李文武 鮑傳裕 李元明
(海南省人民醫(yī)院急診內(nèi)科,???570311)
急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是指肝臟合成、排泄、解毒與生物轉(zhuǎn)化功能發(fā)生不同程度障礙,部分患者可由失代償引起,導(dǎo)致肝臟產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷[1]。ALF病因復(fù)雜,且發(fā)病后短期能引起劇烈的肝功能喪失,引起大量干細(xì)胞壞死,嚴(yán)重者將會(huì)引起肝昏迷[2]。我國(guó)ALF患者主要由病毒性肝炎引起,臨床多以傳統(tǒng)藥物治療為主,雖然能改善患者癥狀,但是治療預(yù)后較差[3]。近年來(lái),隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展,干細(xì)胞移植開始用于ALF患者中,其具有操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用靈活、免疫源性弱,再加上治療費(fèi)用低等特點(diǎn),成為肝臟移植后急性肝衰竭有效的治療方法[4]。ALF的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素過(guò)程,常涉及多種炎癥因子與細(xì)胞因子,其發(fā)病機(jī)制與肝細(xì)胞凋亡存在緊密聯(lián)系[5]。當(dāng)機(jī)體感染后炎癥因子能介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡、壞死,再加上自身調(diào)節(jié)抗炎因子的釋放,能抑制免疫完成炎癥反應(yīng)的調(diào)控[6,7]。IL-10來(lái)源于Th2和部分調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,能抑制Th1細(xì)胞應(yīng)答與合成細(xì)胞因子,能抑制巨噬細(xì)胞的抗原提呈功能與細(xì)胞因子的合成,能促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化及抗體產(chǎn)生[8]。目前,臨床上對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在ALF中的作用機(jī)制及對(duì)IL-10水平的影響研究較少[9]。因此,本文采用病例隨機(jī)對(duì)照方法開展研究,探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在急性肝衰竭中的應(yīng)用效果及對(duì)IL-10水平的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1材料
1.1.1主要試劑與儀器 全自動(dòng)生化分析儀(Beckman Coulter公司);水合氯醛(吉林省康達(dá)動(dòng)物藥液有限公司);蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);中性樹脂(北京中山生物技術(shù)有限公司);生物組織石蠟包埋機(jī)(湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司);兔抗大鼠CD45、CD44、CD29、CD90(美國(guó)Abcam公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beeton Dickinson公司);外科手術(shù)器械(成都市科匯醫(yī)療器械有限責(zé)任公司)。
1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇42只SD大鼠作為試驗(yàn)對(duì)象,雌雄不限,體質(zhì)量245~304 g,平均(281.68±8.74)g,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK-2014-0016。所選動(dòng)物均由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng),自由攝食、飲水,光照12 h,建模前12 h禁食。2只2周齡SD大鼠完成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離制備;40只SD大鼠中隨機(jī)取10只設(shè)為假手術(shù)組;剩余30只大鼠制備大鼠急性肝衰竭動(dòng)物模型。建模成功后隨機(jī)將大鼠分為模型對(duì)照組(n=15)和治療組(n=15)。
1.2方法
1.2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離制備及鑒定 ①細(xì)胞的分離與培養(yǎng):選擇2只2周齡的SD大鼠,以斷頸方式處死,并放置在75.0%乙醇中連續(xù)進(jìn)行20 min 浸泡,采用紫外燈完成超凈臺(tái)的消毒。上述操作完畢后在超凈臺(tái)上取大鼠股骨、脛骨,去除附著的皮肉后采用PBS進(jìn)行浸泡、沖洗。取剝離干凈的股骨頭,將其兩端切開,采用5 ml注射器抽取無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,將骨髓細(xì)胞沖出,用離心管收集,50 μm網(wǎng)篩過(guò)濾。離心后去除上層清液,加入DMEM中連續(xù)10次吹打,使得細(xì)胞分布均勻,再次離心后進(jìn)行多次洗滌,吹打均勻后加入小培養(yǎng)瓶,加入含10.0%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。37℃下常規(guī)放入培養(yǎng)箱中,24 h后首次換液,此后每3 d換液一次,觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量,待細(xì)胞融合80.0%后進(jìn)行傳代培養(yǎng),取第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞備用[10]。②細(xì)胞鑒定:常規(guī)條件培養(yǎng)下加入低糖DMEM培養(yǎng)基、10.0%胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞融合80.0%以上后加入胰酶進(jìn)行消化,制成單細(xì)胞懸液,采用PBS吹打離心,清洗2次后獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,電子顯微鏡下觀察細(xì)胞并完成細(xì)胞計(jì)數(shù),每份細(xì)胞樣本保證達(dá)到106級(jí);向細(xì)胞中加入MSCs表面標(biāo)記的兔抗大鼠CD45、CD44、CD29、CD90,采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析[11]。
1.2.2急性肝衰竭動(dòng)物模型建立及處理 ①急性動(dòng)物模型建立:取參與建模的SD大鼠30只,建模前12 h禁食,6 h禁水。采用濃度為10.0%水合氯醛進(jìn)行麻醉,劑量0.3 ml/100 g,在麻醉狀態(tài)下取10.0%D-氨基半乳糖1.4 g/(kg·次)與0.005%脂多糖20 μg/kg經(jīng)腹腔注射,制備大鼠急性肝衰竭動(dòng)物模型[12,13]。建模成功后隨機(jī)將大鼠分為模型對(duì)照組(n=15)和治療組(n=15)。②處理方法:假手術(shù)組與模型對(duì)照組腹腔注射等體積生理鹽水,治療組經(jīng)尾靜脈注射第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1.4×107細(xì)胞/kg。
1.2.3觀察指標(biāo) ①骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)與鑒定:觀察分離制備的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)與干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45、CD44、CD29、CD90表達(dá)情況。②肝功能水平:分別在移植前、移植后48 h收集血液樣本,1 726 g離心35 min,血清分離后采用全自動(dòng)生化分析儀完成大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)及白蛋白(ALB)水平[14,15]。③炎癥因子水平:取上述分離的血清標(biāo)本,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)完成大鼠TNF-α、IL-6、IL-10水平[16,17]。④肝臟組織切片HE染色:各組大鼠干預(yù)后48 h每組取大鼠5只,以斷頸法處死,立即開腹切除肝臟組織,剪成體積為0.5 cm3小塊,去除多余的血跡、組織,放置在中性福爾馬林溶液中,固定。石蠟包埋后制備4 μm切片,完成HE染色,在光鏡下觀察組織的病理學(xué)變化[18]。
2.1參與者數(shù)量分析 本研究中納入SD大鼠42只,SD大鼠42只中2只用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、制備,剩余40只大鼠中30只參與建模,建模后恢復(fù)良好,所有大鼠數(shù)據(jù)全部進(jìn)入結(jié)果分析,中途無(wú)脫落,未見死亡。
2.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)與鑒定 電子顯微鏡結(jié)果顯示:分離制備的細(xì)胞多呈梭形生長(zhǎng),有粗大的突起,且細(xì)胞培養(yǎng)后5 d可見細(xì)胞成纖維樣生長(zhǎng)并向瓶底克?。粋鞔蠹?xì)胞呈長(zhǎng)梭形、紡錘形,未見細(xì)胞分化,見圖1。
流式細(xì)胞儀結(jié)果表明:分離制備的細(xì)胞中CD29+占99.5%、CD44+占96.4%、CD90+占96.70%,而CD45+僅為0.60%,說(shuō)明獲得的細(xì)胞純度較高,符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特性,見圖2。
2.3各組大鼠肝功能水平比較 治療組與模型對(duì)照組干預(yù)前各肝功能水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療組移植后ALT、AST、TBIL水平均低于模型對(duì)照組(P<0.05);治療組移植后ALB水平高于模型對(duì)照組(P<0.05),治療組與模型對(duì)照組ALT、AST、TBIL水平均高于假手術(shù)組(P<0.05);治療組與模型對(duì)照組ALB水平均低于假手術(shù)組(P<0.05),見表1。
圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)鑒定Fig.2 Identification results of bone marrow mesenchymal stem cells by flow cytometry
GroupsALT(U/L)AST(U/L)TBIL(μmol/L)ALB(g/L)Therapy groupBefore transplantation346.32±25.981)241.68±21.771)17.67±2.141)16.32±2.121)After transplantation 35.39±3.231)2)3) 70.32±5.731)2)3)1.71±0.961)2)3)36.49±3.581)2)3)Model control groupBefore transplantation349.63±27.641)240.53±21.561)17.32±2.151)16.33±2.141)After transplantation 435.29±34.631)3) 332.14±24.391)3)19.66±2.181)3)13.29±2.111)3)Prosthetic surgery group23.52±2.0934.31±3.69 1.21±0.8445.79±4.52
Note:Compared with the prosthetic surgery group,1)P<0.05;compared with the model control group,2)P<0.05;compared with before transplantation,3)P<0.05.
GroupsTNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-10(pg/ml)Therapy groupBefore transplantation34.48±4.651)167.32±11.311)95.88±5.731)After transplantation7.82±3.241)2)3) 56.98±4.641)2)3)28.68±3.241)2)3)Model control groupBefore transplantation34.50±4.671)167.33±11.321)95.94±5.751)After transplantation44.69±5.631)3)178.95±13.291)3)46.78±4.981)3)Prosthetic surgery group5.21±4.3150.39±3.51 11.39±1.41
Note:Compared with the prosthetic surgery group,1)P<0.05;compared with the model control group,2)P<0.05;compared with before transplantation,3)P<0.05.
圖3 各組SD大鼠的HE染色(×100)Fig.3 HE staining of each group of SD rats(×100)Note: A.The model control group;B.The treatment group;C.The prosthetic surgery group.
2.4各組炎癥因子比較 治療組與模型對(duì)照組移植前各炎癥因子比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療組移植后炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-10水平均低于模型對(duì)照組(P<0.05);治療組與模型對(duì)照組移植前、后炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-10水平均高于假手術(shù)組(P<0.05),見表2。
2.5各組大鼠肝組織HE染色 假手術(shù)組未參與建模,HE染色下肝細(xì)胞分布均勻、飽滿,未見炎癥反應(yīng);假手術(shù)組HE染色下肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,肝細(xì)胞膨脹、腫大,可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);治療組HE染色下肝細(xì)胞受到破壞,存在部分炎癥細(xì)胞聚集,肝細(xì)胞略微腫大,見圖3。
肝衰竭是臨床上常見的重癥肝病,其病因相對(duì)較多,主要是由于肝細(xì)胞、肝臟內(nèi)相關(guān)細(xì)胞過(guò)度死亡引起[19]。臨床研究表明:肝臟大面積壞死與肝細(xì)胞凋亡、微循環(huán)障礙等有關(guān),導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度凋亡[20]。肝臟移植術(shù)是急性肝衰竭的首選治療方法,能有效改善患者癥狀,降低臨床死亡率,但是該手術(shù)治療時(shí)肝臟供體數(shù)量較少,且移植后存在明顯的免疫排斥反應(yīng)。近年來(lái),隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植開始用于急性肝衰竭研究中[21]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種源于中胚層的全能干細(xì)胞,具有自我更新能力強(qiáng),定向分化作用,能在特定條件下向骨、軟骨、成神經(jīng)細(xì)胞等方向發(fā)展,且細(xì)胞亦具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。臨床研究表明:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源相對(duì)較廣,如:臍帶、脂肪、胎盤、外周血等,取材相對(duì)容易、便于自體移植[22]。因此,本研究以SD大鼠作為對(duì)象,采用密度梯度離心法+貼壁篩選分離法完成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)及鑒定,電子顯微鏡結(jié)果顯示:分離制備的細(xì)胞多呈梭形生長(zhǎng),有粗大的突起,且細(xì)胞培養(yǎng)后5 d可見細(xì)胞成纖維樣生長(zhǎng)并向瓶底克??;傳代后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、紡錘形,未見細(xì)胞分化;流式細(xì)胞儀結(jié)果表明:分離制備的細(xì)胞中CD29+占99.5%、CD44+占96.4%、CD90+占96.70%,而CD45+僅為0.60%,說(shuō)明獲得的細(xì)胞純度較高,符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特性,從而能為本研究順利進(jìn)行奠定基礎(chǔ)。
本研究中,以SD大鼠作為對(duì)象,完成大鼠ALF動(dòng)物模型建立,并給予大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植,結(jié)果表明:治療組移植后ALT、AST、TBIL水平均低于模型對(duì)照組(P<0.05);治療組移植后ALB水平高于模型對(duì)照組(P<0.05),治療組與模型對(duì)照組ALT、AST、TBIL水平均高于假手術(shù)組(P<0.05),說(shuō)明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能改善急性肝衰竭大鼠肝功能水平,利于大鼠恢復(fù)。主要是由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子能防止肝細(xì)胞壞死,提高急性肝衰竭生存率[23]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有抑制肝細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的作用,能通過(guò)旁分泌作用,分泌多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子,從而能促進(jìn)肝細(xì)胞再生,抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡[24]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究表明:在急性肝衰竭早期阻斷其細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝再生有助于提高患者生存率[25]。本研究中,假手術(shù)組未參與建模,HE染色下肝細(xì)胞分布均勻、飽滿,未見炎癥反應(yīng);假手術(shù)組HE染色下肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,肝細(xì)胞膨脹、腫大,可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);治療組HE染色下肝細(xì)胞受到破壞,存在部分炎癥細(xì)胞聚集,肝細(xì)胞略微腫大,說(shuō)明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能減輕肝細(xì)胞破壞、受損,降低炎癥反應(yīng)。肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素過(guò)程,常伴有炎癥因子的共同參與[26]。TNF-α是一種能直接殺死腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性的細(xì)胞因子,由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,能抑制成骨細(xì)胞活性,提高破骨細(xì)胞因子表達(dá)水平[27]。IL-6是由活化T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子,能使得B細(xì)胞前體產(chǎn)生抗體,有助于集落刺激因子,促進(jìn)原始骨髓細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化,從而提高自然殺傷細(xì)胞的裂解作用[28,29]。IL-10幾乎存在于所有的淋巴細(xì)胞中,但主要源于單核巨噬細(xì)胞、T輔助細(xì)胞,釋放大量免疫介質(zhì),抑制單核細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)。TNF-α、IL-6及IL-10在正常人體中表達(dá)水平相對(duì)較低或不表達(dá),但是對(duì)于急性肝衰竭者,持續(xù)的應(yīng)激反應(yīng)容易增加TNF-α、IL-6及IL-10水平,并產(chǎn)生瀑布聯(lián)級(jí)反應(yīng),加劇疾病發(fā)展[30]。本研究中,治療組移植后炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-10水平均低于模型對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能降低肝衰竭炎癥因子水平,從根本上控制疾病發(fā)展。綜上所述,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植用于肝衰竭中能提高肝功能水平,能降低IL-10水平,減輕肝臟局部炎癥細(xì)胞聚集,從而緩解肝臟組織病理?yè)p傷,能為急性肝衰竭治療提供理論依據(jù)。