌數(shù)超過7.42×108 CFU/mL。與優(yōu)化前的6.11×108 CFU/mL相比較，活菌數(shù)提高了21.1%。

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（責(zé)任編輯：唐珊珊）