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      黃連解毒湯調(diào)控NLRP3炎癥小體改善動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制研究①

      2020-05-13 11:02:00許麗婷于紅紅喻旭梅徐彬人田維毅
      中國免疫學(xué)雜志 2020年7期
      關(guān)鍵詞:油紅黃連主動(dòng)脈

      許麗婷 于紅紅 許 滔 喻旭梅 徐彬人 田維毅 俞 琦

      (貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴陽 550025)

      心血管疾病是全球范圍內(nèi)造成死亡的主要原因之一,截至2018年我國患心血管疾病人數(shù)高達(dá)2.9億[1]。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心血管疾病的常見病理過程,能夠?qū)е卵塥M窄性堵塞[2]。炎癥在AS發(fā)病過程中起重要作用,NLRP3炎癥小體是AS過程中的主要炎癥因子,能夠活化Caspase-1,使pro-IL-1β和pro-IL-18切割成成熟的IL-1β和IL-18,并引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)。因此干預(yù)NLRP3炎癥小體可以影響AS的病理過程[3]。黃連解毒湯出自中醫(yī)古籍《外臺(tái)秘要》,是經(jīng)典的清泄三焦之火的中藥方劑。研究表明黃連解毒湯具有抗炎和降脂的藥理作用,同時(shí)能調(diào)控AS中的脂質(zhì)和炎癥因子,達(dá)到抑制AS的治療作用[4-6]。本研究采用載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠建立AS模型[7],探討黃連解毒湯調(diào)控NLRP3炎癥小體對AS病變過程中炎癥因子的影響及其作用機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1材料 SPF級ApoE-/-小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號為:SCXK(京)2016-0006,體重18~22 g。黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏和梔子組成,為中藥飲片,購自同濟(jì)堂貴陽分店,經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定為正品。三酰甘油(triglyceride,TG)測定試劑盒、總膽固醇(total cholesterol,TC)測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;TNF-α、IL-18和IL-1β ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;蘇木素染液、伊紅染液購自武漢賽維爾生物科技有限公司;油紅O染色試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司;RNA提取試劑盒購自美國Omega公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;實(shí)時(shí)定量PCR儀、凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司;全波長酶標(biāo)儀、核酸蛋白分析儀、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購自美國Thermo Scientific公司 ;DYCP-31DN型電泳儀購自北京六一儀器廠;vx-55高壓滅菌鍋購自德國 Systec公司;XSZ-HS3顯微鏡購自重慶光學(xué)儀器廠;sw-C7-2H潔凈工作臺(tái)購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

      1.2方法

      1.2.1小鼠AS模型制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始造模。ApoE-/-小鼠30只,給予含脂肪21%、膽固醇0.15%的“西方類型膳食”照射滅菌高脂飼料;6只ApoE-/-小鼠給予照射滅菌的普通飼料。分別喂養(yǎng)12周。

      1.2.2動(dòng)物分組及藥物處理 普通飼料喂養(yǎng)的小鼠為空白組(control group),將AS模型小鼠隨機(jī)分成模型組(model group)、陽性組(positive group)、黃連解毒湯大劑量組(HJD-H group)、黃連解毒湯中劑量組(HJD-M group)、黃連解毒湯小劑量組(HJD-L group),每組6只,造模12周后灌胃給藥6周,每天1次。空白組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

      1.2.3各組小鼠體重計(jì)量 用電子秤稱量小鼠體重,監(jiān)測小鼠在AS病變過程中的體重變化情況。

      1.2.4小鼠主動(dòng)脈HE染色 給藥結(jié)束后,取一部分小鼠主動(dòng)脈組織于液氮速凍30 min后保存于-80℃,一部分主動(dòng)脈用4%的多聚甲醛中固定。將主動(dòng)脈鋪平后進(jìn)行石蠟包埋,置于二甲苯中固定20 min。依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min,二甲苯Ⅱ20 min,無水乙醇Ⅰ10 min,無水乙醇Ⅱ10 min,95%酒精5 min,90%酒精5 min,80%酒精5 min,70%酒精5 min,蒸餾水洗脫蠟。脫蠟至水后,加入蘇木素染液5 min,1%的鹽酸酒精分化,0.6%氨水返藍(lán),流水沖洗,加入伊紅染液2 min。脫水后用中性樹膠封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化并拍照記錄。

      1.2.5油紅O染色 主動(dòng)脈竇橫切面:將主動(dòng)脈竇部進(jìn)行橫切制作成冷凍切片,用4%多聚甲醛固定后加入油紅工作液,用75%酒精分化后進(jìn)行細(xì)胞核蘇木素復(fù)染,用甘油封片。主動(dòng)脈大體油紅:取新鮮主動(dòng)脈組織于固定液中固定24 h,用解剖剪沿血管壁小心地將血管縱向剖開,將剖開的血管浸入油紅染液中,37℃染色60 min后取出,用75%乙醇分化至管腔內(nèi)脂肪斑塊呈橘紅色或鮮紅色,將染好的大體組織固定好進(jìn)行拍照,用Image J軟件分析斑塊面積。

      1.2.6免疫組化染色 依次將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ15 min,二甲苯Ⅱ15 min,二甲苯Ⅲ15 min,無水乙醇Ⅰ5 min,無水乙醇Ⅱ5 min,85%酒精5 min,75%酒精5 min,蒸餾水洗脫蠟。將組織切片置于檸檬酸(pH6.0)抗原修復(fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù)。用3%雙氧水溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后進(jìn)行血清封閉。加一抗4℃孵育過夜,加二抗室溫孵育50 min。DAB顯色后加入蘇木素進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染。最后脫水封片,用顯微鏡觀察分析并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

      1.2.7ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-18和IL-1β含量 血清中的TNF-α、IL-18和IL-1β含量采用ELISA進(jìn)行檢測,具體操作參考試劑盒說明書。

      1.2.8血脂檢測 采用GPO-PAP酶法檢測TC和TG含量,按試劑盒說明書操作,用酶標(biāo)儀檢測510 nm 波長OD值并計(jì)算出血清TC和TG的含量。采用直接法檢測HDL-C和LDL-C,按試劑盒說明書操作,酶標(biāo)儀檢測546 nm波長OD值并計(jì)算出血清HDL-C和LDL-C的含量。

      1.2.9RT-qPCR檢測主動(dòng)脈組織中IL-1β、Caspa-se-1、NLRP3和TNF-α mRNA的表達(dá) 按OMEGA試劑盒說明書提取小鼠主動(dòng)脈中的RNA,得到純度較高完整性較好的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,以RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA。加入表1中引物,用熒光擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火30 s,40個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。

      2 結(jié)果

      2.1黃連解毒湯灌胃后小鼠的體重變化 記錄小鼠給藥過程中每周的體重變化。與空白組比較,模型組體重增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,陽性組、小劑量組和中劑量組小鼠體重減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),大劑量組體重變化不明顯。見圖1。

      2.2黃連解毒湯對小鼠血清中HDL-C、LDL-C、TC和TG水平的影響 與空白組比較,模型組LDL-C、TC和TG水平均增高,HDL-C減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比,陽性組、黃連解毒湯各劑量組LDL-C、TC和TG水平均降低,陽性組和中劑量組HDL-C水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

      表1 RT-qPCR目的基因引物序列

      Tab.1 RT-qPCR target gene primer sequence

      GenePrimerLength(bp)GAPDHF:5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′R:5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′95NLRP3F:5′-CTTTATCCACTGCCGAGAG-3′R:5′-AGCTCATCAAAGCCATCC-3′151TNF-αF:5′-GCAAAGGGAGAGTGGTCA-3′R:5′-CTGGCTCTGTGAGGAAGG-3′128IL-1βF:5′-CCCCAGGGCATGTTAAGGAG-3′R:5′-GTCTTGGCCGAGGACTAAGG-3′94Caspase-1F:5′-ACAACCACTCGTACACGTCTTGC-3′R:5′-CCAGATCCTCCAGCAGCAACTTC-3′115

      圖1 小鼠給藥時(shí)的體重變化Fig.1 Changes of weight when administered to mice

      2.3黃連解毒湯對小鼠血清TNF-α、IL-18和IL-1β含量的影響 與空白組比較,模型組小鼠血清TNF-α、IL-18、IL-1β表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。與模型組比較,陽性組、黃連解毒物各劑量組小鼠血清TNF-α、IL-18、IL-1β表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。見表2。

      2.4HE染色觀察主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化 與空白組對比,模型組主動(dòng)脈斑塊面積增大(P<0.05),主動(dòng)脈血管壁增厚且厚薄不一,可見泡沫細(xì)胞形成的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。與模型組對比,陽性組、黃連解毒湯各劑量組小鼠主動(dòng)脈血管泡沫化程度減輕,斑塊面積明顯減少(P<0.05);黃連解毒湯中劑量組斑塊面積減少最顯著(P<0.05)。見圖3、4。

      圖2 小鼠HDL-C、LDL-C、TC和TG水平的測定結(jié)果Fig.2 Determination of HDL-C,LDL-C,TC and TG in miceNote: Compared with the control group,*.P<0.05;compared with the model group,#.P<0.05;compared with the HJD-L group,△.P<0.05;compared with the HJD-M group,★.P<0.05.

      GroupsTNF-α (pg/ml)IL-1β (pg/ml)IL-18 (pg/ml)Control group78.98±0.131 059.30±68.6228.68±0.38Model group137.83±0.131)2 199.60±84.811)73.78±0.051)HJD-L group117.01±0.092)1 006.48±93.272)60.82±0.022)HJD-M group114.05±0.312)3)948.49±60.702)58.32±0.052)3)HJD-H group131.95±0.202)3)4)1 157.23±78.892)3)4)63.55±0.032)3)4)Positive group110.98±0.112)1 093.71±37.952)55.17±0.032)

      Note:Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05;compared with the HJD-L group,3)P<0.05;compared with the HJD-M group,4)P<0.05.

      圖3 HE染色觀察小鼠主動(dòng)脈斑塊大小(×50)Fig.3 HE staining of mouse aortic plaque size(×50)Note: A.Control group;B.Model group;C.HJD-L group;D.HJD-M group;E.HJD-H group;F.Positive group.

      圖4 小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積Fig.4 Area of mouse aortic atherosclerotic plaqueNote: Compared with the control group,*.P<0.05;compared with the model group,#.P<0.05;compared with the HJD-L group,△.P<0.05;compared with the HJD-M group,★.P<0.05.

      圖5 小鼠主動(dòng)脈大體油紅O染色Fig.5 Mouse aorta with general oil red O stainingNote: A.Control group;B.Model group;C.HJD-L group;D.HJD-M group;E.HJD-H group;F.Positive group.

      2.5油紅O染色評估AS斑塊的形態(tài)和面積 油紅O染色顯示,與空白組相比,模型組主動(dòng)脈出現(xiàn)斑塊面積明顯增加(P<0.05)。與模型組對比,陽性組和黃連解毒湯各劑量組斑塊面積明顯減少,中劑量組斑塊面積減少最明顯(P<0.05)。見圖5~7。

      圖6 小鼠主動(dòng)脈竇油紅O染色(×40)Fig.6 Oil red O staining of mouse aortic sinus(×40)Note: A.Control group;B.Model group;C.HJD-L group;D.HJD-M group;E.HJD-H group;F.Positive group.

      圖7 小鼠主動(dòng)脈油紅O染色斑塊面積Fig.7 Oil red O staining plaque area of aorticNote: Compared with the control group,*.P<0.05;compared with the model group,#.P<0.05;compared with the HJD-L group,P<0.05;compared with the HJD-M group,★.P<0.05.

      圖8 免疫組化檢測小鼠主動(dòng)脈竇NLRP3(×200)Fig.8 Immunohistochemical detection of mouse aortic sinus NLRP3(×200)Note: A.Control group;B.Model group;C.HJD-L group;D.HJD-M group;E.HJD-H group;F.Positive group.

      圖9 小鼠主動(dòng)脈組織中IL-1β、Caspase-1、NLRP3、TNF-α mRNA表達(dá)量Fig.9 IL-1β,Caspase-1,NLRP3,TNF-α mRNA expression in mouse aortic tissueNote: Compared with the control group,*.P<0.05;compared with the model group,#.P<0.05;compared with the HJD-L group,△.P<0.05.

      2.6NLRP3免疫組織化學(xué)檢測 細(xì)胞核為藍(lán)色,DAB顯示的陽性表達(dá)為棕黃色。與空白組比較,模型組NLRP3更為明顯。與模型組比較,黃連解毒湯小劑量組、中劑量組、大劑量組和陽性組NLRP3減少,中劑量組減少效果更為明顯,見圖8。

      2.7黃連解毒湯對小鼠主動(dòng)脈組織中IL-1β、Casp-ase-1、NLRP3和TNF-α mRNA表達(dá)影響 與空白組比較,模型組IL-1β、Caspase-1、NLRP3、TNF-α mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)。與模型組對比,黃連解毒湯中劑量組、高劑量組和陽性組的IL-1β、Caspase-1、NLRP3、TNF-α mRNA含量均顯著降低(P<0.05),小劑量組IL-1β、Caspase-1 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)。見圖9。

      3 討論

      AS是一種慢性炎癥性疾病,由動(dòng)脈脂質(zhì)沉積和炎癥的惡性循環(huán)引起[8,9]。中醫(yī)認(rèn)為,AS是由于氣血運(yùn)行失調(diào)引起各種病理產(chǎn)物堆積造成的,主要的病理產(chǎn)物有血瘀、痰濁、熱毒,可累及全身使患者出現(xiàn)AS病變的臨床癥狀[10]。黃連解毒湯記載于《外臺(tái)秘要》,對熱毒熾盛、機(jī)體失調(diào)引起的癡呆、胃熱型潰瘍、痔瘡、AS等內(nèi)外婦兒疾病均有顯著療效[7,11]。黃連解毒湯通過降低血脂、抑制炎癥反應(yīng)[12,13],減少主動(dòng)脈上泡沫細(xì)胞的數(shù)量,減輕小鼠AS斑塊的病理損傷[5,14],達(dá)到抗AS的作用。

      血脂含量異常會(huì)增加AS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[15]。HDL-C可清除血液中的LDL-C和中密度脂蛋白達(dá)到抗AS的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn),黃連解毒湯小劑量組和中劑量組小鼠血清LDL-C、TC和TG水平明顯降低,同時(shí)HDL-C水平顯著升高。說明一定劑量范圍的黃連解毒湯能增加AS小鼠的HDL-C水平和下調(diào)LDL-C、TC、TG水平,這與劉玲等[13]和伍世文等[4]的研究一致。同時(shí),高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠體重增長較快,經(jīng)黃連解毒湯治療后,小、中劑量組小鼠體重顯著降低,說明黃連解毒湯能抑制AS模型小鼠的體重上升。為了研究黃連解毒湯對AS斑塊的影響,本研究通過組織形態(tài)計(jì)量,采用HE染色和油紅O染色觀察主動(dòng)脈組織,結(jié)果顯示,模型組出現(xiàn)明顯斑塊,提示造模成功。陽性對照組和小、中劑量組斑塊明顯減少,提示一定劑量的黃連解毒湯具有減少AS斑塊的作用,其中,中劑量組治療效果最為顯著。

      在AS病變過程中,大量炎癥因子和脂質(zhì)在血管壁積聚,激活免疫細(xì)胞使血管內(nèi)細(xì)胞受損,促進(jìn)炎癥反應(yīng),從而使膽固醇自胞內(nèi)外流并堆積,形成AS斑塊[11]。NF-κB通路是體內(nèi)關(guān)鍵的炎癥信號傳導(dǎo)途徑之一,NLRP3炎癥小體和TNF-α在該通路上起重要作用,共同促進(jìn)炎癥的形成[17],NLRP3炎癥小體被認(rèn)為是AS有力的藥物靶標(biāo)[9]。NLRP3炎癥小體是由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和Caspase-1組成[18],高脂飲食誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化,激活的Caspase-1介導(dǎo)IL-1β和IL-18的成熟,增強(qiáng)炎癥和AS斑塊生成[19]。本研究結(jié)果表明,模型組NLRP3、Caspase-1、IL-1β和TNF-α mRNA含量均升高,NLRP3表達(dá)更為明顯且血清IL-1β、IL-18和TNF-α高表達(dá)。經(jīng)過一定劑量黃連解毒湯治療后,血清炎癥因子IL-1β、IL-18和TNF-α表達(dá)量下調(diào),NLRP3炎癥小體通路上的NLRP3蛋白和NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TNF-α mRNA指標(biāo)含量均降低。提示黃連解毒湯抗AS作用可能與抑制NLRP3炎癥小體有關(guān)。說明黃連解毒湯可通過調(diào)控NLRP3炎癥小體阻斷IL-1β和IL-18的成熟和分泌來減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

      綜上所述,一定濃度的黃連解毒湯能夠改善AS小鼠體重和血脂,減少小鼠AS斑塊的面積;更值得注意的是,黃連解毒湯可抑制NLRP3炎癥小體及其活化通路中Caspase-1、IL-1β、IL-18和TNF-α mRNA的表達(dá),推測與其抗AS的作用有關(guān)。其中,黃連解毒湯中劑量對NLRP3炎癥小體的調(diào)控效果最顯著。黃連解毒湯治療小鼠AS模型的量效關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

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