阿司匹林通過(guò)抑制β-catenin/EMT信號(hào)通路促進(jìn)5-FU誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡

黃燕花，王魯妮，劉 澤，劉 凌

(南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院干部病房五科，廣東 廣州 510010)

食管癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤，其發(fā)病存在明顯的地域差異，以東亞多見(jiàn)，我國(guó)是食管癌發(fā)病大國(guó)。由于大部分患者就診時(shí)已經(jīng)處于食管癌晚期，已失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)，預(yù)后極差，其5年生存率僅為30%左右[1]。針對(duì)晚期食管癌患者，臨床上多采用聯(lián)合放化療，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)作為食管癌化療的常用藥，難免出現(xiàn)耐藥，因此增加其化療敏感性，延緩耐藥發(fā)生，對(duì)于食管癌患者的治療至關(guān)重要。阿司匹林(aspirin，ASA)是目前廣泛應(yīng)用的解熱鎮(zhèn)痛藥，研究表明阿司匹林還有抗腫瘤作用,阿司匹林的使用可減少胃腸癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌等發(fā)病率和死亡率[2]。

上皮細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是指上皮細(xì)胞表型改變、黏附能力減弱、極性丟失后導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲能力增強(qiáng)[3]。EMT不僅促進(jìn)腫瘤發(fā)生以及侵襲轉(zhuǎn)移，而且還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力[4]，從而誘導(dǎo)化療耐藥[5]。研究表明食管癌患者化療后殘余腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT與化療耐藥相關(guān)[6]，提示抑制EMT可能為提高食管癌化療敏感性的潛在靶標(biāo)，而阿司匹林是否可通過(guò)作用于該通路，從而抑制食管癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，尚待研究。

目前關(guān)于阿司匹林與5-FU聯(lián)合協(xié)同抗食管癌的相關(guān)研究仍未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)阿司匹林聯(lián)合5-FU作用于體外培養(yǎng)的ECA109細(xì)胞，觀察阿司匹林是否可以增加5-FU化療敏感性，抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)其凋亡，在此基礎(chǔ)上明確其作用機(jī)制，從而為臨床上應(yīng)用阿司匹林作為5-FU治療食管癌時(shí)的輔助用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人食管癌細(xì)胞株ECA109購(gòu)自中山大學(xué)細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖培養(yǎng)液(11995500BT)、胎牛血清(10270)、0.25%胰蛋白酶(25200-056)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；阿司匹林(A2093)、氟尿嘧啶(F6627)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；抗體 cleaved caspase-3(#9661)、Bcl-2(#3498)、E-cadherin(#3195)、N-cadherin(#13116)、β-catenin(#8480)購(gòu)自CST signaling；GAPDH(10494)，PCNA(10205)購(gòu)自 proteintech公司，凋亡試劑盒(AD10)，CCK-8(CK04)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本東仁化學(xué)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱(RSBiotech)；酶標(biāo)儀(BMG CLARIOstar? Plus)；流式細(xì)胞儀(BD LSRFortessa)；倒置熒光顯微鏡(olympus IX71)；化學(xué)發(fā)光儀(Tanon 4600)；電泳儀(北京六一)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌細(xì)胞株ECA109培養(yǎng)于含有10%FBS、1%青霉素和鏈霉素加DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi),每3～4天用0.25%胰蛋白酶消化，1 ∶3進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 ECA109細(xì)胞胰酶消化,制備單細(xì)胞懸液，1×104細(xì)胞接種于96孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h候待細(xì)胞貼壁，每孔加入含0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 g·L-1阿司匹林，0、0.01、0.02、0.1、0.2、0.5、1 mg·L-1的5-FU的培養(yǎng)基，設(shè)置無(wú)細(xì)胞DMEM培養(yǎng)基為對(duì)照組；作用24 h后，每孔加入10% CCK-8 100 μL，繼續(xù)孵育2 h，于酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處吸光度，并計(jì)算不同藥物對(duì)細(xì)胞增殖影響。

1.3.3細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用日本東仁凋亡檢測(cè)試劑盒，細(xì)胞分4組進(jìn)行處理：空白對(duì)照組，0.125 g·L-1阿司匹林組，0.1 mg·L-15-FU組，0.125 g·L-1阿司匹林+0.1 mg·L-15-FU組，六孔板培養(yǎng)24 h后，胰酶消化，PBS洗3次，100 μL binding buffer重懸，每管加入5 μL PI，5 μL Annexin V冰上孵育15 min，再加入400 μL binding buffer。1 h內(nèi)進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.3.4Western blot檢測(cè) 核蛋白采用碧云天核蛋白提取試劑盒，細(xì)胞分四組進(jìn)行處理：空白對(duì)照組，0.125 g·L-1的阿司匹林組，0.1 mg·L-1的5-FU組，0.125 g·L-1阿司匹林+0.1 mg·L-15-FU為聯(lián)合組?？偟鞍撞捎肦IPA細(xì)胞裂解液，100 ∶1加入PMSF，12 000轉(zhuǎn)4 ℃離心15 min，取上清，加入5X上樣緩沖液，將樣品放入100 ℃煮沸5 min，蛋白變性后放于-80 ℃保存?zhèn)溆?。SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠恒壓80 V，40 min，分離120 V，80 min。轉(zhuǎn)至PVDF膜，200 mA恒流，2 h。5%BSA封閉1～2 h，TBST洗2次，一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗3次，二抗孵育1.5 h，TBST洗3次，ECL發(fā)光。ImageJ軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 5-FU、阿司匹林單用或聯(lián)用對(duì)食管癌ECA109細(xì)胞增殖的影響CCK-8檢測(cè)結(jié)果，如Fig 1所示，采用不同濃度的阿司匹林(0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 g·L-1)分別干預(yù)ECA109細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)阿司匹林對(duì)ECA細(xì)胞的增殖有不同程度抑制作用，并呈濃度依賴性，但只有當(dāng)阿司匹林濃度≥0.25 g·L-1，與空白組比較差異具有顯著性(P<0.05)。采用不同濃度的5-FU(0.01、0.02、0.1、0.2、0.5、1 mg·L-1)分別干預(yù)ECA109細(xì)胞，當(dāng)5-FU濃度≥0.02 mg·L-1,與空白組比較差異具有顯著性(P<0.05)。將0.125 g·L-1和0.25 g·L-1濃度的阿司匹林分別與0.1 mg·L-1濃度的5-FU聯(lián)合應(yīng)用于ECA109細(xì)胞，細(xì)胞增殖都能被更有效抑制。提示低濃度無(wú)毒性阿司匹林能加強(qiáng)5-FU對(duì)ECA109細(xì)胞增殖抑制作用。

Fig 1 Effects of aspirin and 5-FU alone or their combination on proliferation of ECA109 cells n=3)NC: Negative control, ASA: Aspirin. *P<0.05, **P<0.01 vs NC, #P<0.5, ##P<0.01 vs 5-FU, △△P<0.01 vs 5-FU+ASA

1：NC; 2: ASA (0.125 g·L-1); 3: ASA (0.25 g·L-1); 4: 5-FU(0.1 mg·L-1)；5：5-FU(0.1 mg·L-1)+ASA(0.125 g·L-1)； 6：5-FU(0.1 mg·L-1)+ASA(0.25 g·L-1)

2.2 5-FU 和阿司匹林單用或聯(lián)用對(duì)食管癌ECA109細(xì)胞凋亡的影響如Fig 2顯示，與對(duì)照組(8.3%±0.7%)相比，單用阿司匹林組(8.9%±0.7%)對(duì)細(xì)胞的凋亡無(wú)影響(P=0.36),5-FU組(13.5%±0.8%)使ECA199細(xì)胞的凋亡率升高(P=0.001)。5-FU與阿司匹林聯(lián)合用藥組(23.7%±4.8%)對(duì)ECA109細(xì)胞的凋亡效率明顯高于5-FU組(P=0.024)。

2.3 5-FU 和阿司匹林單用或聯(lián)用對(duì)凋亡蛋白Bcl-2和cleaved caspase-3表達(dá)的影響進(jìn)一步采用Western blot檢測(cè)凋亡蛋白的表達(dá)。如Fig 3所示，與單用5-FU組比較(Bcl-2：0.83±0.14；cleaved caspase-3：0.61±0.11)，5-FU+阿司匹林組聯(lián)用組(Bcl-2：0.34±0.13，P=0.013；cleaved caspase-3：0.91±0.14，P=0.043)處理ECA109細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。與空白組相比，單用低濃度阿司匹林對(duì)Bcl-2 和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)無(wú)影響。提示低濃度無(wú)毒性阿司匹林加強(qiáng)5-FU誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡。

Fig 2 The apoptotic rate of ECA109 cells treated by single aspirin, 5-FU or their n=3)NC: Negative control, ASA: Aspirin. **P<0.01 vs NC, #P<0.5 vs 5-FU

2.4 阿司匹林通過(guò)抑制ECA109細(xì)胞EMT提高5-FU化療敏感性在EMT期間，上皮細(xì)胞逐漸失去鵝卵石樣上皮的形態(tài)，變成呈紡錘形間充質(zhì)形態(tài)，大多數(shù)由此產(chǎn)生的間充質(zhì)細(xì)胞可以逆轉(zhuǎn)恢復(fù)上皮細(xì)胞狀態(tài)，稱為間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化[7]。如Fig 4所示，EMT形態(tài)學(xué)變化，經(jīng)過(guò)低濃度阿司匹林處理后ECA109細(xì)胞從紡錘型外觀變成鵝卵石樣形態(tài)，提示阿司匹林促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化。如Fig 3所示，EMT分子水平表現(xiàn)上，與對(duì)照組(N-cadherin：1.34±0.16；E-cadherin：0.47±0.1；β-catenin：0.70±0.09)相比，阿司匹林單用處理ECA109細(xì)胞后均會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞顯著下調(diào)間質(zhì)性蛋白N-cadherin(N-cadherin：0.84±0.10，P=0.01)、上調(diào)上皮標(biāo)記蛋白E-Cadherin(E-cadherin,：1.26±0.14；P=0.01)和下調(diào)β-catenin蛋白(β-catenin:0.39±0.02,P=0.004)。與5-FU單用組比(N-cadherin：1.29±0.14；E-cadherin：0.79±0.16；β-catenin：0.69±0.05)，5-FU 和阿司匹林聯(lián)用組也能下調(diào)N-cadherin(0.42±0.10,P=0.001)、上調(diào)E-cadherin(1.24±0.16,P=0.026)、下調(diào)β-catenin(0.33±0.08，P=0.003)蛋白表達(dá)。

Fig 3 Effects of aspirin and 5-FU alone or their combination on protein expression of Bcl-2, cleaved caspases-3, N-cadherin, E-cadherin and β-catenin in ECA109 n=3)NC: Negative control; ASA: Aspirin; ECA: E-cadherin; NCA: N-cadherin; cl-c3: Cleaved caspases-3. *P<0.5, **P<0.01 vs NC, #P<0.5, ##P<0.01 vs 5-FU

Fig 4 EMT in ECA109 cells promoted by aspirin

3 討論

目前臨床上食管癌治療中，5-FU是一線化療藥物之一，因化療耐藥單藥化療有效率僅為10%～25%，聯(lián)合化療雖然能提高化療效率卻增加化療毒副作用[8]。同時(shí)5-FU的毒副作用呈劑量依賴性，對(duì)骨髓和消化道毒性較大，能否將本身無(wú)毒副作用且增加化療有效性的藥物與5-FU 聯(lián)用，既可減少5-FU的使用劑量，又可提高5-FU藥效是近年關(guān)注的焦點(diǎn)。阿司匹林能增強(qiáng)抗腫瘤作用，但阿司匹林有增加出血的風(fēng)險(xiǎn)。研究指出服用常規(guī)劑量(≥75 mg·d-1)阿司匹林能增加94%嚴(yán)重消化道出血發(fā)生率，53%顱內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)和47%腦出血風(fēng)險(xiǎn)[9]。我們希望服用低劑量阿司匹林不影響其抗腫瘤效果，且不增加消化道出血風(fēng)險(xiǎn)，但關(guān)于最低有效劑量的定義目前尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。歐洲(阿司匹林50～325 mg·d-1)[10]和中國(guó)(阿司匹林80 mg·d-1)[11]的前瞻性研究均發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期低劑量服用阿司匹林可降低癌癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，包括肝癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、白血病等。有文獻(xiàn)報(bào)道阿司匹林聯(lián)合5-FU應(yīng)用于HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞，通過(guò)誘發(fā)凋亡取得較好抗腫瘤作用[12]。目前尚無(wú)阿司匹林聯(lián)合5-FU協(xié)同抗食管癌的研究，本研究主要探討無(wú)明顯細(xì)胞毒性劑量阿司匹林增強(qiáng)5-FU對(duì)食管癌增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡作用。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的有效策略，當(dāng)細(xì)胞凋亡受到抑制時(shí)，可引起腫瘤細(xì)胞耐藥[5]。5-FU耐藥的重要原因之一，便是凋亡抑制[13]。阿司匹林抗腫瘤作用也可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞活性、破壞腫瘤微環(huán)境、抑制腫瘤細(xì)胞炎癥、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞免疫、阻止腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、破壞對(duì)腫瘤細(xì)胞死亡的抵抗力并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡等[14]。本研究證實(shí)，雖然單藥無(wú)毒性劑量阿司匹林對(duì)ECA109細(xì)胞凋亡、增殖無(wú)影響，但與5-FU聯(lián)用時(shí)，可明顯增加ECA109細(xì)胞凋亡率，提示低劑量阿司匹林協(xié)同5-FU誘發(fā)更多食管癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是受多種基因精確調(diào)控的主動(dòng)的、程序化的死亡過(guò)程。作為凋亡蛋白，Bcl-2是抑制凋亡基因，下調(diào)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮協(xié)同促凋亡效應(yīng)；cleaved caspase-3是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游效應(yīng)分子，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最關(guān)鍵的執(zhí)行者。Western blot檢測(cè)證明5-FU抑制抗凋亡Bcl-2蛋白的表達(dá)和促進(jìn)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)ECA109細(xì)胞發(fā)生凋亡，且阿司匹林能增強(qiáng)5-FU促凋亡效果。與既往研究不同的是，文獻(xiàn)指出高濃度阿司匹林可下調(diào)Bcl-2蛋白和上調(diào)caspases-3蛋白進(jìn)而誘發(fā)膽管癌細(xì)胞[15]凋亡，由于本研究采用無(wú)毒性低濃度，單用阿司匹林對(duì)Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)和凋亡均無(wú)影響。

EMT的發(fā)生不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，也與腫瘤耐藥密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞在產(chǎn)生耐藥的過(guò)程中常伴隨著間質(zhì)化的改變，而具有間質(zhì)化的改變的腫瘤細(xì)胞也常變現(xiàn)為耐藥的特點(diǎn)。發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞?？色@得凋亡抑制而抑制EMT可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]。EMT的發(fā)生常伴隨細(xì)胞形態(tài)的改變(獲得紡錘狀/成纖維細(xì)胞形態(tài))、上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白丟失(E-cadherin)、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白上調(diào)(N-cadherin、vimentin等)、細(xì)胞外基質(zhì)的改變等。β-catenin/E-cadherin黏附復(fù)合體對(duì)維持上皮完整起著其中重要作用，當(dāng)發(fā)生EMT時(shí)，β-catenin從黏附復(fù)合體中大量釋放至細(xì)胞質(zhì)而入核，同時(shí)伴隨E-cadherin表達(dá)下調(diào)，N-cadherin表達(dá)上調(diào)。本研究表明阿司匹林可通過(guò)減少核內(nèi)β-catenin含量，誘使N-cadherin下調(diào)、E-cadherin上調(diào)，進(jìn)而抑制ECA109細(xì)胞的EMT進(jìn)程，提示抑制β-catenin/EMT信號(hào)通路是阿司匹林協(xié)同5-FU抑制ECA109細(xì)胞增殖、促進(jìn)ECA109細(xì)胞凋亡重要機(jī)制。

綜上所述，在低濃度無(wú)毒性阿司匹林作用下，5-FU抑制ECA109細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)ECA109細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)，其機(jī)制可能與抑制β-catenin/EMT信號(hào)通路有關(guān)。本研究為阿司匹林聯(lián)合5-FU應(yīng)用于食管癌治療，提高5-FU化療敏感性提供了參考依據(jù)。下一步我們擬構(gòu)建荷瘤小鼠模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證阿司匹林聯(lián)合5-FU對(duì)食管癌的影響。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在南方醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室完成，在此感謝所有對(duì)本實(shí)驗(yàn)支持和幫助的人。)