宮頸癌患者治療前后Tie-2和Ang-2的表達(dá)水平及其對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

任瑩　叢玲華　何喻　方來福

[摘要] 目的 探討宮頸癌患者治療前后Tie-2和Ang-2的表達(dá)水平及其對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。 方法 對(duì)2015年1月～2016年5月我院診治的72例宮頸癌患者回顧性分析，并選擇同時(shí)期、同年齡段的體檢人群110例作為對(duì)照組，比較宮頸癌患者治療前后Tie-2和Ang-2的表達(dá)水平，分析死亡與生存患者臨床資料間的差異，應(yīng)用多因素Cox回歸模型探究影響宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并應(yīng)用受試者工作特征曲線評(píng)估對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。結(jié)果 宮頸癌患者治療前血清與組織Tie-2（P=0.000）的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，宮頸癌患者治療前血清Ang-2水平顯著高于對(duì)照組（P=0.000）;治療后，宮頸癌患者的血清Tie-2和Ang-2的表達(dá)水平顯著低于治療前（P=0.000， 0.002）。在為期24個(gè)月的隨訪中，共發(fā)生全因死亡31例，死亡組的臨床分期（P=0.000）、治療后血清Ang-2（P=0.000）和Tie-2水平（P=0.049）明顯高于生存組。多因素Cox回歸分析顯示，治療后Ang-2水平是影響宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.000），臨床分期Ⅱ期是宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素（P=0.006）。治療后血清Ang-2水平預(yù)測(cè)宮頸癌患者預(yù)后的AUC明顯高于臨床分期和Tie-2（P=0.000），其最佳截點(diǎn)為≥1.22 ng/mL，敏感性和特異性分別為87.10%和92.68%。 結(jié)論 宮頸癌患者Tie-2和Ang-2的血清和組織表達(dá)水平較高，治療后血清Ang-2水平是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并對(duì)預(yù)后具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 血管生成素-2;Tie-2;宮頸癌;表達(dá);預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R737.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）07-0006-05

Expression levels of Tie-2 and Ang-2 in patients with cervical cancer before and after treatment and their predictive value for prognosis

REN Ying? ?CONG Linghua? ?HE Yu? ?FANG Laifu

Department of Pathology， Yinzhou People's Hospital of Ningbo City， Ningbo? ?315040， China

[Abstract] Objective To explore the expression levels of Tie-2 and Ang-2 in the patients with cervical cancer before and after treatment and their predictive value for prognosis. Methods Seventy-two patients with cervical cancer treated in our hospital from January 2015 to May 2016 were analyzed retrospectively， and 110 people of the same age receiving healthy checkup in the same period were selected as controls. The expression levels of Tie-2 and Ang-2 in the patients with cervical cancer before and after treatment were compared， and the differences in clinical date between the death and the survival patients were analyzed. The multivariate Cox regression model was applied to test the independent risk factors affecting the prognosis of patients with cervical cancer， and the receiver operating characteristic curve was applied to evaluate the predictive value for prognosis. Results The serum and tissue expression levels of Tie-2 （P=0.000） in? the patients with cervical cancer before treatment were significantly higher than those in the control group， and the serum Ang-2 level of the patients with cervical cancer before treatment was significantly higher than that in the control group（P=0.000）. The serum expression levels of Tie-2 and Ang-2 in the patients with cervical cancer after treatment were significantly decreased compared with those before treatment（P=0.000， 0.002）. During the 24-month follow-up， 31 all-cause deaths were detected. The clinical stage（P=0.000）， and post-treatment serum Ang-2 （P=0.000） and Tie-2（P=0.049） levels in the death group were significantly higher than those in the survival group. It was found by Multivariate Cox regression analysis that the Ang-2 level was an independent risk factor for the prognosis of the patients with cervical cancer after treatment（P=0.000） and that the clinical stage II was an independent protective factor for the prognosis of the patients with cervical cancer（P=0.006）. The AUC of the Ang-2 level predicting the prognosis of the patients with cervical cancer was significantly higher than that of the clinical stage and Tie-2 after treatment（P=0.000）， of which the optimal cut-off point was ≥1.22 ng/mL， and the sensitivity and specificity were 87.10% and 92.68%， respectively. Conclusion The serum and tissue expression levels of Tie-2 and Ang-2 in the patients with cervical cancer are relatively high. The serum Ang-2 level after treatment is an independent risk factor for prognosis and has a high predictive value for prognosis.

[Key words] Ang-2; Tie-2; Cervical cancer; Expression; Prognosis

宮頸癌是常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，且隨著性開放和社會(huì)發(fā)展，我國宮頸癌的發(fā)病率較以往明顯升高。早期宮頸癌表現(xiàn)多不典型，患者就診和確診時(shí)多已失去手術(shù)指征，因而具有較高的病死率（每年全世界有26萬人死于宮頸癌）[1]。新生血管的生成是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制之一，也是影響患者預(yù)后的重要因素，其中，影響血管生成的相關(guān)因子是目前腫瘤早期診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的研究熱點(diǎn)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，血管生成素-2（Angiogenin，Ang-2）及其酪氨酸受體Tie-2參與了血管生成和血管重塑過程，且在不同病情的宮頸癌患者中有不同表達(dá)水平，可能與治療療效和預(yù)后有一定的相關(guān)性[3]，但對(duì)于患者遠(yuǎn)期預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值尚不十分明確。為此，我院對(duì)72例宮頸癌患者進(jìn)行了一項(xiàng)回顧性研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2015年1月～2016年5月我院診治的宮頸癌患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床及病理檢查符合《宮頸癌診斷與治療指南（第4版）》[4]中宮頸癌的診斷;②預(yù)后分期Ⅱ～Ⅳ期;③均于我院行宮頸癌根治術(shù)治療及術(shù)后輔助化療;④新發(fā)患者，無前期治療干擾。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無法耐受相關(guān)治療而中途終止治療的患者;②患者依從性較差，無法配合隨訪工作者。共納入72例患者，年齡31～66歲，平均（53.13±4.09）歲，Ⅱ期18例，Ⅲ期41例，Ⅳ期13例;此外，選擇110例經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)排除惡性腫瘤的健康體檢患者，兩組患者的一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見表1。

1.2 治療方案

根據(jù)《宮頸癌及癌前病變規(guī)范化診療指南》[5]，預(yù)后分期為Ⅱ～Ⅳ的宮頸癌患者均推薦行術(shù)后輔助化療。其中，臨床Ⅱ期患者行單純FU類藥物化療;臨床Ⅲ期實(shí)施以5-FU為基礎(chǔ)聯(lián)合鉑類的方案化療，Ⅳ期患者實(shí)施以5-FU聯(lián)合鉑類化療聯(lián)合治療。

1.3 免疫組化檢查

1.3.1 組織芯片制備? 由高年資病理醫(yī)師重判每例的HE切片，在相應(yīng)癌組織和周圍正常組織各取3個(gè)區(qū)域，取樣針直徑1.5 mm，設(shè)計(jì)7×8點(diǎn)陣，共56位點(diǎn)，組織芯間距3.0 mm。52℃恒溫烤箱融蠟，4℃冰箱存放備用。

1.3.2 免疫組化檢查? 采用組織芯片系統(tǒng)（Quick-Ray，UT06，UNITMA，Korea）進(jìn)行分析。組織芯片切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇脫二甲苯、水化。加熱pH6.0檸檬酸緩沖液至98℃并行抗原修復(fù)12 min后分別滴加一抗Tie-2（ab13585，美國Abcam）和Ang-2抗體（ab78106， Abcam，美國Abcam），二抗為通用型IgG抗體-HRP多聚體，室溫或37℃孵育30 min。染色情況由2名高年資病理醫(yī)師分別評(píng)估，表達(dá)量值由X-tile軟件程序（Rimm Lab，Yale University，New Haven，CT，USA）進(jìn)行定量測(cè)量。

1.3.3 血清學(xué)檢查? 分別于治療前和治療完成后抽患者的靜脈血樣3 mL，離心后取血清待測(cè)。將患者的血清樣本統(tǒng)一標(biāo)號(hào)，使用Ang-和Tie-2相應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（日本IBL生產(chǎn)，購自深圳科潤達(dá)生物）及配套試劑，根據(jù)說明操作，將標(biāo)準(zhǔn)樣品和測(cè)試樣品使用自動(dòng)酶標(biāo)儀（雷杜RT-500）進(jìn)行定量測(cè)定。

1.4 觀察指標(biāo)

比較宮頸癌患者治療前后Tie-2和Ang-2的表達(dá)水平，分析預(yù)后良好與預(yù)后不佳患者臨床資料間的差異，應(yīng)用多因素Cox回歸模型研究影響宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并應(yīng)用受試者工作特征曲線評(píng)估對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.5 隨訪

根據(jù)病案信息每2個(gè)月對(duì)患者進(jìn)行一次隨訪，終點(diǎn)事件為全因死亡。隨訪時(shí)間為24個(gè)月，隨訪截止于2018年6月1日。預(yù)后不及定義為在隨訪期間死亡。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 25.0軟件，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，分類變量的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)變量采用秩和檢驗(yàn);計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，兩組比較采用SNK法。多因素Cox回歸分析探究危險(xiǎn)因素，并采用Logrank檢驗(yàn)計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（Hazard ratio，HR）。當(dāng)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和宮頸癌患者血清與組織Tie-2和Ang-2的表達(dá)水平比較

宮頸癌患者治療前血清與組織Tie-2（t=9.288， 23.737，P=0.000）的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，宮頸癌患者治療前血清與組織Ang-2水平顯著高于對(duì)照組（t=22.882、25.476，P=0.000）;治療后，宮頸癌患者的血清Tie-2和Ang-2的表達(dá)水平顯著低于治療前（t=14.988、3.497，P=0.000、0.002），見表2。手術(shù)和放化療后完全緩解的患者找不到病灶，故而無法取樣和檢測(cè)，因此未比較治療后組織Ang-2和Tie-2表達(dá)水平。

2.2 宮頸癌不同預(yù)后患者的臨床資料比較

在為期24個(gè)月的隨訪中，共發(fā)生全因死亡31例，死亡組的臨床分期（Z=4.027，P=0.000）、治療后血清Ang-2（t=3.820，P=0.000）和Tie-2水平（t=2.030，P=0.049）明顯高于生存組。見表3。

2.3 影響宮頸癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

多因素Cox回歸分析顯示，治療后Ang-2水平是影響宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=28.959，P=0.000），臨床分期Ⅱ期是宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素（HR=0.174，P=0.006）。見表4。

2.4 不同指標(biāo)預(yù)測(cè)宮頸癌患者預(yù)后的ROC曲線

應(yīng)用治療后血清Ang-2水平預(yù)測(cè)宮頸癌患者預(yù)后的AUC明顯高于臨床分期和Tie-2（Z=4.282，5.062， P=0.000，0.000），其最佳截點(diǎn)為≥1.22 ng/mL，敏感性和特異性分別為87.10%和92.68%，見圖1、表5。

3 討論

全球?qū)m頸癌的發(fā)病率從1980年的37.8萬例/年增加到2012年的52.8萬例/年，我國是宮頸癌高發(fā)地區(qū)之一[6]。盡管基于宮頸細(xì)胞學(xué)和HPV檢測(cè)的宮頸篩查方案可以有效降低宮頸癌的發(fā)病率，但由于患者社會(huì)、宗教和心理因素的影響，我國高危女性接受標(biāo)準(zhǔn)化篩查的比例還較低，導(dǎo)致較大比例的宮頸癌患者就診時(shí)已出現(xiàn)周圍或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，生存情況和生活質(zhì)量均較低[7]。血管的生成對(duì)腫瘤進(jìn)展至關(guān)重要，血管生成相關(guān)的標(biāo)志物在多種腫瘤中的高表達(dá)及其作用通路得到了大量研究證實(shí)[8]，并已顯示出作為治療中晚期的治療靶標(biāo)的巨大前景[9]。

人Ang及其受體Tie系統(tǒng)主要由三種分泌型配體（Ang-1、Ang-2和Ang-4）和兩種酪氨酸激酶受體（Tie-1和Tie-2）組成[10]，以上三種Ang可以直接與Tie-2結(jié)合并導(dǎo)致Tie-2的磷酸化和多聚化，從而引發(fā)下游信號(hào)傳導(dǎo)并調(diào)節(jié)血管重塑和成熟[11]。Ang-1和Ang-4廣泛表達(dá)于人類靜息脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞，具有維持血管成熟和穩(wěn)定的作用;而Ang-2在血管重塑和血管生成期間在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，并介導(dǎo)血管的重塑和外向型生長[12]。

本研究通過對(duì)72例宮頸癌患者及110例對(duì)照組宮頸組織和血清Ang-2與Tie-表達(dá)2水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，宮頸癌患者在治療前后的組織和血清Ang-2與Tie-2水平明顯升高，這顯示，宮頸癌患者的腫瘤組織及外周血中存在較高的Ang-2與Tie-2表達(dá)。腫瘤的血管生成不僅涉及既往存在的血管生長，也與新生血管的出現(xiàn)等生理過程密切相關(guān)，這其中，血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和Ang-2等在內(nèi)的影響血管生成的調(diào)節(jié)因素起到了重要作用[13]。目前基于VEGF的相關(guān)機(jī)制已有大量研究證實(shí)，其相關(guān)生物制劑也在臨床治療中得到了一定應(yīng)用。與VEGF促進(jìn)原有血管內(nèi)皮生長的作用不同，血管生成素（Ang）家族在血管形成、成熟、修復(fù)和通透性的調(diào)節(jié)中均起到了重要作用，并且與癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。作為Ang家族中作用效果最強(qiáng)的Ang-2，具有極強(qiáng)的破壞原有血管結(jié)構(gòu)并增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF敏感性的作用[15]。還有研究顯示，除了VEGF和Ang-2的共同表達(dá)促進(jìn)了新的血管產(chǎn)生之外，Ang-2還可以在不依賴VEGF的條件下促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，從而促進(jìn)血管重塑以及轉(zhuǎn)移區(qū)域血管生成[16]，這一作用被認(rèn)為與Ang-2與其血管內(nèi)皮特異性酪氨酸受體Tie-2有關(guān)[17]。

而本研究還顯示，治療后宮頸癌患者的血清Ang-2與Tie-2表達(dá)水平均出現(xiàn)了顯著下降，但仍高于對(duì)照組，可見手術(shù)聯(lián)合化療治療可以較為明顯地降低患者Ang-2及其受體Tie-2的表達(dá)水平，但患者治療后仍有一定程度的高表達(dá)狀態(tài)，這可能是患者發(fā)生遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良的重要因素。

通過對(duì)治療后患者進(jìn)行為期24個(gè)月的隨訪，共發(fā)生死亡事件31例，而對(duì)比死亡組與生存組患者的相關(guān)臨床資料，結(jié)果顯示，死亡組具有更高的臨床分期和治療后血清Ang-2水平，且多因素Cox回歸分析顯示，治療后血清Ang-2水平是預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而Ⅱ期患者的預(yù)后明顯優(yōu)于其他患者。分析與Tie-2相比，Ang-2與治療后預(yù)后具有更高的相關(guān)性的原因，可能與Ang-1/Ang-2表達(dá)平衡失調(diào)[18]，以及Ang-2可以通過與內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞上的整聯(lián)蛋白直接作用而發(fā)揮Tie-2非依賴性生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)[19]。

盡管目前宮頸癌相關(guān)手術(shù)和化療研究已取得一定進(jìn)展，但對(duì)于患者治療后的預(yù)后評(píng)估尚無較好的定量指標(biāo)。本研究通過應(yīng)用ROC曲線對(duì)不同指標(biāo)預(yù)測(cè)宮頸癌患者治療后的生存情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，治療后血清Ang-2水平預(yù)測(cè)宮頸癌患者預(yù)后的AUC明顯高于臨床分期和Tie-2，以最佳截點(diǎn)（≥1.22 ng/mL）預(yù)測(cè)患者2年生存的敏感性和特異性分別為87.10%和92.68%。臨床研究表明，腫瘤血管密度與各種實(shí)體瘤患者的不良預(yù)后之間存在直接相關(guān)性，而治療后仍高表達(dá)的Ang-2可以加速新生血管生成，并促進(jìn)殘留腫瘤組織的生長、擴(kuò)散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這也為應(yīng)用治療后Ang-2水平預(yù)測(cè)預(yù)后提供了理論依據(jù)。這與Li P等[20]應(yīng)用血清Ang-2水平預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的研究結(jié)論較為一致，而Diaz-Sanchez A等[21]使用血清Ang-2水平預(yù)測(cè)肝癌的侵襲力的研究也取得了較好的效果。

綜上所述，宮頸癌患者Tie-2和Ang-2的血清和組織表達(dá)水平較高，治療后血清Ang-2水平是影響宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并對(duì)患者的預(yù)后具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王臨虹，趙更力.中國子宮頸癌綜合防控指南[J].中國婦幼健康研究，2018，29（1）：1-3.

[2] Jayson GC，Kerbel R，Ellis LM，et al. Antiangiogenic therapy in oncology：Current status and future directions[J].Lancet，2016，388（10043）：518-529.

[3] Kerbel RS.A Decade of experience in developing preclinical models of advanced-or early-stage spontaneous metastasis to study antiangiogenic drugs，metronomic chemotherapy，and the tumor microenvironment[J]. Cancer J，2015，21（4）：274-283.

[4] 中國抗癌協(xié)會(huì)婦科腫瘤專業(yè)委員會(huì).宮頸癌診斷與治療指南（第四版）[J].中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2018， 34（5）：613-622.

[5] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).宮頸癌及癌前病變規(guī)范化診療指南（試行）[J].中國醫(yī)學(xué)前沿雜志（電子版），2013，（8）：40-49.

[6] Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，et al.Cancer incidence and mortality worldwide：Sources，methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer，2015， 136（5）：E359-E386.

[7] 薛鳳霞.子宮頸癌篩查和子宮頸病變的管理[J].中華醫(yī)學(xué)信息導(dǎo)報(bào)，2018，33（8）：22.

[8] Hernández-Bartolomé ，López-Rodríguez R，Borque MJ，et al.Angiopoietin-2/angiopoietin-1 as non-invasive biomarker of cirrhosis in chronic hepatitis C[J].World J Gastroenterol，2016，22（44）：9744-9751.

[9] 龍行濤，周琦.局部晚期宮頸癌治療現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2017，（11）：1206-1209.

[10] Eklund L，Saharinen P.Angiopoietin signaling in the vasculature[J]. Exp Cell Res，2013，319（9）：1271-1280.

[11] Biel NM，Siemann DW.Targeting the Angiopoietin-2/Tie-2 axis in conjunction with VEGF signal interference[J].Cancer Lett，2016，380（2）：525-533.

[12] Dewi NA，Aulanni'am A，Sujuti H，et al.Mechanism of retinal pericyte migration through Angiopoietin/Tie-2 signaling pathway on diabetic rats[J]. Int J Ophthalmol，2018，11（3）：375-381.

[13] Coelho AL，Araújo AM，Gomes MP，et al. Combined Ang-2 and VEGF serum levels：Holding hands as a new integral biomarker in non-small-cell lung cancers[J]. Future Oncol，2015，11（24）：3233-3242.

[14] Gadducci A，Lanfredini N，Sergiampietri C. Antiangiogenic agents in gynecological cancer：State of art and perspectives of clinical research[J]. Crit Rev Oncol Hematol，2015，96（1）：113-128.

[15] Scholz A，Plate KH，Reiss Y.Angiopoietin-2：A multifaceted cytokine that functions in both angiogenesis and inflammation[J].Ann N Y Acad Sci，2015，47（13）：45-51.

[16] Dong Z，Chen J，Yang X，et al.Ang-2 promotes lung cancer metastasis by increasing epithelial-mesenchymal transition[J].Oncotarget，2018，9（16）：12705-12717.

[17] Gerald D，Chintharlapalli S，Augustin HG，et al.Angiopoietin-2：An attractive target for improved antiangiogenic tumor therapy[J].Cancer Res，2013，73（6）：1649-1657.

[18] Yang P，Chen N，Yang D，et al. The ratio of serum Angiopoietin-1 to Angiopoietin-2 in patients with cervical cancer is a valuable diagnostic and prognostic biomarker[J].PeerJ，2017，5：e3387.

[19] Daly C，Eichten A，Castanaro C，et al. Angiopoietin-2 functions as a Tie2 agonist in tumor models，where it limits the effects of VEGF inhibition[J]. Cancer Res，2013， 73（1）：108-118.

[20] Li P，He Q，Luo C，et al. Diagnostic and prognostic potential of serum angiopoietin-2 expression in human breast cancer[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8（1）：660-664.

[21] Diaz-Sanchez A，Matilla A，Nu？觡ez O，et al. Serum angiopoietin-2 level as a predictor of tumor invasiveness in patients with hepatocellular carcinoma[J]. Scand J Gastroenterol，2013，48（3）：334-343.

（收稿日期：2019-07-29）