小鼠不同品系、性別及體重對(duì)豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評(píng)價(jià)的影響

趙俊杰，李 建，李偉杰，姚文生，李 陽(yáng)，王團(tuán)結(jié)

（1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

豬丹毒（swine erysipelas）是由紅斑丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的傳染性疾病。近年來，豬丹毒由散發(fā)逐漸呈流行暴發(fā)態(tài)勢(shì)，對(duì)我國(guó)部分地區(qū)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，作為人獸共患病，動(dòng)物攜帶病原感染人的病例接連不斷，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全和動(dòng)物源性食品安全[1-2]。

目前，在市場(chǎng)流通環(huán)節(jié)有豬丹毒活疫苗和滅活疫苗?；钜呙缫愿玫拿庖弑Ｗo(hù)效果受到廣大養(yǎng)殖場(chǎng)戶的青睞，為防控豬丹毒發(fā)揮了重要作用。根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2015 年版三部）（以下稱《獸藥典》）規(guī)定，豬丹毒活疫苗安全檢驗(yàn)使用小鼠或豬進(jìn)行。從動(dòng)物試驗(yàn)替代原則和經(jīng)濟(jì)成本考慮，優(yōu)先使用小動(dòng)物替代大動(dòng)物開展檢驗(yàn)。原豬丹毒活質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)自1985 年提出至今，雖經(jīng)修訂，但是隨著活株疫苗生產(chǎn)代次的提高，使用小鼠進(jìn)行安全檢驗(yàn)的結(jié)果穩(wěn)定性可能會(huì)出現(xiàn)問題。同時(shí)，影響小鼠免疫反應(yīng)的幾種因素對(duì)豬丹毒活疫苗安全檢驗(yàn)的影響也不清楚。本研究選用豬丹毒活疫苗（GC42 株），探索小鼠不同品系、性別及體重對(duì)安全檢驗(yàn)的影響，以期為豬丹毒活疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂以及企業(yè)生產(chǎn)檢驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

本試驗(yàn)所用豬丹毒活疫苗（GC42 株，產(chǎn)品批號(hào)19053001）及20%鋁膠生理鹽水，均購(gòu)自廣西麗原生物股份有限公司；活菌計(jì)數(shù)使用的馬丁肉湯和馬丁瓊脂，均購(gòu)自北京中海生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)所用SPF 級(jí)小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 活菌計(jì)數(shù)

鋪平板：將馬丁瓊脂融化待溫度降至50 ℃左右，按比例加入10%血清后，灌制平板，平板正置放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜，無雜菌生長(zhǎng)為合格，待用。

連續(xù)稀釋與滴平板：按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求每頭份樣品應(yīng)至少含有的活菌數(shù)以及樣品標(biāo)示的頭份數(shù)計(jì)算樣品稀釋倍數(shù)。本樣品為50 頭份的豬丹毒活疫苗凍干苗，每批隨機(jī)抽樣3 瓶，首先分別加入40 mL馬丁肉湯充分溶解，各取1 mL 菌液與9 mL 馬丁肉湯進(jìn)行10 倍系列稀釋，稀釋至10-6稀釋度，取10-6稀釋度菌液接種在制備好的含10%血清的馬丁瓊脂上，每瓶樣品接種平板3 個(gè)，0.1 mL/個(gè)，使菌液均勻散開，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，待平板晾干后，倒置平板，培養(yǎng)48 h。

計(jì)算菌數(shù)：肉眼觀察平板菌落，并在平板底面點(diǎn)數(shù)，算出每個(gè)樣品的3 個(gè)平板的平均菌落數(shù)，計(jì)算出每頭份疫苗中含有的活菌數(shù)（CFU）。

1.4 安全檢驗(yàn)

1.4.1 檢驗(yàn)方法 《獸藥典》豬丹毒活疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，若選用小鼠進(jìn)行安全檢驗(yàn)，需要符合下述要求：按照疫苗標(biāo)簽注明頭份，將疫苗用20%氫氧化鋁膠生理鹽水稀釋，皮下注射體重20～22 g小鼠10 只，皮下注射10 只，各2 頭份，觀察14 d。注射GC42 疫苗的小鼠應(yīng)全部健活。否則，需用小鼠按照上述方法重檢1 次，如果仍不符合規(guī)定，可用豬檢驗(yàn)1 次。

1.4.2 試驗(yàn)分組

1.4.2.1 小鼠不同品系對(duì)安全檢驗(yàn)的影響 本試驗(yàn)采用4 種品系小鼠分別為KM、ICR、C57BL/6N和BALB/c，每組10 只，分別按照上述檢驗(yàn)方法注射2、6 和10 頭份，重復(fù)3 次試驗(yàn)。同時(shí)，小鼠體重均位于20～22 g 之間，全部為雌性。

1.4.2.2 小鼠不同性別對(duì)安全檢驗(yàn)的影響 本試驗(yàn)采用雌性和雄性ICR 小鼠（體重20～22 g），每組10 只，分別按照上述檢驗(yàn)方法注射2、6 和10頭份，重復(fù)3 次試驗(yàn)。

1.4.2.3 小鼠不同體重對(duì)安全檢驗(yàn)的影響 本試驗(yàn)采用13～14、21～22 和29～30 g 雌性ICR 小鼠，每組10 只，分別按照上述檢驗(yàn)方法注射2、6 和10 頭份，重復(fù)3 次試驗(yàn)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANONA），P＜0.05 為差異顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 豬丹毒活疫苗（GC42 株）活菌計(jì)數(shù)

由表1 可知，活菌計(jì)數(shù)結(jié)果以每批產(chǎn)品3 瓶樣品中含活菌數(shù)的最小值為最終結(jié)果，豬丹毒活疫苗（GC42 株）的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果為11.2×108CFU/頭份，符合《獸藥典》中豬丹毒活疫苗活菌計(jì)數(shù)中含GC42 活菌應(yīng)不低于7.0×108CFU/頭份的要求。

表1 活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 小鼠不同品系對(duì)豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評(píng)價(jià)的影響

由表2 可知，按照《獸藥典》的要求，KM、ICR、C57BL/6N 和BALB/c 小鼠接種2 頭份豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評(píng)價(jià)一次性通過率均為100%。但是在6 頭份和10 頭份劑量免疫時(shí)，4 種品系小鼠出現(xiàn)差異：KM 小鼠在6 頭份劑量組仍保持33.3%通過率；ICR 小鼠在6 頭份和10 頭份組一次性通過率為0；C57BL/6N 品系小鼠在3 個(gè)劑量組未出現(xiàn)小鼠死亡，一次性通過率為100%；BALB/c 小鼠在6 頭份和10 頭份組一次性通過率為0，且小鼠死亡率顯著高于其他各組（P＜0.05）。

2.3 小鼠不同性別對(duì)豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評(píng)價(jià)的影響

由表3 可知，在2 頭份免疫組，雄性組小鼠出現(xiàn)1 例小鼠死亡，雌性組小鼠3 次試驗(yàn)全部合格；在6 頭份和10 頭份組，小鼠死亡數(shù)量均超過了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，同時(shí)可見，10 頭份組雄性小鼠死亡率顯著高于雌性組（P＜0.05）。

2.4 不同體重小鼠對(duì)豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評(píng)價(jià)的影響

由表4 可知，21～22 和29～30 g 小鼠免疫2 頭份一次性通過率為100%。隨著小鼠體重增加，各免疫組小鼠死亡率呈下降趨勢(shì)。

表2 小鼠不同品系對(duì)豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評(píng)價(jià)的影響

表3 小鼠不同性別對(duì)豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評(píng)價(jià)的影響

表4 小鼠不同體重對(duì)豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全評(píng)價(jià)的影響

3 討論

疫苗安全性評(píng)價(jià)既有疫苗所含抗原本身對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物引起的特異性反應(yīng)，也包含疫苗內(nèi)的其他成分對(duì)機(jī)體引發(fā)的毒性反應(yīng)。在進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)在動(dòng)物死亡時(shí)判定是否屬于疫苗本身導(dǎo)致的死亡[3]。小鼠是獸用生物制品安全評(píng)價(jià)最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，其穩(wěn)定性對(duì)疫苗安全檢驗(yàn)或評(píng)價(jià)至關(guān)重要，而實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果常出現(xiàn)結(jié)果不穩(wěn)定、可重復(fù)性差等問題。本研究聚焦小鼠品系、性別及體重等諸多因素，比較其對(duì)豬丹毒活疫苗（GC42）免疫反應(yīng)的差異。

動(dòng)物對(duì)各類細(xì)菌、病毒等微生物的易感性取決于其主要組織相容性復(fù)合體（MHC）。不同品系小鼠對(duì)同一微生物的免疫反應(yīng)可能存在明顯差異，如帶等位基因H-2b 的小鼠（如C57BL/6N）比帶有等位基因H-2k 的小鼠（如C58、C3H）抵抗力強(qiáng)。BALB/c 小鼠極易受到假單胞菌強(qiáng)毒株的感染，而C57BL/6N 小鼠則具有一定抵抗力[4]。本研究表明，C57BL/6N 小鼠對(duì)豬丹毒活疫苗（GC42株）的耐受力較其他三種品系小鼠最強(qiáng)，而同為近交系的BALB/c 小鼠最為敏感，試驗(yàn)1 數(shù)據(jù)顯示該組小鼠死亡率100%。按照《獸藥典》關(guān)于豬丹毒活疫苗安全檢驗(yàn)規(guī)定，接種2 頭份劑量小鼠不能出現(xiàn)因疫苗導(dǎo)致的死亡。本研究證明，4 種品系小鼠均可通過豬丹毒活疫苗（GC42 株）安全檢驗(yàn)。

性別也是遺傳因素的重要方面。通常認(rèn)為，雌鼠產(chǎn)生抗體水平通常高于雄鼠，并且維持時(shí)間也比雄性小鼠較長(zhǎng)。同時(shí)，性激素作為內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的重要一部分與免疫系統(tǒng)存在一定關(guān)聯(lián)[5]。本研究比較了ICR 小鼠雌性和雄性對(duì)不同劑量的豬丹毒活疫苗（GC42 株）的耐受能力，結(jié)果顯示，在2 頭份和6 頭份劑量組雌性和雄性小鼠均未出現(xiàn)顯著差異，但是在10 頭份劑量組，雄性小鼠死亡率顯著高于雌性小鼠。

在獸用生物制品評(píng)價(jià)中選擇日齡適宜的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是非常重要的。幼齡小鼠免疫系統(tǒng)機(jī)能發(fā)育不完善或機(jī)能很弱，但是成年后隨年齡增加免疫反應(yīng)的活性也減弱[6-7]。本研究還探索了13～14 g 規(guī)格小鼠對(duì)豬丹毒活疫苗（GC42 株）最為敏感，死亡率顯著高于其他各組，無法用于該疫苗的安全檢驗(yàn)。隨著體重增加，ICR 小鼠對(duì)超劑量豬丹毒活疫苗的耐受力也逐漸增加。