背根神經節(jié)脈沖射頻對CCI 模型大鼠機械性痛閾及相關炎性因子表達的影響

蔣雨斌　李平　馬旭杰　王芬　江仁　李紅

[摘要] 目的 通過制備慢性坐骨神經縮窄損傷（CCI）模型，并對模型大鼠實施背根神經節(jié)（DRG）脈沖射頻（PRF），探討其對SD大鼠模型的干預效果及機制研究。 方法 60只雄性SD 大鼠隨機分為4 組：假手術組（Sham）、CCI組、CCI+PRF組、CCI+假脈沖射頻組（CCI+NPRF組），每組15只。觀察大鼠造模前及造模后1、3、5、7 d，脈沖射頻后1、7、14 d的痛閾改變。造模前、CCI-7 d、PRF-14 d，采用ELISA檢測脊髓SDF-1/CXCR4、TRPV1的表達;造模前、CCI-1 d、PRF-1 d檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6細胞因子變化。 結果 與Sham 組比，CCI組、CCI+PRF組、NPRF組大鼠在神經損傷后右后爪PWMT和PWTL均顯著降低（P<0.05），而脊髓SDF-1/CXCR4、TRPV1表達增強，大鼠血清TNF-α、IL-6表達明顯上升（P<0.05）。PRF治療后CCI+PRF組大鼠機械性痛閾較其他三組顯著升高（P<0.05），但仍低于Sham組（P<0.01），脊髓SDF-1/CXCR4、TRPV1表達則明顯減少，同時血清中TNF-α、IL-6表達明顯下降（P<0.05）。 結論 脈沖射頻能有效減輕CCI模型大鼠的痛敏，其機制可能與抑制趨化因子SDF-1/CXCR4、TRPV1及調節(jié)TNF-α、IL-6的表達有關。

[關鍵詞] 神經病理性疼痛;脈沖射頻;背根神經節(jié);炎性因子

[中圖分類號] R402? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）07-0023-05

Impacts of dorsal root ganglion pulsed radiofrequency on paw withdrawal mechanical threshold and relevant inflammatory factors in chronic constriction injury rat models

JIANG Yubin1? ?LI Ping1? ?MA Xujie1? ?WANG Fen2? ?JIANG Ren1? ?LI Hong1

1.Department of Anesthesiology， Ningbo Yinzhou No.2 Hospital， Ningbo? ?315100， China; 2.Department of Anesthesiology， Ningbo Women and Childrens Hospital， Ningbo? ?315012， China

[Abstract] Objective To investigate the therapeutic effects of dorsal root ganglion（DRG） pulsed radiofrequency（PRF） on chronic constriction injury（CCI） of sciatic nerve models in Sprague-Dawley（SD） rats， and elucidate the mechanism behind it. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into 4 groups， namely the Sham group， the CCI group， the CCI+PRF group and the CCI+non-PRF（NPRF） group， with 15 in each group. Paw withdrawal mechanical threshold（PWMT） and paw withdrawal thermal latency（PWTL） were detected before modeling， at 1， 3， 5 and 7 days after modeling and at 1， 7 and 14 days after PRF. Stromal cell-derived factor-1（SDF-1）/CXCR4 ratio and the level of transient receptor potential vanilloid-1（TRPV1） in the spinal cord were determined before modeling， at 7 days after modeling and at 14 days after PRF using an ELISA assay. Serum levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α） and interlukin-6（IL-6） were determined before modeling， at 1 day after modeling and at 1 day after PRF. Results After CCI modeling， PWMT and PWTL in the right hind paw significantly decreased in the CCI， CCI+PRF and CCI+NPRF groups， accompanied by an increased SDF-1/CXCR4 ratio and up-regulations of TRPV1 in the spinal cord and TNF-α and IL-6 in the serum compared with the Sham group（P<0.05）. PWMT significantly increased in the CCI+PRF group compared with other three groups after treatment（P<0.05）， but still decreased compared with the Sham group（P<0.01）. After PRF treatment， the SDF-1/CXCR4 ratio and TRPV1 expression in the spinal cord and serum levels of TNF-α and IL-6 significantly decreased in the CCI+PRF group（P<0.05）. Conclusion PRF effectively ameliorated hyperalgesia in CCI rats. The underlying mechanism may associate with the repressed SDF-1/CXCR4 ratio and expressions of TRPV1， TNF-α and IL-6.

[Key words] neuropathic pain; pulsed radiofrequency; dorsal root ganglion; inflammatory factors

神經病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是一種由神經系統(tǒng)原發(fā)性損害和功能障礙所激發(fā)或引起的疼痛，具有自發(fā)性疼痛、痛覺過敏或超敏的特征[1]。Sluijter等于1997年首次提出脈沖射頻（pulsed radio frequency，PRF）技術用于鎮(zhèn)痛治療，目前PRF已廣泛用于治療頸源性頭痛、頸腰椎間盤退行性病變等多種慢性疼痛疾病[2-4]。盡管在許多研究中均表明PRF有明確的鎮(zhèn)痛效果，但其鎮(zhèn)痛機制還未完全明確。已知某些趨化因子可以增加背根神經節(jié)和脊髓神經元的興奮性。其中基質細胞衍生因子SDF-1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）又稱為CXCL12屬于趨化因子CXC類，CXCR4是趨化因子基質細胞衍生因子-1（CXCL12）的特異受體。Yang等[5]研究發(fā)現，在NP模型大鼠的背根神經節(jié)和脊髓中均能檢測到SDF-1和CXCR4上調。已知趨化因子誘導神經元興奮性增加與瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道密切相關，TRP通道拮抗劑能衰減神經源性、強直性和神經性疼痛的強烈反應。其中脊髓中瞬時感受器電位香草酸受體1（TRPV1）是位于外周及中樞系統(tǒng)的離子通道型受體，當被激活后導致離子通道開放，已經證明TRPV1在疼痛通路的突觸傳遞中起著重要的作用。尤其是在病理性疼痛狀態(tài)下，感覺神經元和間質神經元中央端TRPV1可能共同導致疼痛加重。另外研究發(fā)現，在沉默脊髓TRPV1基因的表達后，可通過抑制CAMKII/ERK2的激活減弱神經性疼痛的維持[6]。本實驗選擇CCI模型模擬臨床神經病理性疼痛，并應用DRG脈沖射頻，觀察其對大鼠脊髓內SDF-1/CXCR4及TRPV1以及機械性痛閾的影響，探討背根神經節(jié)PRF鎮(zhèn)痛作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康雄性SD大鼠60只，體重（250±30）g，清潔級，購自中國科學院上海實驗動物中心。本研究經過地方實驗動物倫理委員會批準通過。脈沖射頻儀 （Cosman RF-G4，美國）、22G 射頻治療套管針（Cosman RF-G4，美國）、Digital Von Frey測痛儀（Stoelting公司，美國）、全自動熱痛刺激儀（PL-200型，成都泰盟科技有限公司）、TRPV1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于上海雙贏生物科技有限公司、SDF-1和CXCR4試劑盒購于EIAab公司、TNF-α和IL-6試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組? 60只SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為4組：假手術組（Sham組）、慢性坐骨神經縮窄損傷組（CCI組）、CCI +PRF組、CCI+假脈沖射頻組（CCI+NPRF組）。各組大鼠于術后7 d在術側L4-5間隙DRG處行360 s的標準PRF治療。CCI+NPRF組僅暴露在射頻刺激針下，不予脈沖治療。造模前，CCI后1 d、3 d、5 d、7 d，PRF后1、7、14 d四組大鼠均進行痛閾測定。造模前、CCI-7 d、PRF-14 d，采用ELISA檢測脊髓SDF-1/CXCR4、TRPV1的表達，造模前、CCI-1 d、PRF-1 d檢測大鼠血清TNF-α、IL-6細胞因子變化。

1.2.2 模型制備? 采用Bennett等[7]的方法建立大鼠CCI 模型：10%水合氯醛腹腔麻醉后俯臥位四肢固定，右側后肢股骨處剃毛消毒，外科手術刀切開皮膚，并鈍性剝離肌肉，暴露出坐骨神經干，利用4.0鉻制腸線環(huán)繞神經干分別做4個結扎環(huán)，間距1 mm，觀察到小腿部肌肉顫動為最佳結扎力度。術畢縫合消毒，單籠飼養(yǎng)。

1.2.3 脈沖射頻? DRG 治療方法制作CCI模型后7 d，于大鼠腰5棘突旁右側切開剝離，暴露L4-5橫突及椎間孔，射頻穿刺針尖沿與神經根走形平行方向輕柔置于L4和L5椎間孔內進行阻抗測試，運動測試未引起相應節(jié)段脊神經支配的顯著的下肢肌肉收縮運動，確認穿刺針針尖位于DRG，位置正確后予3 Hz的頻率和20 ms/次的參數42℃脈沖射頻360 s。手術后，注射青霉素以防止感染。

1.2.4 機械刺激縮足反應痛閾值（paw withdrawal-mechanical threshold，PWMT）測量? 按Chaplan等[8]研究的方法，使用Von Frey纖維通過“上-下”法測量PWMT。將不同壓力的Von Frey纖維絲從底部垂直刺激大鼠右后足底中心持續(xù) 6～8 s，大鼠的抬高或跛足行為被認為是陽性反應，否則是負反應。每只大鼠測 3 次，每次間隔 10 min，取平均值。

1.2.5 熱刺激縮足反應潛伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）的測量? 將PL-200型自動熱疼痛刺激儀溫度設定為50℃，每次適應5 min后將大鼠置于熱疼痛刺激儀上，記錄大鼠受熱刺激后收縮反應熱痛覺的指示作為熱痛覺潛伏期。每只大鼠測3次，每次間隔10 min，取平均值。

1.2.6 ELISA檢測大鼠脊髓SDF-1/CXCR4及TRPV1含量變化? 造模前、CCI-7 d、PRF-14 d，在麻醉狀態(tài)下，外科手術迅速將大鼠脊髓L4-5節(jié)段取下，置于液氮反復凍融后勻漿，整個過程都在冰上進行，然后在4℃、12000 轉/min離心30 min，小心吸出上清液并儲存在-80℃。按照ELISA實驗操作及試劑盒說明進行測定。

1.2.7 ELISA檢測大鼠血清TNF-α、IL-6細胞因子變化? 造模前、CCI-1 d、PRF-1 d，每組大鼠經頸靜脈竇取血2 mL，離心留取血清，按照ELISA實驗操作及TNF-α、IL-6試劑盒說明進行測定。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較及組內比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學觀察

各組大鼠隨機分組后一般資料如體重、生長飲食及神經行為學檢查等差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。CCI術后除Sham組外，各組大鼠生長及飲食減少，但各組大鼠體重比較無明顯差異。CCI組均出現不同程度的右后肢步態(tài)跛行，下肢軟弱無力，右后足外翻及肌肉萎縮等狀態(tài)。CCI+PRF組大鼠在脈沖射頻后，上述癥狀明顯改善，活動量明顯增加。

2.2 大鼠PWMT 和PWTL測定比較

（1）PWMT的比較：CCI前各組大鼠基礎值比較無統(tǒng)計學差異。Sham組術后各時間點PWMT與術前基礎值相比，無明顯統(tǒng)計學差異。造模后，CCI組和CCI+NPRF組PWMT較術前明顯降低，第7天至最低（P<0.01）。CCI+PRF組大鼠經脈沖射頻后第1、7、14天，術后痛覺敏感度逐漸恢復，PWMT較CCI組和CCI+NPRF組顯著升高（P<0.01），CCI+PRF組PWMT從（2.46±0.59）g（CCI-7 d）上升至（7.30±0.61）g（PRF-14 d）。見圖1A。

（2）各組PWTL的比較：CCI前各組大鼠基礎值比較無統(tǒng)計學差異。Sham組術后各時間點PWTL與術前基礎值相比，無明顯統(tǒng)計學差異。造模后，CCI組和CCI+NPRF組PWTL較術前明顯降低，第7天至最低（P<0.01）。脈沖射頻后，CCI+PRF組PWTL從（4.17±0.40）s（CCI-7 d）上升至（7.11±0.52）s（PRF-14 d），CCI+PRF組大鼠經脈沖射頻后，術后痛覺敏感度逐漸恢復，PWTL較CCI組和CCI+NPRF組顯著升高（P<0.01）。見圖1B。

2.3 大鼠脊髓中SDF-1/CXCR4及TRPV1含量檢測

造模前各組大鼠脊髓中趨化因子SDF-1/CXCR4含量及TRPV1含量幾乎沒有差異，且含量較低。CCI術后7 d，與Sham組比較，CCI組、CCI+NPRF組、CCI+PRF組表達顯著增加（P<0.05），但這三組兩兩比較無顯著性差異。CCI+PRF組大鼠經脈沖射頻后14 d脊髓組織中SDF-1/CXCR4及TRPV1含量較CCI組和CCI+NPRF組顯著降低（P<0.05），但仍高于Sham組（P<0.05），見表2。

2.4 各組大鼠血清中細胞因子含量檢測

造模前各組大鼠血液中細胞因子TNF-α、IL-6含量無明顯差異。CCI術后1 d，與Sham組比較，CCI組、CCI+NPRF組、CCI+PRF組表達顯著增加（P<0.05），但這三組兩兩比較無顯著性差異。CCI+PRF組大鼠經脈沖射頻后1 d血清中TNF-α、IL-6含量較CCI組和CCI+NPRF組顯著降低（P<0.05），見表3。

3 討論

NP是一種慢性、頑固性疼痛，目前沒有任何特殊的治療，僅姑息治療方法可用于暫時緩解癥狀，給患者造成巨大痛苦，嚴重影響患者的生存質量[9]。雖然NP的治療目前仍是基于藥物為主，長期增加劑量容易產生耐藥性和嚴重的副作用，而鎮(zhèn)痛效果不能得到保證。有研究證實，大鼠背根神經節(jié)脈沖射頻能有效緩解神經病理性疼痛[10-11]。脈沖射頻能刺激脈沖，從而使神經可不受進一步損傷并達到緩解疼痛的目的，所以其在臨床中的應用日益廣泛，包括用于治療帶狀皰疹后神經痛、周圍神經痛、難治性頸源性頭痛等，但仍有較多問題有待進一步研究以增進臨床療效[2-4，12-15]。

NP可由外周敏化或中樞敏化產生，當末梢神經受損時，傷害信息被發(fā)送并集成通過傳入神經，然后通過脊髓、丘腦等傳送，并且最終在大腦皮層形成疼痛。因此我們選擇脊髓部位相關因子作為研究觀察的切入點。Vallejo R等[16]利用SNL模型，實驗組給予PRF 3 min，24 h后測定坐骨神經、DRG和脊髓的炎性因子等表達，發(fā)現脈沖射頻組不但能逆轉SNI模型導致的痛覺過敏，而且與實驗組相比，射頻組坐骨神經炎性因子表達恢復到基礎水平，包括TNF-α、IL-6，背根神經節(jié)GABAB-R1、Na/K ATP、5-HT3表達明顯上升，同時TNF-α、IL-6明顯下降，脊髓Na/K ATP和c-Fos上調。Liu Y等[17]發(fā)現在CCI模型中，將射頻電極放置于大鼠坐骨神經的結扎近端，與對照組相比，PRF能顯著提高CCI大鼠的熱痛閾，逐漸降低痛覺過敏和痛覺超敏的比例。有研究證實，背根神經節(jié)脈沖射頻可以降低由CCI引起的TNF-α的表達增加[18]。

另外，趨化因子是一小分子細胞因子家族蛋白，已知某些趨化因子可以增加背根神經節(jié)和脊髓神經元的興奮性。其中基質細胞衍生因子SDF-1屬于趨化因子CXC類，CXCR4是趨化因子基質細胞衍生因子-1（CXCL12）的特異受體。研究發(fā)現，建立神經病理性模型和癌痛模型后，在DRG和脊髓中均能發(fā)現SDF-1和CXCR4上調[19]。交感神經節(jié)和DRG都起源于神經嵴細胞（neural crest cell，NCC），近側的神經嵴細胞演變?yōu)镈RG，SDF-1、CXCR4信號系統(tǒng)不同表達。已知趨化因子誘導神經元興奮性增加與TRP通道密切相關，TRP通道拮抗劑能衰減神經源性、強直性和神經性疼痛的強烈反應。TRPV1是TRPV亞家族中發(fā)現最早也是研究最為充分的一個。TRPV1被炎性物質激活后，導致大量的Ca2+內流，引起細胞去極化，感覺神經興奮，觸發(fā)外圍感覺，最終誘導術后疼痛和慢性疼痛的形成。有研究發(fā)現，SNI[20-21]和CCI[22]模型造成的NP 模型中TRPV1表達上調和P物質在脊髓增多等產生鎮(zhèn)痛作用。

本研究以CCI大鼠模型模擬人類臨床所見的各種慢性疼痛的癥狀。本研究術前脊髓SDF-1/CXCR4及TRPV1呈低水平表達，CCI后趨化因子SDF-1/CXCR4及瞬時感受器電位受體TRPV1表達顯著增加，并于損傷后的觀察期內維持高水平，這與上述研究結果類似，再次證明了SDF-1/CXCR4及TRPV1參與了NP的形成，同時大鼠CCI模型血清刺激產生促炎因子TNF-α、IL-6變化，表明炎性因子在痛閾產生中具有重要作用。因此，我們推測：PRF后可能通過抑制DRG中小膠質細胞激活，抑制趨化因子表達，從而抑制交感神經芽生，同時抑制TRPV1激活神經元，減少促炎因子釋放來緩解疼痛。

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（收稿日期：2019-06-18）