美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 定量檢測(cè)試劑盒測(cè)量不確定度研究

（北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102629）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的，以母豬繁殖障礙和各生長(zhǎng)階段豬群呼吸道疾病為特征的，嚴(yán)重影響全球養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病[1]，在我國(guó)俗稱(chēng)“豬藍(lán)耳病”。該病最初在北美和歐洲暴發(fā)，至今已有近30 年的流行歷史，且在許多養(yǎng)豬國(guó)家呈地方性流行[2]。每年給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成的損失高達(dá)幾十億美元，成為世界獸醫(yī)學(xué)界近年來(lái)重點(diǎn)關(guān)注的疫病之一[3]。目前，實(shí)驗(yàn)室中的PRRSV 病原學(xué)檢測(cè)通常采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 方法進(jìn)行，但不同廠家試劑盒的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)不一，被檢樣品判定為可疑的區(qū)間跨度較大，如被檢樣品在可疑區(qū)間出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，就需重新取樣提取RNA，擴(kuò)增后再進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑，則可判定為陽(yáng)性，由此導(dǎo)致的不確定度因素太大，給實(shí)驗(yàn)室工作人員造成了不必要的重復(fù)與對(duì)結(jié)果判定的困擾。因此，亟需建立一種更為客觀、準(zhǔn)確的判定方法，對(duì)可疑區(qū)域進(jìn)行精確判定。

測(cè)量不確定度是與測(cè)量結(jié)果關(guān)聯(lián)的一個(gè)參數(shù)，用于表征合理賦予被測(cè)量值的分散性[4]。它既可以用于“不確定度”方式，也可以作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差（或其給定的倍數(shù)）或給定置信度區(qū)間的半寬度。測(cè)量不確定結(jié)果的表達(dá)應(yīng)包括不確定度U，置信概率P（或包含因子）、自由度、包含因子K以及被測(cè)量的最佳估計(jì)值（或約定真值）。即X=±U，P，K[5]。《檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評(píng)價(jià)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)通用要求》（RB/T 214—2017）[6]指出：檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)根據(jù)需要，建立和保持應(yīng)用評(píng)定測(cè)量不確定的程序；檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)申請(qǐng)資質(zhì)認(rèn)定的檢驗(yàn)檢測(cè)項(xiàng)目中，相關(guān)檢驗(yàn)檢測(cè)方法有測(cè)量不確定度的要求時(shí)，檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)建立和保持應(yīng)用評(píng)定測(cè)量不確定度的程序，應(yīng)建立相應(yīng)數(shù)學(xué)模型，給出相應(yīng)檢驗(yàn)檢測(cè)能力的評(píng)定測(cè)量不確定度案例；鼓勵(lì)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)在測(cè)試出現(xiàn)臨界值，進(jìn)行內(nèi)部質(zhì)量控制或客戶(hù)有要求時(shí)，采用測(cè)量不確定度方法。為填補(bǔ)測(cè)量不確定度在獸醫(yī)領(lǐng)域的空白，本研究通過(guò)對(duì)市售的3 種美洲型PRRSV 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)量不確定度分析，建立3 種試劑盒的測(cè)量不確定度評(píng)估模型[7]，以期為動(dòng)物疫病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室出具更加客觀的檢測(cè)結(jié)果提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

3 種美洲型PRRSV 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)試劑盒（A、B、C），購(gòu)自北京市市場(chǎng)；4 種核酸提取試劑盒（D、E、F、G），購(gòu)自北京市市場(chǎng)，其中D、E 為磁珠法機(jī)提試劑盒，F(xiàn)、G 為柱式手提試劑盒；RNase-free Water，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；美洲型PRRSV變異株（JXA1）核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，證書(shū)編號(hào)GBW（E）090929。

1.2 儀器設(shè)備

熒光定量PCR 儀，購(gòu)自ABI 公司；TGuide S32 全自動(dòng)核酸提取純化儀，購(gòu)自天根生化科技有限公司；移液器，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司；Nano Drop 微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將美洲型PRRSV 變異株（JXA1）核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（105copies/μL）按1:10倍比稀釋至1:106。根據(jù)3 種試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)，每個(gè)稀釋度做6 個(gè)平行，記錄最低檢出限所對(duì)應(yīng)的Ct 值；以DNA 拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 測(cè)量不確定度模型建立 移液器校準(zhǔn)（C）產(chǎn)生的測(cè)量不確定度為u（C），根據(jù)移液器校準(zhǔn)證書(shū)與3 種試劑盒說(shuō)明書(shū)中使用的液體體積計(jì)算；溫度效應(yīng)（T）產(chǎn)生的測(cè)量不確定度為u（T），根據(jù)實(shí)驗(yàn)室溫度與水的膨脹系數(shù)計(jì)算；重復(fù)性測(cè)量引入的測(cè)量不確定度為u（S），根據(jù)公式（1），對(duì)3 種試劑盒最低檢出限的6 個(gè)重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 核酸提取試劑盒的選擇與性能評(píng)估 對(duì)不同廠家的核酸提取試劑盒進(jìn)行科學(xué)評(píng)估，利用PRRSV JXA1 株核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1:10 倍比稀釋至1:104；每個(gè)稀釋度做2 個(gè)重復(fù)，分別利用4 種核酸提取試劑盒，對(duì)每個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行核酸提取，然后進(jìn)行PRRSV 熒光定量PCR 檢測(cè)，比對(duì)Ct 值與擴(kuò)增曲線。

1.3.4 使用RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響評(píng)估 由于購(gòu)買(mǎi)的3 種熒光定量RT-PCR 檢測(cè)試劑盒都是一步法操作，即可直接以提取的PRRSV RNA 為模板進(jìn)行體系擴(kuò)增，且在試劑盒反應(yīng)試劑中包含反轉(zhuǎn)錄成分，因此本研究使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，對(duì)提取的PRRSV RNA 先反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再利用3 種熒光定量RT-PCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，比對(duì)兩種方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生的差異。利用3 種核酸提取試劑盒，對(duì)每個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行核酸提取，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行PRRSV 熒光定量RT-PCR 檢測(cè)，比對(duì)Ct 值與擴(kuò)增曲線。反轉(zhuǎn)錄體系如下：在1.5 mL 離心管中，加入8 μL RNA、1 μL DNTP、1 μL Oligo（dT）。65 ℃ 5 min，冰浴3 min；加入4.5 μL ddH2O、4 μL 5×Buffer、1 μL M-mlv、0.5 μL RNase Inhibitor；42 ℃ 1 h，70 ℃15 min；收集cDNA 并保存于-20 ℃冰箱。

2 結(jié)果

2.1 試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

將美洲型PRRSV 變異株（JXA1）核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（105copies/μL）進(jìn)行1:10 倍比稀釋?zhuān)? 種美洲型PRRSV 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖1 可以看出，試劑盒A 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.936 2x+33.195（R2=0.999 0）；從圖2 可以看出，試劑盒A 擴(kuò)增曲線良好，可以檢測(cè)到10 copies/μL，在1 copies/μL 有典型擴(kuò)增曲線，但試劑盒判定為可疑區(qū)域，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最低檢出限為1 copies/μL。從圖3 可以看出，試劑盒B 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-5.048 3x+40.140（R2=0.993 4）。從圖4 可以看出，試劑盒B 的擴(kuò)增曲線良好，可以檢測(cè)到102copies/μL，在10 copies/μL 有典型擴(kuò)增曲線，但試劑盒判定為可疑，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最低檢出限為10 copies/μL。從圖5 可以看出，試劑盒C 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-9.951 8x+60.365（R2=0.997 5）。從圖6 可以看出，試劑盒C 的擴(kuò)增曲線良好，可以檢測(cè)到103copies/μL，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最低檢出限為103copies/μL 。

圖1 試劑盒A 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 試劑盒A 擴(kuò)增曲線

圖5 試劑盒C 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 3 種試劑盒測(cè)量不確定度評(píng)估模型

2.2.1 移液器校準(zhǔn)（C）產(chǎn)生的測(cè)量不確定度u（C）試劑盒A 與試劑盒B 均使用23 μL 擴(kuò)增反應(yīng)液加2 μL 模板（共25 μL）體系。移液器校準(zhǔn)證書(shū)指出，使用23 μL 量程移液器的最大容許誤差為±0.8 μL，按矩形分布處理，校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為；使用2 μL 量程移液器最大容許誤差為±0.24 μL，按矩形分布處理，校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。試劑盒C 使用20 μL 擴(kuò)增反應(yīng)液加5 μL 模板（共25 μL）體系。移液器校準(zhǔn)證書(shū)指出，使用20 μL 量程移液器最大容許誤差為±0.8 μL，按矩形分布處理，校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，使用5 μL 量程移液器最大容許誤差為±0.4 μL，按矩形分布處理，校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（C）。

2.2.2 溫度效應(yīng)（T）產(chǎn)生的測(cè)量不確定度u（T）考慮實(shí)驗(yàn)室溫度對(duì)移液器加液體積的影響，測(cè)定實(shí)驗(yàn)室的溫度在（20±4）℃之間波動(dòng)，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，按矩形分布，使用23 μL 量程移液器由溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（T）=23×4×2.1×10-4=0.019 μL；同理，使用2 μL 量程移液器的u（T）=0.001 68 μL，使用20 μL 量程移液器的u（T）=0.016 8 μL，使用5 μL 量程移液器的u（T）=0.004 2 μL。

2.2.3 重復(fù)性測(cè)量引入的測(cè)量不確定度u（S）對(duì)3 種試劑盒最低檢出限的6 個(gè)重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果代入公式（1），計(jì)算重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度。試劑盒A 最低檢出限Ct 平均值，代入公式得到；試劑盒B 最低檢出限Ct平均值，代入公式得到；試劑盒C 最低檢出限Ct 平均值，代入公式得到。

2.2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度 由于移液器校準(zhǔn)和溫度效應(yīng)是2 個(gè)相互獨(dú)立的分量，因此23 μL反應(yīng)體系引起的標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度u（V1）=，2 μL 模板引起的標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度u（V2）=，移液器與溫度產(chǎn)生的合成不確定度。試劑盒A 重復(fù)性測(cè)量引入的測(cè)量不確定度=0.2443，試劑盒A 的合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度=0.5403；取k=2，UA=2×uA=1.080 6（置信水平P=0.95），。同理，試劑盒B 的合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度=0.540 5；取k=2，UB=2×uB=1.081（置信水平P=0.95），。試劑盒C 的合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度uC==0.540 5；取k=2，UB=2×uB=1.081（置信水平P=0.95），。20 μL 反應(yīng)體系引起的標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度u（V1）=，5 μL 模板引起的標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度u（V2）=，移液器與溫度產(chǎn)生的合成不確定度u（V3）=。試劑盒C 重復(fù)性測(cè)量引入的測(cè)量不確定度=0.277，試劑盒C 的合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度；取k=2，Uc=2×uC=1.171（置信水平P=0.95），。

2.3 核酸提取試劑盒選擇與評(píng)估

篩選不同廠家的核酸提取試劑盒，將美洲型PRRSV 變異株（JXA1）核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（105copies/μL）1:10 倍比稀釋至1:104后進(jìn)行核酸提取，并用微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀，對(duì)PRRSV 原液RNA 濃度進(jìn)行測(cè)定：核酸提取試劑D 提取的RNA 濃度為40.16 ng/μL，核酸提取試劑E 為20.54 ng/μL，核酸提取試劑F 為35.76 ng/μL，核酸提取試劑G 為33.08 ng/μL。使用試劑盒A 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表1。核酸提取試劑D 提取RNA 可檢測(cè)到1:104濃度，且Ct 值較其他廠家提取試劑盒靠前，效果最佳。核酸提取試劑D 提取RNA 效率最高，4 個(gè)廠家核酸提取試劑盒PCR 擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖7。

2.4 使用RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

使用TAKARA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，對(duì)核酸提取試劑D、E、F、G提取的PRRSV RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀，對(duì)反轉(zhuǎn)錄后PRRSV 原液cDNA 濃度進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)核酸提取試劑D 提取的cDNA 濃度為40.08 ng/μL，核酸提取試劑E 為20.28 ng/μL，核酸提取試劑F為32.88 ng/μL，核酸提取試劑G 為32.96 ng/μL。使用試劑盒A 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表2。核酸提取試劑D 提取cDNA 的效率最高，PCR 擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖8。

表1 不同核酸提取試劑的核酸qPCR Ct 值

圖7 4 種核酸提取試劑盒擴(kuò)增曲線

圖8 4 種核酸提取試劑盒反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增曲線

表2 不同核酸提取試劑反轉(zhuǎn)錄后的核酸qPCR Ct 值

3 討論

測(cè)量不確定度評(píng)估是獸醫(yī)領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)室認(rèn)可質(zhì)量提升的制約因素。獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室評(píng)估測(cè)量不確定度，重在應(yīng)用[8]。本研究的PRRSV RT-PCR 定量檢測(cè)試劑盒測(cè)量不確定度評(píng)估結(jié)果可以作為實(shí)驗(yàn)室控制檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量的一種手段，當(dāng)樣品落在臨界值時(shí)，可以用已建立的模型進(jìn)行輔助判斷。

本研究填補(bǔ)了獸醫(yī)領(lǐng)域在動(dòng)物疫病檢測(cè)過(guò)程中出具測(cè)量不確定度報(bào)告的空白，利用美洲型PRRSV 變異株（JXA1）核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)市售的3種PRRSV檢測(cè)試劑盒分別測(cè)量了不確定度評(píng)估，發(fā)現(xiàn)3 種試劑盒存在敏感性差異：試劑盒A 可以檢測(cè)到10 copies/μL，在1 copies/μL 判定為可疑；試劑盒B 可以檢測(cè)到102copies/μL，在10 copies/μL判定為可疑；試劑盒C 可以檢測(cè)到103copies/μL。3 種試劑盒對(duì)樣品可疑區(qū)域判讀存在差異：試劑盒A 在30 ＜Ct ＜37 判為可疑，建立的測(cè)量不確定度模型為；試劑盒B 在30 ＜Ct ＜37 判為可疑，建立的測(cè)量不確定度模型為；試劑盒C 在30 ＜Ct ＜35 判為可疑，建立的測(cè)量不確定度模型為。可以看出，雖然3 種試劑盒自身存在敏感性差異，但本研究根據(jù)每個(gè)試劑盒建立了測(cè)量不確定度模型，縮小了試劑盒判定為可疑的區(qū)域，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的精準(zhǔn)判讀。

移液器引入的測(cè)量不確定度大小與移液器的檢定校準(zhǔn)與加樣體積有關(guān)，按照《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006），實(shí)驗(yàn)室每年應(yīng)定期對(duì)移液器進(jìn)行檢定校準(zhǔn)[9]。本研究對(duì)3 種試劑盒2 種反應(yīng)體系中移液器引入的測(cè)量不確定度進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)23 μL＋2 μL 體系移液器引入的測(cè)量不確定度=0.482 μL，20 μL＋5 μL 體系移液器引入的測(cè)量不確定度u（20 μL＋5 μL）=0.517 μL。因此，在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)過(guò)程中，加樣體積與Ct 值存在一定關(guān)系，需要考慮移液器帶來(lái)的測(cè)量不確定度影響。

本研究探究了使用反轉(zhuǎn)錄試劑將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 進(jìn)行試劑盒擴(kuò)增反應(yīng)，與直接核酸提取RNA 進(jìn)行試劑盒擴(kuò)增對(duì)比。購(gòu)入的3 種PRRSV熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒均為一步法提取，逆轉(zhuǎn)錄酶與PCR 反應(yīng)體系在同一反應(yīng)液中[10]。PRRSV JXA1 株標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)依次稀釋至1:1、1:10、1:100 倍時(shí)，未進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試劑盒的核酸比進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試劑盒反應(yīng)的核酸擴(kuò)增Ct 值小，出峰時(shí)間提前，但稀釋到1:103與1:104濃度時(shí)，未進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試劑盒的核酸比進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試劑盒反應(yīng)的核酸Ct 值大，出峰時(shí)間靠后。核酸提取試劑提取效率越高，熒光定量PCR Ct 值越靠前。分析原因可能為進(jìn)行二次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使逆轉(zhuǎn)錄效率變高[11]，因而增加了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋到1:103與1:104濃度的cDNA擴(kuò)增效率。該結(jié)果為今后實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果判讀奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究對(duì)市售的3 個(gè)廠家的PRRSV 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)試劑盒建立了測(cè)量不確定度評(píng)估模型，計(jì)算出試劑盒A 的測(cè)量不確定度模型為=33.218±1.080 6（P=0.95），試劑盒B 為=37.73±1.081（P=0.95），試劑盒C 為=30.22±1.171（P=0.95）。本研究利用建立的測(cè)量不確定度模型，對(duì)試驗(yàn)過(guò)程中移液器、溫度、重復(fù)性測(cè)量環(huán)節(jié)進(jìn)行了不確定度分析，認(rèn)為移液器與重復(fù)性測(cè)量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的不確定度影響較大，在今后的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中應(yīng)引起重視，需規(guī)范操作。同時(shí)，縮小了試劑盒對(duì)可疑樣品的判定區(qū)域，對(duì)于樣品臨界參考值的檢測(cè)結(jié)果判定具有實(shí)際意義。通過(guò)比對(duì)不同廠家核酸提取試劑，篩選出提取效率最高的試劑盒，使病毒核酸吸取更加均勻，試驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定。本研究建立的病原學(xué)檢測(cè)測(cè)量不確定度模型為獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果不確定度評(píng)估及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。