阿爾茨海默病病變腦區(qū)FoxG1過表達小鼠的構(gòu)建

宋黃戎，馬思飛，惲 琪，郭美娜，胡沿每，翟鴻儒， 薛欽洋，蘇令通，王 琪，張維寧， 王 佳,2

(1. 江蘇大學 醫(yī)學院，生物化學檢驗教研室，鎮(zhèn)江 212013; 2. 江蘇大學第四人民醫(yī)院，神經(jīng)疼痛、介入科，鎮(zhèn)江 212001)

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，常發(fā)生于老年前期或老年期，主要以進行性的記憶認知功能障礙、人格性格改變?yōu)樘卣?，其主要病理特征為老年斑形成、神?jīng)原纖維纏結(jié)沉積、海馬錐體細胞顆?？张葑冃我约吧窠?jīng)元缺失等[1]。隨著社會老齡化的發(fā)展，AD的發(fā)病率逐年升高，當前已經(jīng)成為嚴重的社會問題。然而，迄今為止，AD的發(fā)病原因及其發(fā)病機制尚不明確。

越來越多的證據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常與AD發(fā)生密切相關(guān)[2]。無論在AD細胞模型、轉(zhuǎn)基因小鼠模型還是AD患者腦組織研究結(jié)果均證實mRNA轉(zhuǎn)錄水平的異常[3]。研究表明，F(xiàn)oxG1突變與許多神經(jīng)發(fā)育障礙如Rett syndrome及小頭癥密切相關(guān)[4]。FoxG1作為叉頭轉(zhuǎn)錄因子Fox 家族中的一個成員，執(zhí)行著轉(zhuǎn)錄抑制功能[5]。作為端腦特異性的轉(zhuǎn)錄抑制因子，在胚胎期主要調(diào)控小鼠端腦的形成。FoxG1不僅表達于胚胎時期的腦，也在整個成年期高度表達于哺乳動物的腦[6]，在腦發(fā)育早期，F(xiàn)oxG1主要選擇性表達于端腦形成的增殖細胞群，F(xiàn)oxG1使細胞持續(xù)維持在增殖狀態(tài)，并阻止其分化為神經(jīng)元，參與神經(jīng)可塑性的調(diào)控[7]；出生后FoxG1繼續(xù)表達于海馬齒狀回和室管膜下區(qū)，調(diào)節(jié)出生后海馬的神經(jīng)形成[8]。FoxG1促進視網(wǎng)膜軸突的生長以及內(nèi)耳[9]和嗅覺系統(tǒng)[10]的形成。然而轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子FoxG1與AD的關(guān)系卻鮮見報道。

本研究中的AD病變腦區(qū)FoxG1過表達小鼠擬通過Cre/loxp介導的基因重組方案構(gòu)建(圖1)：loxp是一段長34 bp的DNA序列，是Cre重組酶識別的位點，被稱為loxp位點。在興趣基因FoxG1上游的一側(cè)(通常稱為"loxp-stop-loxp"或"LSL"盒)放置一個帶loxp位點的終止密碼子，可以抑制Cre缺失時的基因表達，在Cre存在的情況下，終止密碼子被切除，基因表達繼續(xù)進行。我們通過雜交CreERT2工具小鼠(B6;129-5-HT1Btm1(CreERT)5-HT1B)和FoxG1條件性過表達小鼠(CAG-loxp-stop-loxp-FoxG1-IRES-EGFP)，獲得CreERT2重組酶/FoxG1轉(zhuǎn)基因子代小鼠[11]。CreERT2工具小鼠(B6;129-5-HT1Btm1(CreERT)5-HT1B)的啟動子為5-HT1Btm1，可以介導Cre重組酶在小鼠海馬、皮層、紋狀體腦區(qū)特異性表達；而ERT2是一個改造過的雌激素受體，可以被他莫昔芬活化，他莫昔芬的代謝產(chǎn)物4-OHT(雌激素類似物)與ERT2結(jié)合后誘導CreERT2入核發(fā)揮其重組酶活性[12]，進一步激活Cre重組酶識別loxp位點，基于以上方案，我們可以獲得FoxG1條件性過表達小鼠。若在AD病模型小鼠基因背景的基礎(chǔ)上構(gòu)建FoxG1條件性過表達小鼠，可通過啟動子5-HT1B誘導FoxG1過表達于AD的病變腦區(qū)(海馬、皮層、紋狀體)，也可基于AD特征性標記物(β-Amyloid)出現(xiàn)明顯病理學改變的時間，進而選擇他莫昔芬腹腔誘導的時間，通過cre/loxp介導的重組技術(shù)獲得AD病變腦區(qū)FoxG1條件性過表達小鼠后，在該小鼠生長至6個月(β-Amyloid出現(xiàn))后腹腔注射他莫昔芬誘導FoxG1過表達，獲得最理性的構(gòu)建方案。此外，當前的研究將就AD病變腦區(qū)FoxG1過表達小鼠鑒定、繁殖進行探討，通過PCR，IHC及IF技術(shù)驗證該模型小鼠的建立及FoxG1的蛋白表達，為FoxG1相關(guān)的AD的機制研究提供一個可信的動物模型。

Fig 1 Schematic diagram for conditional overexpression of FoxG1 mediated by cre/loxp strategy with genetic recombination

1 材料與方法

1.1 材料實驗所需的抗體如下：兔源GFP抗體(Bioss catalog # bs-0844R)。 鼠源β-淀粉樣蛋白抗體 (Cell Signaling Technology, catalog # 15126)。山羊抗兔IgG二抗(碧云天，catalog # p0186-1)。山羊抗鼠IgG二抗(澳泉醫(yī)療科技有限公司，catalog # RQ7025)。

1.2 實驗儀器光學顯微鏡(BX41，日本Olympus公司)，凝膠成像儀(GelDoc XP+, Bio-Rad公司)、電泳儀(DYY-6C型，北京市六一儀器廠)，水浴鍋(HH-3A, 金壇市精達儀器制造有限公司)。

1.3 實驗動物FoxG1條件性過表達(CAG-loxp-stop-loxp-FoxG1-IRES-EGFP)小鼠，品系B6/FVB，由東南大學趙春杰教授惠贈，雌雄各2只。B6; 129-5-HT1Btm1(CreERT)/Nju小鼠從南京模式動物研究中心引進[許可證編號：SCXK(蘇)2018-0008]，♀♂各2只。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/Nju由南京模式動物研究中心引進，品系名稱B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/Nju，♂2只，♀6只。SPF級C57BL/6J小鼠購于江蘇大學實驗動物中心[許可證編號：SCxk(蘇)2015-0001]。

1.4 小鼠的飼養(yǎng)小鼠的飼養(yǎng)按照SPF動物飼養(yǎng)標準執(zhí)行，經(jīng)隔離觀察未見異常后進入飼養(yǎng)區(qū)，嚴格按照SPF動物管理相關(guān)規(guī)定進行實驗操作。

1.5 小鼠鑒定采取剪去腳趾編號方法(剪取出生后5～6 d的子鼠的腳趾)，從后肢到前肢，從右到左依次編號。剪去的腳趾組織用于提取基因組DNA。基因組DNA提取大致步驟如下：(1)取小鼠腳趾(按1～10的順序)放入1.5 mL EP管中，適當離心30 s使其沉于管底。(2)加入30 μL裂解液(0.5% 20% Tween-20, 1 mol·L-1KCl 50 mmol·L-1,1M MgCl215 mmol·L-1, 1 mol·L-1Tris-HCl 2.5 mmol·L-1, pH 8.0，用前加200 mg·L-1蛋白酶K 3 μL),(3)55 ℃消化3～5 h, 12 000 r·min-1離心2 min, 95 ℃,15 min，滅活蛋白酶K，12 000 r·min-1離心2 min，所獲得的上清中DNA用于PCR模板，-20 ℃保存，用于基因型鑒定。

1.5.1App/Ps1轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定 App/Ps1雙轉(zhuǎn)基因小鼠B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/Nju基因型中，含有衰老基因序列ps1-dE9及App淀粉樣前體蛋白基因序列APPswe融合體。采用兩對引物1597/1598(App)和1644/1645(Ps1)進行小鼠基因型鑒定。引物1597和1598的序列分別為：5′-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3′和5′-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG-3′。引物1644和1645的序列分別為5′-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3′，5′-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3′。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60-65℃ 30 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 5 min，35個循環(huán)；10 ℃保存。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳完成后用Bio Rad凝膠電泳成像儀照相。

1.5.2FoxG1條件性過表達(CAG-loxp-stop-loxp-FoxG1-IRES-EGFP)小鼠的鑒定 引物GFP(up)和GFP(low)的序列分別為：5′- AAGGACGACGGCAACTACAAG-3′和5′-GGCGGTCACGAACTCCA-3′。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s,72 ℃ 5 min；35個循環(huán)；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳完成后用Bio Rad凝膠電泳成像儀照相。

1.5.3B6;129-5-HT1Btm1(CreERT)小鼠的鑒定 兩對引物5-HT1B-tR1/Neo-3F和5-HT1B-tF2/Neo-3R的序列分別為：5′- AAGCTAAGTTCCTCGGGTATGGAAG-3A和5′-TCTGAGGCGGAAAGAACCAG-3′；5′-CTTCTTCATCATCTCCCTGGTGATG-3′，5′-CTGGTTCTTTCCGCCTCAGA-3′ PCR反應條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s,72 ℃ 5 min；35個循環(huán)；10 ℃保存。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳完成后用Bio Rad凝膠電泳成像儀照相。

1.6 他莫昔芬給藥方式玉米油(A0395699，ACROS)配制他莫昔芬(# T5648，Sigma)終濃度為20 g·L-1，37 ℃搖床過夜混勻，分裝后-20 ℃避光保存。成年小鼠腹腔注射他莫昔芬(75 mg·kg-1)，隔天注射一次，連續(xù)2周。注射藥物后的小鼠隔離飼養(yǎng)，注意觀察。

1.7 組織準備小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定小鼠四肢，先用磷酸鹽緩沖液(PBS)快速灌注左心室，然后取腦放置冰上，4 ℃預冷的4%多聚甲醛充分灌注， 4%多聚甲醛后固定48 h。30%蔗糖脫水沉底。OCT包裹后速凍，冰凍切片機做大腦冠狀切片，片厚20 μm。

1.8 免疫組化取小鼠腦組織于4%多聚甲醛中固定48 h，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，制成6 μm厚冠狀面切片。切片常規(guī)脫蠟至水，微波爐修復抗原，冷卻后PBS洗滌，然后3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min，β-Amyloid一抗(1：800)孵育4 ℃冰箱過夜，PBS洗滌后，山羊抗鼠IgG二抗(1 ∶50)孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。經(jīng)DAB顯色，應用圖像分析系統(tǒng)測量每個視野內(nèi)陽性細胞數(shù)。

1.9 免疫熒光取小鼠腦組織于4%多聚甲醛中固定48 h后轉(zhuǎn)移入30%的蔗糖溶液中，直至腦組織沉底，進行OCT包埋，-80 ℃冰箱速凍，冰凍切片機冠狀面切片20 μm厚。PBS沖洗30 min后，微波爐抗原修復，降至室溫后PBS洗3次，10%山羊血清封閉90 min，GFP一抗(1 ∶50)過夜。Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG二抗(1 ∶500)避光孵育2 h后，PBS清洗3次，每次3 min，甘油封片，鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 阿爾茨海默病病變腦區(qū)FoxG1過表達小鼠的繁育方案FoxG1轉(zhuǎn)基因小鼠與海馬、皮層及紋狀體特異腦區(qū)表達Cre重組酶的B6;129-5-HT1Btm1 (CreERT) 工具小鼠交配，獲得的子代再與AD模型鼠App/ps1轉(zhuǎn)基因小鼠交配，得到在AD模型鼠病變腦區(qū)FoxG1條件性過表達小鼠。他莫昔芬注射誘導該小鼠(6月齡)海馬、皮層及紋狀體病變腦區(qū)過表達FoxG1蛋白。

Fig 2 Generation of mouse of FoxG1 overexpression in specific brain region based on App/Ps1mouse line

2.2 阿爾茨海默病模型小鼠的鑒定PCR鑒定(引物為1597和1598(App)以及1644和1645(ps1)結(jié)果見圖3A，擴增出350bp和608bp兩條條帶的為App/ps1小鼠，如泳道5、6；擴增出350bp一條條帶的為單純App基因型的小鼠，如泳道1、2、3、4、7。

免疫組化檢測該模型小鼠皮層A-β淀粉樣蛋白的表達，圖3B及3B'結(jié)果顯示，隨著周齡的增加，A-β淀粉樣蛋白在小鼠前額皮層表達增加(B：2月齡AD模型小鼠，B'：6月齡AD模型小鼠)。

2.3 FoxG1條件性過表達小鼠的鑒定雙重PCR鑒定FoxG1(引物為GFP(up)/GFP(low)以及鑒定Cre(5-HT1B-tR1/Neo-3F和5-HT1B-tF2//Neo-3R)，鑒定結(jié)果表明，若PCR同時擴增出FoxG1基因的目的條帶(378 bp)和Cre基因的目的條帶(364 bp)的為FoxG1條件性過表達小鼠，僅擴增出一條420 bp條帶為野生型小鼠，未擴增出FoxG1基因的目的條帶(378 b)但擴增出Cre基因的目的條帶364 bp的為Cre工具鼠。如圖4所示，編號3、4、6、7同時擴增出378bp的 FoxG1目的條帶和364bp的 Cre基因目的條帶，其中，編號3、4、7還擴增有420bp的 Cre目的條帶，可見，編號3、4、6、7的個體為FoxG1條件性過表達小鼠；編號2僅擴增出一條420 bp 的目的條帶，為野生型小鼠，編號5擴增出FoxG1基因的目的條帶378 b和420 bp目的條帶，為FoxG1轉(zhuǎn)基因小鼠。

2.4 阿爾茨海默病FoxG1條件性過表達小鼠的鑒定三重PCR鑒定FoxG1：引物為GFP(up)/GFP(low)，鑒定Cre(5-HT1B-tR1/Neo-3F和5-HT1B-tF2/Neo-3R)以及鑒定App/ps1(1597/1598及1644/1645)，結(jié)果表明，泳道5、9、10、11、12、15為AD FoxG1條件性過表達小鼠Cre-foxg1;App-ps1。

Fig 3 Genotype identification and comparison of β-amyloid protein expression for 2 and 6 months of App/ps1 mouse line A： Results of PCR； B： Expression of β-amyloid protein by immunohischemistry for 2 months. (B’) Expression of β-amyloid protein by immunohischemistry for 6 months.

Fig 4 Identification of FoxG1 conditional overexpression mouse line

Fig 5 Identification of App/ps1; Tg-FoxG1 mouse line

2.5 他莫昔芬誘導阿爾茨海默病模型鼠皮層FoxG1過表達6月齡AD FoxG1條件性過表達小鼠皮下注射他莫昔芬誘導Cre重組酶的表達，結(jié)果顯示：與野生型小鼠相比，AD FoxG1條件性過表達小鼠前額皮層FoxG1表達顯著增加。

Fig 6 Results of FoxG1 expression in the cortex in App/Ps1 mouse lineImmunofluorescence with an antibody specific to EGFP was conducted on coronal brain section. Remarkable elevation of FoxG1-EGFP protein expression was found in cortex in B6;129-5-HT1Btm1 (CreERT); CAG-loxp-FoxG1-EGFP mice compared to WT mice.

3 討論

許多神經(jīng)生物學疾病，如AD、抑郁癥等都與海馬神經(jīng)元變性、缺失密切相關(guān)[13]。近年來，大量實驗結(jié)果證明哺乳動物海馬齒狀回終生存在神經(jīng)發(fā)生，新生的神經(jīng)元成熟后參與整合到已經(jīng)存在的神經(jīng)環(huán)路中，可以補充和替代衰老的細胞而發(fā)揮生理功能，故此，促進海馬神經(jīng)發(fā)生能夠改善動物的認知功能，這為AD的治療帶來希望[14]。

人類FOX(human forkhead-box)基因家族是一類具有W1環(huán)、W2環(huán)和3個α螺旋組成的FOX結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族。FoxG1基因是FOX家族的重要成員之一，位于人染色體14q12其表達產(chǎn)物為FoxG1(又名腦因子-1, brain factor-1, BF-1)。大量研究表明FoxG1基因通過調(diào)控神經(jīng)干細胞的增值和分化在胚胎腦發(fā)育的過程中起著關(guān)鍵性的作用，如果FoxG1基因表達缺陷將導致大腦皮層結(jié)構(gòu)紊亂，出生后FoxG1仍持續(xù)表達于由端腦分化來的腦組織(大腦皮層、海馬及基底核)中，而AD與這些病變腦區(qū)密切相關(guān)，實驗室前期的研究結(jié)果表明AD的發(fā)生伴隨著皮層、海馬FoxG1蛋白表達的下調(diào)。2018年，東南大學趙春杰課題組發(fā)現(xiàn)FoxG1過表達于皮層邊緣區(qū)可以誘導Cajal-Retzius細胞轉(zhuǎn)化為海馬齒狀顆粒神經(jīng)元。那么能否靶向調(diào)控皮層邊緣區(qū)的FoxG1促進海馬齒狀顆粒神經(jīng)元的形成，進而拮抗AD引起我們的極大興趣，構(gòu)建AD病變腦區(qū)FoxG1過表達小鼠將為AD的機制研究及靶向治療提供必要的模型動物。

隨著分子生物學技術(shù)的不斷進展，轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術(shù)越來越成熟。條件性基因重組技術(shù)是將對某個基因的修飾限制于某些特定類型的細胞/組織或發(fā)育的某一特定時段，通常是在常規(guī)的基因重組基礎(chǔ)上，利用重組酶Cre介導的位點特異性重組技術(shù)，在某些修飾的時空范圍上設置一個可調(diào)控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾處于一種時空可控狀態(tài)[15]。

為了研究FoxG1基因?qū)τ贏D的改善、調(diào)控作用，我們需要在AD小鼠病變腦區(qū)誘導FoxG1過表達。該問題解決的關(guān)鍵點是：①AD模型鼠的選擇；②如何在AD病變腦區(qū)條件性誘導FoxG1過表達；③如何確保在AD出現(xiàn)典型的病理學改變-β Amyloid蛋白時驗證FoxG1的保護、調(diào)控機制。為了解決以上問題，我們①選擇了App/Ps1雙轉(zhuǎn)基因B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/Nju小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型中，含有衰老基因序列ps1-dE9及App淀粉樣前體蛋白基因序列APPswe融合體，能夠保證AD典型病理學標記物β Amyloid蛋白的出現(xiàn)，而衰老基因序列ps1-dE9的轉(zhuǎn)入又符合了AD作為一種老年病的機理有效性；②為了選擇AD的病變腦區(qū)，我們應用了啟動Cre重組酶的合理的啟動子5-HT1B，5-HT1BmRNA主要存在于紋狀體，海馬(CA1區(qū)的錐體細胞層)，前扣帶皮層(第4層)、基底神經(jīng)節(jié)的伏隔核，下丘腦核，選擇5-HT1B作為啟動子，進而保證FoxG1條件性過表達于AD的病變腦區(qū)；③前期實驗證明ADApp/Ps1雙轉(zhuǎn)基因小鼠6個月時β Amyloid蛋白才明顯增加，為了探索AD出現(xiàn)典型的病理學改變-β Amyloid蛋白時FoxG1的保護機制，我們選擇的Cre工具小鼠為B6;129-5-HT1Btm1(CreERT)，ERT2是一個改造過的雌激素受體，可以被他莫昔芬活化，他莫昔芬的代謝產(chǎn)物4-OHT(雌激素類似物)與ERT2結(jié)合后誘導CreERT2入核發(fā)揮其重組酶活性[12]，通過選擇他莫昔芬的注射時間，我們可以保證在AD出現(xiàn)典型的病理學改變-β Amyloid蛋白時研究FoxG1對AD的的保護功能及其機制。

基于以上重組策略，我們可以獲得AD病變腦區(qū)FoxG1條件性過表達小鼠，在該小鼠生長至6個月后腹腔注射他莫昔芬誘導FoxG1過表達，獲得最理性的構(gòu)建方案。此外，PCR，IHC及IF實驗結(jié)果表明：與野生型小鼠相比，本研究構(gòu)建的阿爾茨海默F(xiàn)oxG1過表達小鼠的大腦皮層FoxG1蛋白表達顯著增加。

綜上，應用合理的基因重組策略，成功制備了在AD病變腦區(qū)FoxG1過表達小鼠。為AD機制研究及靶向藥物的研發(fā)提供一個可信的動物模型。

(致謝：本課題是在江蘇大學醫(yī)學院行為醫(yī)學實驗室完成，感謝課題組肖栩、薛程、李曉輝、周漾同學參與了本課題的行為學實驗。)