乳腺癌組織中miR-181、Prox1的表達(dá)及臨床意義

王樹(shù)江，張 明，劉 鵬

乳腺癌屬于常見(jiàn)的女性惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增加、發(fā)病年齡逐年降低，對(duì)女性的健康及生命構(gòu)成巨大威脅。盡管治療手段日趨多樣，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致患者死亡或影響預(yù)后的主要問(wèn)題[1]。因此，深入探索乳腺癌的致病機(jī)制是找尋高效、安全的治療方式過(guò)程中亟待解決的熱點(diǎn)難題。微小RNA（miRNA）屬于非編碼小分子RNA，能夠調(diào)控30%基因組中相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動(dòng)至關(guān)重要[2]。研究表明[3]，微小RNA-181（miR-181）具有促癌和抑癌雙重特性，在胃癌中能通過(guò)下調(diào)KLF6等抑癌基因促進(jìn)癌癥進(jìn)展。同源異型盒轉(zhuǎn)錄因子（Prox1）是源自果蠅prospero基因克隆的同源基因，位于人類染色體1q32上，對(duì)細(xì)胞分化及器官發(fā)育至關(guān)重要[4]。既往研究表明[5]，Prox1能夠促進(jìn)淋巴管的生成，重建機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而抑制卡波西式肉瘤細(xì)胞的增殖及分化。目前，miR-181和Prox1的基因表達(dá)情況及二者在乳腺癌中的相關(guān)性研究較少，因此，本研究將探討乳腺癌組織中miR-181、Prox1的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析本院2016年7月—2019年3月收治的80例乳腺癌患者的基本信息及病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《世界衛(wèi)生組織腫瘤分類診斷系統(tǒng)》[6]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)且術(shù)后病理均證實(shí)為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；（2）患者基本信息及病理資料完整，且自愿參加本次研究；（3）既往無(wú)乳腺手術(shù)史或放化療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并乳腺其他嚴(yán)重疾病或其他原發(fā)惡性腫瘤者；（2）全身嚴(yán)重感染者；（3）肝腎功能失代償者；（4）淋巴循環(huán)系統(tǒng)受損者。本組80例患者平均年齡（55.31±8.67）歲；高分化47例、中分化23例、低分化10例；Her-2陽(yáng)性36例、Her-2陰性44例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例；TNM分期Ⅰ期41例、Ⅱ期27例、Ⅲ期7例、Ⅳ期5例；腫瘤直徑≤3 cm39例，＞3 cm41例。本院倫理委員會(huì)已批準(zhǔn)本次研究，且所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法 采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRTPCR）技術(shù)定量分析miR-181和Prox1的表達(dá)水平。術(shù)中分別取患者癌組織及其癌旁正常乳腺組織（距癌3 cm處），暫存于液氮后，統(tǒng)一保存于-80℃冰箱。將兩種組織（均30 mg）在冰上研磨后滴加1mlTrizol試劑（Invitrogen公司），遵循操作流程提取總RNA。通過(guò)PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa公司）將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒（TaKaRa公司）定量檢測(cè)miR-181和Prox1的表達(dá)情況。miR-181和Prox1的反應(yīng)條件均為16 ℃ 30 min，42 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。PCR 擴(kuò)增體系為：SYBR Premix 12.5 μL、上下游引物均為0.5 μL、cDNA emplate 2 μL、dH2O 9.5 μL，共計(jì) 25 μL。miR-181 的上游引物序列為5’-GGGCAGCCTTAAGAGGA-3’、下游為 5’-CAGTGCGTGTCGTGGA-3’，內(nèi)參基因U6的上游引物序列為5’-GCTTCGG CAGCACATATACTAAAAT-3’、下游為 5’-CGC TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；Prox1上 游 引物序列為 5’-GGGAAGTGCAATGCAGGAAG-3’、下游為 5’-GCATCTGTTGAACTTTACGTCGG-3’，內(nèi)參基因Actin上游引物序列為5’-TCCCTGGA GAAGAGCTACG-3’、下游為 5’-GTAGTTTCGT GGATGCCACA-3’。引物由上海生工生物公司制作合成。miR-181和Prox1的PCR反應(yīng)條件均為95 ℃ 30 s、變性 95 ℃ 5 s、退火 60 ℃ 15 s、延伸72 ℃ 10 s，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本測(cè)量3次。以相對(duì)Ct值法檢測(cè)miR-181和Prox1的表達(dá)量，結(jié)果采用?Ct值表示，二者相對(duì)于U6和Actin的比值為2-??Ct，其中?Ct=Ct目的基因－ Ct內(nèi)參基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)均由SPSS22.0軟件處理。計(jì)量資料以表示，多組間比較應(yīng)用方差分析，兩組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性檢驗(yàn)應(yīng)用Pearson相關(guān)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中miR-181和Prox1的表達(dá)量比較 乳腺癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織miR-181的表達(dá)量分別為1.59±0.47、0.32±0.10，乳腺癌組織高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.533，P＜0.001）；而Prox1的表達(dá)量分別為0.61±0.20、1.95±0.34，乳腺癌組織低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=29.911，P＜0.001），見(jiàn)圖1。

圖1 乳腺癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中miR-181和Prox1的表達(dá)量比較

2.2 乳腺癌組織中miR-181和Prox1的表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌組織中miR-181和Prox1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及腫瘤分化程度有關(guān)（P均＜0.05），而與患者腫瘤大小、Her-2表達(dá)及年齡無(wú)關(guān)（P均＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌組織中miR-181和Prox1的表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 乳腺癌組織中miR-181和Prox1表達(dá)的相關(guān)性 乳腺癌組織中miR-181的表達(dá)量和Prox1的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.777，P＜0.001），見(jiàn)圖 2。

圖2 乳腺癌組織中miR-181和Prox1表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

乳腺癌是常見(jiàn)的女性惡性腫瘤，其中以浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌最常見(jiàn)，嚴(yán)重危害女性健康。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)[7]，全世界年均新增乳腺癌患者約120萬(wàn)例，同時(shí)每年約有50萬(wàn)女性死于乳腺癌。乳腺癌的發(fā)生并不是某一因素決定，而是多步驟和多基因共同影響所致。目前，以手術(shù)、化療及放療為主的綜合治療是臨床主要的治療手段，盡管能夠適當(dāng)改善患者生活質(zhì)量，且提高5年生存率，但是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍會(huì)嚴(yán)重影響治療效果[8]。隨著人們對(duì)分子生物學(xué)研究的不斷深入，原癌基因、抑癌基因及相關(guān)信號(hào)通路的異常被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[9]，非編碼RNA、組蛋白修飾以及DNA甲基化能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡和分裂，對(duì)腫瘤發(fā)生和演變產(chǎn)生重要影響。

miRNA是長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小RNA，通過(guò)激活啟動(dòng)子、降解信使RNA以及轉(zhuǎn)錄后抑制等方式調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，在細(xì)胞生命活動(dòng)或發(fā)揮功能等過(guò)程中至關(guān)重要[10]。miR-181由4種高度保守的成熟miRNA構(gòu)成，主要位于3條不同的染色體上，能夠啟動(dòng)G0/G1期，從而促進(jìn)細(xì)胞的分裂和增殖[11]。研究表明[11]，miR-181通過(guò)調(diào)控DAX-1基因和組織金屬蛋白酶抑制因子3（TIMP3）促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及使其穿透基底膜能力增強(qiáng)，有利于癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-181的表達(dá)量較癌旁組織上升（P＜0.05），表明miR-181可能對(duì)乳腺癌的發(fā)生起促進(jìn)作用。目前，miR-181在乳腺癌組織中上調(diào)的具體機(jī)制仍不清晰，可能與TGF-β信號(hào)通路在乳腺癌中被激活，進(jìn)而使miR-181表達(dá)量增加有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-181的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及分化程度有關(guān)。其機(jī)制可能為激活的TGF-β信號(hào)通路使其下游靶基因失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張征突變（ATM）基因下調(diào)，而ATM基因作為重要的抑癌基因，其表達(dá)下調(diào)增強(qiáng)癌細(xì)胞的分化和侵襲能力[13]。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)，在炎性乳癌中，miR-181能夠靶向結(jié)合PTEN蛋白的3' UTR端，從而抑制PTEN表達(dá)，最終促進(jìn)乳腺癌增殖和遷移。此外，miR-181上調(diào)后能夠激活hippo信號(hào)通路，使其下游基因（如BLC2L1和CTGF）表達(dá)，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞無(wú)限增殖并增強(qiáng)其侵襲能力。

Prox1是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，具有高度保守性，是胚胎發(fā)育時(shí)淋巴分化的標(biāo)志，能夠參與腫瘤細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移途徑，并對(duì)其增殖、侵襲及分化產(chǎn)生重要影響。在動(dòng)物試驗(yàn)中，敲除Prox1基因后，大鼠的淋巴系統(tǒng)、肝臟及胰腺分化受阻，表明Prox1在多種器官的發(fā)育過(guò)程起重要作用[15]。既往研究表明[16]，Prox1下調(diào)后，腺苷-肌酐的核苷酸轉(zhuǎn)化和腫瘤抑制功能紊亂失調(diào)，從而使胰腺癌形成風(fēng)險(xiǎn)增加或使其惡性程度增加。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中Prox1的表達(dá)量較癌旁組織降低。其機(jī)制可能為乳腺癌組織中Prox1基因自身轉(zhuǎn)錄沉默，同時(shí)其第一內(nèi)含子的CpG島呈高度甲基化，進(jìn)而導(dǎo)致Prox1表達(dá)下調(diào)[17]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中Prox1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及分化程度有關(guān)。其機(jī)制可能為乳腺癌組織中Prox1失活，使其對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的抑制能力減弱，導(dǎo)致正常細(xì)胞外基質(zhì)膜降解，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。研究表明，敲除Prox1基因后，正常細(xì)胞異常凋亡，而癌細(xì)胞表現(xiàn)為異常增殖，且細(xì)胞周期抑制劑CDKN1b和CDKN1c表達(dá)下調(diào)，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞無(wú)限增殖，侵襲性增加[19]。同時(shí)，Prox1失活或下調(diào)后，內(nèi)皮細(xì)胞由淋巴分化轉(zhuǎn)為血管型分化，層粘連蛋白上調(diào)，使癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[15]。

本研究結(jié)果顯示，癌組織中的Prox1表達(dá)量和miR-181表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，表明Prox1可能作為miR-181的下游靶點(diǎn)，miR-181通過(guò)轉(zhuǎn)錄沉默降低Prox1表達(dá)，從而使乳腺癌惡性度增加。盡管Prox1和miR-181具體相互作用機(jī)制目前仍不清楚，但二者均能對(duì)MMP及其抑制因子進(jìn)行調(diào)控，miR-181是否通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Prox1調(diào)控MMP仍需進(jìn)一步研究[11,20]。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-181表達(dá)增加，而Prox1表達(dá)降低，二者均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及分化程度有關(guān)，對(duì)臨床評(píng)估患者病情具有潛在提示意義，也是靶向藥物治療研發(fā)的新方向。