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    基于超快速液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)藥食兩用 薄荷中氨基酸和核苷類成分

    2020-05-11 02:00:32孫慧娟王瑞宋芊芊周慧銀方成武
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年8期
    關(guān)鍵詞:核苷薄荷批號(hào)

    孫慧娟,王瑞,宋芊芊,周慧銀,方成武,2*

    1(安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,安徽 合肥,230012)2(安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院亳州中醫(yī)藥研究所,安徽 亳州,236800)

    薄荷是唇形科薄荷屬多年生草本植物,藥食兩用植物。具有利咽、透疹等功效,用于咽喉腫痛及小兒麻疹等癥[1-3]?,F(xiàn)代藥理研究表明,薄荷能夠抗腫瘤、抗菌、消炎、有效緩解鎮(zhèn)痛[4-7]。薄荷的藥用價(jià)值很高,其營(yíng)養(yǎng)成分也十分豐富,富含氨基酸、有機(jī)元素、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分,具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值[8-10]。

    目前,對(duì)于薄荷研究多以揮發(fā)油類成分為主[11-13],而作為一種藥食兩用的植物,薄荷作為常見(jiàn)的茶飲,其實(shí)際運(yùn)用中不僅僅局限于揮發(fā)油, 其氨基酸和核苷類成分同樣重要。而對(duì)薄荷中氨基酸、核苷類成分的研究較少,其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值尚未得到充分認(rèn)識(shí)。氨基酸主要以游離及水解的形式存在于植物體內(nèi),氨基酸檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法[14]、毛細(xì)管電泳法[15]、離子交換色譜法等[16]。本試驗(yàn)通過(guò)超快速液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(ultra-fast liquid chromatography-mass spectrometry,UFLC-MS/MS),建立同時(shí)測(cè)定薄荷中21種氨基酸和10種核苷類成分含量方法,對(duì)3個(gè)不同產(chǎn)地的薄荷中氨基酸和核苷類成分差異進(jìn)行分析比較,并應(yīng)用PCA[17]和TOPSIS[18]方法對(duì)樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),為藥食兩用薄荷的質(zhì)量評(píng)價(jià)和綜合利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與設(shè)備

    Trip Quad 4500串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀,美國(guó) ABSciex公司;ExionLC AD 超快速液相色譜儀,日本Shimadzu公司;KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲清洗器(100 kHz),昆山市超聲儀器有限公司;離心機(jī)(HC-3018),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;SArtorius BT125D十萬(wàn)分之一電子天平,德國(guó)賽多利斯公司;ME36S 型百萬(wàn)分之一電子天平,德國(guó)賽多利斯公司;LGJ-10真空冷凍干燥機(jī),北京松源華興科技發(fā)展有限公司;Milli-Q超純水系統(tǒng),Millipore公司;0.22 μm 微孔濾膜,津騰,中國(guó)天津。

    1.2 材料與試劑

    異亮氨酸(Ile)、組氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、谷氨酸(Glu)、絡(luò)氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、蘇氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)11種氨基酸,均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)為140624-200805。天冬氨酸(Asp,批號(hào)B21934)、天冬酰胺(Asn,批號(hào)B21935)、絲氨酸(Ser,批號(hào)140688)、甘氨酸(Gly,批號(hào)B21915)、纈氨酸(Val,批號(hào)140681)、精氨酸(Arg,批號(hào)B21920)、羥基脯氨酸(Hpro,批號(hào)B21928)、色氨酸(Tryptophan,批號(hào)140677)、鹽酸賴氨酸(Lysine,批號(hào)140693)、γ-氨基丁酸(GABA,批號(hào)B21979)、尿嘧啶(Uracil,批號(hào)B20908)、腺嘌呤(Adenine,批號(hào)B21357)、胞苷(Cytidine,批號(hào)B20073)、肌苷(Inosine,批號(hào)B20582)、胸苷(Thymidine,批號(hào)B21915)、鳥(niǎo)苷(Guanine,批號(hào)B20905)、腺苷(Adenosine,批號(hào)B21356)、尿苷(Uridine,批號(hào)B20907)、次黃嘌呤(Hypoxanthine,批號(hào)B20211)、鳥(niǎo)嘌呤(Guanine,批號(hào)B20906),均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。水為超純水;乙腈、甲酸為質(zhì)譜純,德國(guó)Merck公司;其余試劑為分析純。

    試驗(yàn)所研究的樣品,采集于3個(gè)不同產(chǎn)地的薄荷植物新鮮葉片,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)方成武教授鑒定為唇形科植物薄荷MenthahaplocalyxBriq.的干燥地上部分。樣品信息如表1所示。

    表1 薄荷主輔料樣品來(lái)源及基本信息Table 1 Source and basic information of main products of mint steamed vegetables

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 色譜條件

    Waters XBridge Amide專用柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm);流動(dòng)相∶水(含0.2%甲酸)(A)-乙腈(含0.2%甲酸)(B),梯度洗脫(0~2.5 min,15% A;2.5~5 min,15%~50% A;5~7 min,50% A;7~8 min,50%~15% A;8~11 min,15% A);柱溫 30 ℃,流速0.2 mL/min,進(jìn)樣量1 μL。其正離子多反映監(jiān)測(cè)色譜圖見(jiàn)圖1。

    圖1 21種氨基酸和10種核苷的MRM圖Fig.1 UFLC-MS/MS multiple-reaction monitoring(MRM) chromatograms of 21 amino acids and 10 nucleosides

    1.3.2 質(zhì)譜條件

    離子化模式ESI+下,采取多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)檢測(cè);噴霧電壓5.5 kV;離子化溫度550 ℃;氣簾氣為241.3 kPa(35 psi),Gas1為379.2 kPa(55 psi),Gas2 為379.2 kPa(55 psi);同時(shí)對(duì)碰撞電壓、去簇電壓和檢測(cè)離子對(duì)進(jìn)行優(yōu)化。31種目標(biāo)成分的優(yōu)化質(zhì)譜檢測(cè)條件參數(shù)見(jiàn)表2。

    表2 31種目標(biāo)成分的優(yōu)化質(zhì)譜檢測(cè)條件參數(shù)Table 2 Optimized MS/MS spectrometry detection condition parameters of 31 target components

    1.3.3 溶液制備

    1.3.3.1 對(duì)照品溶液制備

    精密稱取天冬氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、精氨酸、組氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、羥脯氨酸、脯氨酸、色氨酸、γ-氨基丁酸、鹽酸賴氨酸、尿嘧啶、腺嘌呤、胞苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、胸苷、腺苷、尿苷、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤對(duì)照品適量,分別置25 mL容量瓶中,加超純水配制成0.16、0.18、0.12、0.12、0.14、0.13、0.11、0.14、0.18、0.12、0.13、0.13、0.13、0.12、0.11、0.15、0.13、0.11、0.17、0.17、0.15、0.17、0.13、0.11、0.15、0.12、0.15、0.16、0.11、0.13、0.13 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,加水配制成混合對(duì)照品溶液,逐級(jí)稀釋,得到一系列不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3.2 供試品溶液的配制

    稱取鮮品薄荷葉500 g,用水清洗干凈,均勻鋪散在托盤(pán)上,覆蓋上已扎孔的薄膜,置于-20℃冰箱預(yù)凍,隨后將其置于真空冷凍干燥機(jī)[19-21],直至水分含量達(dá)到8%以下,即干燥完成。取薄荷粉末(過(guò)40目篩)1.000 g,置于100 mL容量瓶中,加入20 mL超純水,室溫超聲處理(100 kHz)提取30 min,吸取上清液于4 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,過(guò)0.22 μm 微孔濾膜,供分析。

    1.3.4 線性關(guān)系考察、檢測(cè)限和定量限

    精密吸取“1.3.3”項(xiàng)下不同濃度系列對(duì)照品溶液及混合對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 μL,按照“1.3.1”和“1.3.2”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以對(duì)照品的峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),對(duì)照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),得出回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍。以信噪比(S/N)約為3 計(jì)算各成分的檢測(cè)限(LOD),以信噪比(S/N)約為10,計(jì)算各成分的定量限(LOQ),結(jié)果見(jiàn)表3。

    1.3.5 方法學(xué)考察

    1.3.5.1 精密度試驗(yàn)

    精密吸取一定濃度的混合對(duì)照品溶液,按照“1.3.1”和“1.3.2”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,得出21種氨基酸和10種核苷對(duì)照品峰面積的RSD在0.20%~3.36%。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

    1.3.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)

    精密稱取S5—薄荷樣品6份,每份1.000 g,按照“1.3.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照“1.3.1”和“1.3.2”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算21種氨基酸和10種核苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD在0.21%~3.60%。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

    表3 21種氨基酸和10種核苷的線性關(guān)系考察Table 3 Investigation of liner relationship of 20 amino acids and 10 nucleosides

    1.3.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    取S5—薄荷樣品的供試品溶液,分別在 0、2、4、8、12、24 h時(shí)按照“1.3.1”和“1.3.2”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析,測(cè)定21種氨基酸和10種核苷成分峰面積的RSD值,RSD在0.65%~3.84%。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

    1.3.5.4 加樣回收率試驗(yàn)

    精密稱取S5—薄荷樣品6份,每份1.000 g,分別加入與1.000 g樣品中各待測(cè)成分含量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品,按照“1.3.3.2”項(xiàng)下方法制備加樣回收供試品溶液,按照“1.3.1”和“1.3.2”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算加樣回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見(jiàn)表4。31種成分的平均加樣回收率在94.18%~98.76%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.17%~3.56%。

    表4 21種氨基酸和10種核苷方法學(xué)考察 單位:%Table 4 Methodological study of 21 amino acids and 10 nucleosides

    2 結(jié)果與分析

    2.1 樣品測(cè)定結(jié)果

    按照“1.3.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照“1.3.1”和“1.3.2”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣得相應(yīng)的峰面積,根據(jù)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試樣品中21種氨基酸和10種核苷類成分的含量,結(jié)果見(jiàn)表5。

    表5 薄荷中21種氨基酸和10種核苷的含量測(cè)定結(jié)果 單位:μg/gTable 5 Determination results of 21 amino acids and 10 nucleosides in peppermint

    2.2 主成分(PCA)分析

    由于薄荷樣品中各成分在量綱和數(shù)量級(jí)上存在較大差異,為更好地分析結(jié)果,將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后,對(duì)21種氨基酸和10種核苷含量分別應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行主成分(PCA)分析。以特征值大于1,累積貢獻(xiàn)率大于70%為提取標(biāo)準(zhǔn)。

    提取了PCA初始因子載荷矩陣,因子載荷矩陣主要說(shuō)明主成分在各變量上的載荷,載荷越高,越相關(guān)。在氨基酸中,甘氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、γ-氨基丁酸在PC1上有較高的載荷,說(shuō)明PC1能反映這5種氨基酸的信息;同理,PC2能反映脯氨酸、丙氨酸的信息。在核苷中,尿嘧啶、腺嘌呤、胞苷、尿苷、鳥(niǎo)嘌呤在PC1上有較高的載荷,說(shuō)明PC1能反映這5種核苷成分的信息;同理,PC2能反映胸苷的信息。綜上,不同產(chǎn)地薄荷的氨基酸類成分中,甘氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、γ-氨基丁酸、脯氨酸、丙氨酸為主要成分;同理,在核苷類成分中,尿嘧啶、腺嘌呤、胞苷、尿苷、鳥(niǎo)嘌呤、胸苷為主要成分。

    2.3 TOPSIS分析

    分別以氨基酸和核苷類成分以及總成分含量為分析指標(biāo),采樣TOPSIS分析方法對(duì)6份樣品進(jìn)行綜合分析,得出排序結(jié)果。

    2.3.1 歸一化處理

    將6份樣品中 21種氨基酸和 10種核苷成分的含量數(shù)據(jù)矩陣分別進(jìn)行歸一化處理,并建立相應(yīng)矩陣,計(jì)算α值,如公式(1)所示:

    (1)

    式中:αij表示第i個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象在第j個(gè)指標(biāo)上歸一化處理后的取值,Xij表示第i個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象在第j個(gè)指標(biāo)上的取值。

    2.3.2 最優(yōu)與最劣方案

    根據(jù)歸一化處理后的樣本情況,得到最優(yōu)(Z+)和最劣(Z-)值向量。

    2.3.3 相對(duì)貼近度(Ci)的計(jì)算

    相對(duì)貼近度根據(jù)公式(2)計(jì)算:

    (2)

    2.3.4 TOPSIS分析結(jié)果

    按照Ci大小將各評(píng)價(jià)對(duì)象排序,Ci值越大,表示綜合品質(zhì)越好。6份樣品中 21種氨基酸和 10種核苷類成分 TOPSIS 分析結(jié)果見(jiàn)表6。

    結(jié)果表明,以氨基酸為分析指標(biāo),S4樣品最佳;以核苷為分析指標(biāo),S2樣品最高;以總成分為分析指標(biāo),S1樣品最高。

    表6 6份樣品中21種氨基酸和10種核苷類成分TOPSIS分析結(jié)果Table 6 Results of TOPSIS analysis of 21 amino acids and 10 nucleosides in 11 samples

    3 討論

    各產(chǎn)地樣品在氨基酸和核苷酸樣品的組成和比例均存在一定差異。從總氨基酸含量來(lái)看,亳州產(chǎn)樣品總氨基酸含量高達(dá)48 337.11 μg/g,阜陽(yáng)次之,商丘最低。氨基酸成分以谷氨酸平均含量最高(22 710.19 μg/g),天冬酰胺、組氨酸、羥脯氨酸、天冬氨酸等含量次之,脯氨酸平均含量最低(5.28 μg/g)。從核苷酸總量來(lái)看,阜陽(yáng)產(chǎn)樣品總核苷含量為2 309.02 μg/g,亳州次之,商丘最低。核苷類成分以鳥(niǎo)嘌呤平均含量最高(12 677.08 μg/g),尿嘧啶、胞苷等次之,腺苷平均含量最低(0.83 μg/g)。由此說(shuō)明產(chǎn)區(qū)環(huán)境生態(tài)因子對(duì)薄荷中氨基酸和核苷類成分的合成積累影響較大。TOPSIS綜合分析結(jié)果顯示, 就總成分而言, S1(安徽阜陽(yáng)) 樣品薄荷相對(duì)較優(yōu)。

    本試驗(yàn)建立了UFLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定3個(gè)不同產(chǎn)地薄荷中21種氨基酸和10種核苷含量的方法,比較了不同產(chǎn)地對(duì)薄荷中氨基酸和核苷類成分的影響,綜合評(píng)價(jià)顯示,阜陽(yáng)產(chǎn)薄荷的綜合質(zhì)量最優(yōu),亳州其次,商丘綜合質(zhì)量最差。通過(guò)PCA和TOPSIS對(duì)藥食兩用薄荷質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià),為優(yōu)選薄荷最優(yōu)產(chǎn)地提供理論依據(jù),同時(shí)為進(jìn)一步探索評(píng)價(jià)藥食兩用薄荷的內(nèi)在質(zhì)量與控制提供依據(jù)及新的質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)參考方法。

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