頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法研究油麥菜采后香氣成分的變化

李雪，韓燕，許晶冰，張玲*，高飛虎，梁葉星*，張雪梅，楊世雄，張歡歡

1(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，重慶，401329)2(重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶，401121)

油麥菜(Lactucasaticavar.longifoliaf. Lam)屬菊科、萵苣屬，是長葉萵苣的一個(gè)變種，它不僅口感脆嫩，口味鮮甜，且營養(yǎng)豐富，是生食蔬菜中的佳品[1]。油麥菜具有與一般葉菜不同的特殊清香風(fēng)味，是我國最受歡迎的葉類蔬菜之一[2]，在我國生鮮蔬菜領(lǐng)域占有重要地位，市場(chǎng)前景廣闊。

目前對(duì)油麥菜貯藏保鮮技術(shù)與品質(zhì)影響因素研究較多[3-4]，而鮮見對(duì)其主要香氣成分以及其貯藏過程中香氣成分變化的研究。油麥菜的特征清香味在采后貯藏過程中變化明顯，這是由于油麥菜采后呼吸和蒸騰作用旺盛，營養(yǎng)物質(zhì)消耗較快，揮發(fā)性香氣成分變化較大[1]。蔬菜中揮發(fā)性物質(zhì)含量較低、還存在累加、分離以及抑制等相互作用[5-6]，需對(duì)其組分先分離后再進(jìn)行富集處理。固相微萃取是一種不需要對(duì)樣品進(jìn)行溶劑提取的前處理技術(shù)，其將采樣、萃取、濃縮和進(jìn)樣過程融為一體，具有操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于薺菜[7]、番茄[8]、黃瓜[9]、胡蘿卜[10]等蔬菜香氣成分分析。

隨著生活水平的提高，人們對(duì)生鮮蔬菜的鮮活性也提出了新的要求，要求既能保持蔬菜外觀新鮮，又能保留現(xiàn)摘蔬菜的風(fēng)味。因而，油麥菜采后清香風(fēng)味迅速下降是急需解決的問題之一，探索油麥菜香氣物質(zhì)在貯藏過程中的變化規(guī)律、影響風(fēng)味變化的關(guān)鍵香氣成分具有重要意義。調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前市場(chǎng)上油麥菜采后貯藏主要有2種方式，一種是本地油麥菜當(dāng)天采摘后在市場(chǎng)上直接常溫?cái)傌準(zhǔn)圪u，另一種是外調(diào)油麥菜低溫冷鏈貯藏銷售。本研究模擬低溫冷藏(4 ℃)和常溫?cái)傌?24 ℃)兩種銷售模式，以油麥菜為研究對(duì)象，采用頂空-固相微萃取法提取油麥菜中的香氣成分，并用GC-MS法測(cè)定油麥菜中揮發(fā)性香氣成分，客觀分析2種貯藏溫度下0、3、6、9、12、24 h的生鮮油麥菜中揮發(fā)性香氣成分的種類及絕對(duì)含量，探究油麥菜香氣成分的變化，為油麥菜香氣成分分析和油麥菜采后貯藏保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油麥菜，采自某科學(xué)院蔬菜基地。標(biāo)準(zhǔn)品的純度及密度：正己醛(≥95.00%，0.82 g/mL)、反式-2-己烯-1-醛(≥97.00%，0.85 g/mL)、3-己烯-1-醇(≥97.50%，0.85 g/mL)、反式-2-己烯-1-醇(≥95.50%，0.85 g/mL)、正己醇(≥99.90%，0.81 g/mL)、苯甲醛(≥99.50%，1.04 g/mL)、正辛醛(≥98.00%，0.82 g/mL)、苯乙醛(≥90.00%，1.03 g/mL)、壬醛(≥94.50%，0.83 g/mL)、反，順-2,6-壬二烯醛(≥94.00%，0.86 g/mL)、癸醛(≥95.00%，0.83 g/mL)、β-環(huán)檸檬酸(≥97.00%，0.94 g/mL)、β-紫羅蘭酮(≥97.00%，0.95 g/mL)，美國Sigma-Aldrich公司；反,反-2,4-庚二烯醛(≥90.00%，0.88 g/mL)，東京化成工業(yè)株式會(huì)所;甲醇，色譜純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

7890a氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；固相微萃取手動(dòng)進(jìn)樣器、57293-U聚二甲基硅烷/二乙烯苯萃取頭(65μm PDMS/DVB)，美國Supelco(色譜科)公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

參照RAMBLA方法[8]略有改動(dòng)：4 ℃和24 ℃分別貯藏0、3、6、9、12、24 h的油麥菜樣品去除根部后直接切成2 cm小段，真空包裝后-21 ℃冷凍保存?zhèn)溆茫辉诜治銮?，樣品室溫解凍后于攪拌機(jī)粉碎至均勻顆粒，取3 g樣品與3 mL(4.23 g)飽和CaCl2混合后放入50 mL離心管，旋渦1 min后備用。

1.3.2 香氣成分的提取[8]

準(zhǔn)確稱取2.00 g上述處理的油麥菜樣品于20 mL頂空瓶中，迅速旋緊瓶蓋平衡10 min，然后將萃取頭插入頂空瓶，在50 ℃恒溫水浴條件下萃取吸附10 min后，立即于GC-MS 250 ℃進(jìn)樣口解析1 min。

1.3.3 GC-MS條件

1.3.3.1 GC條件[8]

色譜柱：ZB-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；手動(dòng)無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度260 ℃。程序升溫：起始溫度40 ℃，保持3 min；以3 ℃/min升溫至60 ℃，保持0 min；以6 ℃/min升溫至160 ℃，保持0 min；以30 ℃/min升溫至250 ℃，保持3 min。檢測(cè)器溫度：250 ℃；載氣He(99.9999%)，柱流速1.2 mL/min，壓力恒定在0.134 MPa。

1.3.3.2 MS條件

電子(電離)EI源：電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；掃描模式全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z35～400。

1.3.4 定性與定量

定性：將各色譜峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對(duì)，并結(jié)合已知的標(biāo)準(zhǔn)品定性分析。依據(jù)正反相似度、匹配度及保留時(shí)間進(jìn)行檢索，選擇正反匹配度均大于800的香氣揮發(fā)物作為有效的香氣成分，并通過油麥菜揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖與混合標(biāo)樣總離子流圖比對(duì)定性相應(yīng)化合物。

定量：香氣成分鑒定由與已知的香氣標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)進(jìn)行定量測(cè)定[11]，采用外標(biāo)法。具體方法如下：

儲(chǔ)備液制備：香氣標(biāo)準(zhǔn)品各取10 μL，用甲醇定容至10 mL，經(jīng)稀釋制得儲(chǔ)備液后分別轉(zhuǎn)移至頂空瓶4 ℃冷藏備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：各取10 μL一定濃度標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用飽和CaCl2溶液定容至10 mL，制得各質(zhì)量濃度約為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用飽和CaCl2溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，配制成一系列質(zhì)量濃度約為0.02E-2、0.05 E-2、0.01 E-1、0.02 E-1、0.05 E-1、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照油麥菜香氣的測(cè)定方法進(jìn)行分析，根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品的密度(g/mL)折算標(biāo)準(zhǔn)液中各標(biāo)準(zhǔn)品濃度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

OAV法：查閱文獻(xiàn)香氣物質(zhì)的閾值，計(jì)算風(fēng)味物質(zhì)的OAV。OAV法按照公式(1)計(jì)算OAV[12]：

(1)

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

油麥菜揮發(fā)物質(zhì)采用NIST MS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行譜庫分析，數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 香氣成分組成

油麥菜香氣成分及混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.10 μg/mL)的總離子流色譜圖如圖1所示，鑒定結(jié)果如表1所示，共鑒定出14種香氣成分。包括醛類9種、醇類3種、酮類1種、酸類1種。

圖1 油麥菜香氣物質(zhì)的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion-current chromatogram of aroma compounds of Leaf-used lettuce

表1 油麥菜中香氣成分含量和OAVTable 1 Contents and OAV of volatile components in leaf-used lettuce

注：MS表示利用GC-MS確定；S表示利用標(biāo)準(zhǔn)品鑒定；ND表示沒有查到閾值的物質(zhì)

2.1.1 醛類

油麥菜中種類最多的香氣物質(zhì)是醛類物質(zhì)，占香氣成分總量的57.54%，有正己醛(110.73 μg/kg)、青葉醛(251.01 μg/kg)、反,反-2,4-庚二烯醛(161.11 μg/kg)等，醛類物質(zhì)是油麥菜中帶有青草氣的原因之一，但易發(fā)生氧化和聚合反應(yīng)，導(dǎo)致其穩(wěn)定性較差，容易使香氣減弱變壞[20]。其中己醛具有脂肪香、清香、草香、蔬菜香和水果香氣，可能是形成油麥菜青草香氣的原因之一[21]；青葉醛呈綠葉清香、水果香氣；反,反-2,4-庚二烯醛具有脂肪香和青香；苯乙醛具有濃郁的玉簪花香；壬醛具有油脂氣味、甜橙氣息、蜜蠟花香氣息；葵醛具有新鮮油脂香、甜橙香、檸檬香、蠟香、并帶有綠茶的爽快香氣[22]。這些香氣成分為油麥菜復(fù)雜的清香氣味提供了積極貢獻(xiàn)。脂肪酸的氧化降解可能是醛類產(chǎn)生的主要原因之一，另外，醛類化合物也可能源于油麥菜葉中的游離氨基酸發(fā)生Streck降解[23-24]。

2.1.2 醇類

醇類是油麥菜中含量第二的香氣物質(zhì)，占香氣成分總量的42.26%，有葉醇(249.00 μg/kg)、正己醇(119.58 μg/kg)、反式-2-己烯-1-醇(38.14 μg/kg)。葉醇占總香氣成分含量的25.87%，具有剛從草地割下的草和葉子的氣味，天然存在于許多植物的葉子、精油和水果中，如茶葉、薄荷、大茉莉花、柚子、葡萄等；反式-2-己烯-1-醇具有蘋果香氣等果香氣；正己醇具有玫瑰甜、淡木香。其中葉醇、反式-2-己烯-1-醇為萜烯醇類，具有典型的花果味[25-26]，研究發(fā)現(xiàn)其是形成茶葉香氣的重要成分[27]。醇類物質(zhì)主要由糖代謝、氨基酸脫羧和脫氫產(chǎn)生[28]，也可能是酵母菌和乳酸菌等油麥菜表面的微生物在發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物。

2.1.3 酸類

油麥菜中僅檢測(cè)出1種酸類物質(zhì)為β-環(huán)檸檬酸，檢出含量較低，僅占0.09%，主要呈現(xiàn)涼香、果香和清香[29]，與油麥菜主體香味基本一致。

2.1.4 酮類

油麥菜中酮類物質(zhì)含量較低，占比僅為0.12%，雖然占比較低，對(duì)油麥菜的香氣也具有一定的貢獻(xiàn)，其形成可能與胡蘿卜素類物質(zhì)氧化降解或者不穩(wěn)定化合物的氧化作用有關(guān)[29]，β-紫羅蘭酮具有紫羅蘭氣息，花香濃郁，并帶有果香味[30]。

2.2 主要香氣成分的OAV分析

OAV是通過計(jì)算每一種香氣成分的濃度與其閾值的比值來評(píng)估該物質(zhì)對(duì)樣品整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度，當(dāng)香氣成分OAV大于1時(shí)，才認(rèn)為其對(duì)香氣有貢獻(xiàn)作用[31-32]。由表1可知，共有10種揮發(fā)性成分OAV大于1，分別是正己醛、青葉醛、葉醇、反式-2-己烯-1-醇、正己醇、反，反-2,4-庚二烯醛、苯乙醛、壬醛、反，順-2,6-壬二烯醛、葵醛，主要為醛類和醇類物質(zhì)。其中醛類物質(zhì)主要賦予油麥菜以草香香氣、清香味和果香，醇類主要賦予油麥菜以花香和果香。這些香味相互協(xié)調(diào)和融合，構(gòu)成了油麥菜的特征香味。OAV大于100的香氣成分包括青葉醛、葉醇、反式-2-己烯-1-醇、反，反-2,4庚二烯醛和反，順-2,6-壬二烯醛，其中青葉醛、葉醇、反,反-2,4-庚二烯醛的OAV值大于3000，說明這3種物質(zhì)是油麥菜揮發(fā)性成分中最主要的香氣貢獻(xiàn)化合物，主要賦予了油麥菜以清香、草香、蔬菜香和黃瓜香味[33]。

油麥菜香氣成分中絕對(duì)含量高于20.00 μg/kg的有6種香氣成分，包括正己醛、青葉醛、葉醇、正己醇、反式-2-己烯-1-醇、反,反-2,4-庚二烯醛；OAV值大于100的香氣成分有5種，包括青葉醛、葉醇、反式-2-己烯-1-醇、反,反-2,4-庚二烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛。綜合香氣活性值(OAV)與絕對(duì)含量分析表明，油麥菜的主要特征香氣成分共7種，分別是正己醛、青葉醛、葉醇、正己醇、反式-2-己烯-1-醇、反,反-2,4-庚二烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛，這些香氣成分可能是油麥菜特征的清香、草香和蔬菜香的主要來源。

2.3 兩種貯藏條件下?lián)]發(fā)性物質(zhì)的變化

比較了4 ℃和24 ℃兩種條件下貯藏0、3、6、9、12、24 h的油麥菜揮發(fā)性香氣成分含量變化，結(jié)果如圖2所示。

2種貯藏條件下油麥菜的主要香氣成分種類沒有發(fā)生變化，但香氣成分的總量變化較大，如圖2-O：4 ℃條件下油麥菜的香氣成分總量顯著減少(P<0.05)，由962.47 μg/kg下降到290.76 μg/kg，下降了69.79%；24 ℃條件下油麥菜的香氣成分總量顯著增加(P<0.05)，由962.47 μg/kg上升到1 726.77 μg/kg，上升了79.41%。

醛類揮發(fā)物是油麥菜中主要的香氣成分，其中OAV大于1的醛類由高至低包括：反,反-2,4-庚二烯醛(3 288.04)、青葉醛(3 137.68)、反,順-2,6-壬二烯醛(293.05)、正己醛(27.01)、苯乙醛(12.88)、壬醛(8.08)、葵醛(1.32)。4 ℃條件下，反,反-2,4-庚二烯醛、青葉醛、反,順-2,6-壬二烯醛、正己醛和葵醛的含量在0～6 h逐漸下降，6～12 h有所回升，12～24 h又出現(xiàn)大幅度下降，壬醛的絕對(duì)含量在3 h內(nèi)迅速下降后趨于穩(wěn)定，苯乙醛的絕對(duì)含量小幅下降后又有所回升。整體而言，4 ℃低溫貯藏24 h后，醛類物質(zhì)含量由0 h時(shí)的550.68 μg/kg下降至184.77 μg/kg，下降了66.45%，正己醛、青葉醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛、壬醛和葵醛含量顯著降低(P<0.05)，苯乙醛含量有所增加。24 ℃條件下，大部分醛類揮發(fā)物含量出現(xiàn)先下降后上升的變化，而葵醛含量持續(xù)降低。整體而言，24 ℃常溫貯藏24 h后，醛類物質(zhì)含量由0 h時(shí)的550.68 μg/kg上升至739.82 μg/kg，上升了34.35%，正己醛、反,順-2,6-壬二烯醛含量沒有顯著性變化，青葉醛、壬醛和葵醛含量有所降低，而苯乙醛和反,反-2,4-庚二烯醛含量顯著性增加(P<0.05)。與4 ℃冷藏24 h后的油麥菜相比，常溫貯藏的油麥菜 7種醛類物質(zhì)24 h后含量均高于冷藏條件下的。醛類物質(zhì)的大量上升一方面可能與抗壞血酸在熱和氧的作用下降解產(chǎn)生大量的C6～C9小分子醛類和糠醛有關(guān)，另一方面可能是由高級(jí)醇氧化而來或氨基酸脫氨脫羧生成[34]。青葉醛和反,反-2,4-庚二烯醛的含量變化對(duì)油麥菜特征的綠葉清香和水果香氣有重要影響。

圖2 4 ℃和24 ℃貯藏條件下油麥菜貯藏0、3、6、9、12、24 h香氣成分的含量Fig.2 The content of aroma components in leaf-used lettuce at the storage of 4 ℃and 24 ℃ for 0、3、6、9、12、24h respectively注：不同的小寫字母表示在同一貯藏溫度不同貯藏時(shí)間條件下樣品之間有顯著性差異(P<0.05)；*表示同一貯藏時(shí)間不同貯藏溫度條件下樣品之間有顯著性差異(P<0.05)

油麥菜中的醇類揮發(fā)物都對(duì)其香氣成分有重要影響，其OAV值均較大，葉醇(3 557.13)、反式-2-己烯-1-醇(164.39)、正己醇(47.83)是油麥菜中典型的醇類揮發(fā)物。4 ℃條件下，醇類物質(zhì)絕對(duì)含量隨著貯藏時(shí)間延長呈下降趨勢(shì)，由406.72 μg/kg下降至103.57 μg/kg，下降了74.54%，其中葉醇、正己醇、反式-2-己烯-1-醇含量顯著下降(P<0.05)。24 ℃條件下，醇類絕對(duì)含量隨著貯藏時(shí)間的延長一直呈上升趨勢(shì)，由406.72 μg/kg上升至978.83 μg/kg，上升了140.66%，其中葉醇、正己醇含量顯著增加(P<0.05)。這可能是由于微生物發(fā)酵、氨基酸的脫氫脫羧及不飽和脂肪酸的生物酶作用轉(zhuǎn)化，此外，脂肪熱氧化和熱降解的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步熱氧化分解也可形成醇類物質(zhì)[35-37]。葉醇、正己醇是構(gòu)成油麥菜芳香主體的來源之一，可賦予油麥菜以青草的氣味和果香味[37]，其含量的變化可能會(huì)直接影響油麥菜的香氣組成。

β-環(huán)檸檬酸和β-紫羅蘭酮在4 ℃條件下和24 ℃條件下含量均下降，但2種香氣成分的絕對(duì)含量較低，且不是油麥菜主要香氣成分，所以對(duì)油麥菜的香氣影響作用較小。

綜上所述，青葉醛、反,反-2,4-庚二烯醛、葉醇、正己醇對(duì)油麥菜特征的青香味和果香味的變化有顯著的影響。采后24 h內(nèi)油麥菜在呼吸作用、蒸騰作用、微生物發(fā)酵等作用下其不同香氣成分發(fā)生了復(fù)雜的反應(yīng)，使其香氣組成不斷變化，進(jìn)而引起了油麥菜清香味的變化。常溫貯藏(24 ℃)有助于油麥菜主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和合成，使其香氣成分含量增加，加速其特征的蔬菜清香味釋放，冷藏(4 ℃)減緩了油麥菜的呼吸作用和蒸騰作用，進(jìn)而減緩油麥菜的清香味釋放，有助于油麥菜的貯藏保鮮與調(diào)運(yùn)。這也解釋了消費(fèi)者普遍反映的購買當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶現(xiàn)摘的新鮮油麥菜比外地調(diào)運(yùn)的油麥菜清香味更濃郁的現(xiàn)象。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用HS-SPME-GC-MS對(duì)本地現(xiàn)摘油麥菜的香氣成分進(jìn)行了分析測(cè)定，并對(duì)采后油麥菜在4 ℃和24 ℃條件下分別貯藏0、3、6、9、12、24 h后香氣成分變化進(jìn)行了分析測(cè)定，結(jié)合OVA值和香氣成分絕對(duì)含量分析，得出如下結(jié)論：

(1)油麥菜中共檢測(cè)到有效揮發(fā)性香氣成分14種，共四大類：醛類9種、醇類3種、酮類1種、酸類1種，香氣成分以醛類和醇類化合物為主。

(2)查找閾值并計(jì)算，OAV大于100的香氣成分包括青葉醛、葉醇、反式-2-己烯-1-醇、反,反-2,4-庚二烯醛和反，順-2,6-壬二烯醛，是構(gòu)成油麥菜香氣的主要貢獻(xiàn)化合物。其中青葉醛、葉醇、反,反-2,4-庚二烯醛的OAV值大于3 000，說明這3種物質(zhì)是油麥菜揮發(fā)性成分中最主要的香氣貢獻(xiàn)化合物，綜合香氣活性值與絕對(duì)含量分析表明，油麥菜的主要特征香氣成分有7種，分別是正己醛、青葉醛、葉醇、正己醇、反式-2-己烯-1-醇、反,反-2,4-庚二烯醛、順-2,6-壬二烯醛，這些物質(zhì)共同構(gòu)成了油麥菜特征的清香、草香和蔬菜香。

(3)4 ℃和24 ℃貯藏條件下油麥菜的主要香氣成分種類沒有發(fā)生變化。4 ℃條件下油麥菜的香氣成分總量顯著下降(P<0.05)，24 ℃條件下油麥菜的香氣成分總量顯著上升(P<0.05)，香氣成分的變化主要是由醛類揮發(fā)物和醇類揮發(fā)物含量變化引起的，其中青葉醛、反,反-2,4-庚二烯醛、葉醇、正己醇對(duì)油麥菜特征的清香和果香味的變化有顯著的影響。4 ℃冷藏有助于減緩油麥菜香氣成分的釋放，對(duì)油麥菜貯藏保鮮有一定作用；24 ℃條件下有助于油麥菜香氣的合成、積累和釋放，所以當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶現(xiàn)摘的油麥菜的清香味更加濃郁。因此，油麥菜適宜的貯藏溫度有待于進(jìn)一步深入研究。