DPYD、GSTP1、MTHFR基因多態(tài)性對(duì)5-FU類基礎(chǔ)化療結(jié)直腸癌患者療效的影響

張杰,李昌海，李林子，王琴，方功，謝雄偉，韋智丹，張勇，廖秋霞

荊門市第一人民醫(yī)院，湖北荊門 448000

結(jié)直腸癌(CRC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前我國(guó)CRC的發(fā)病率正以年均4.2%的速度增長(zhǎng)。據(jù)2015年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)CRC發(fā)病率分別位居男、女惡性腫瘤發(fā)病率的第三位和第二位[1]，嚴(yán)重威脅人民群眾的健康?；熑允侵委烠RC主要手段，以5-FU類(氟尿嘧啶、卡培他濱和替加氟等)為基礎(chǔ)的化療方案是治療晚期CRC常用方案。但在臨床治療中發(fā)現(xiàn)CRC患者在接受以5-FU類為基礎(chǔ)的化療方案時(shí)，其化療療效及導(dǎo)致的腹瀉、口腔黏膜炎、骨髓抑制和心臟毒性等存在個(gè)體化差異[2]。5-FU類是一種抗代謝藥物，它對(duì)很多實(shí)體腫瘤有較好活性，其抗腫瘤活性是通過(guò)干擾DNA合成和mRNA翻譯來(lái)實(shí)現(xiàn)的。5-FU類藥物進(jìn)入機(jī)體后，80%以上經(jīng)肝臟和外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中的二氫嘧啶脫氫酶(DPD)還原為二氫氟尿嘧啶，進(jìn)而代謝生成尿素、氨和二氧化碳等終產(chǎn)物排出體外。僅1%～5%進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，在磷酸激酶的催化下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為活性代謝物氟脫氧尿苷-磷酸(FdUMP)、氟脫氧尿苷三磷酸(FdUTP)和氟尿苷三磷酸(FUTP)。FdUMP與胸苷酸合成酶(TS)及亞甲基四氫葉酸(CH2FH4)以共價(jià)結(jié)合形成三元復(fù)合物(FdUMP-dTMP-TS酶)，從而抑制TS活性，進(jìn)而干擾DNA的合成。FdUTP和FUTP通過(guò)摻入DNA和RNA鏈中，破壞其結(jié)構(gòu)和功能的完整性[3]。5-FU類藥物代謝過(guò)程中的各種關(guān)鍵酶的相應(yīng)基因[如DPD基因(DPYD)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1(GSTP1)和亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)等]多態(tài)性可能導(dǎo)致5-FU類藥物抗腫瘤作用和(或)不良反應(yīng)的個(gè)體間差異[4]。因此，本研究將探討DPYD、MTHFR和GSTP1單核苷酸多態(tài)性是否可作為預(yù)測(cè)5-FU藥物化療療效評(píng)估、預(yù)后判斷的指標(biāo)，為晚期CRC的個(gè)體化化療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取荊門市第一人民醫(yī)院2017年11月～2019年4月收治的90例接受化療的CRC患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)的Ⅲ期、Ⅳ期(TNM分期)CRC；具有可測(cè)量的實(shí)體病灶；先前未進(jìn)行過(guò)姑息性治療或既往使用新輔助或輔助化療(不含5-FU類)的結(jié)束時(shí)間距本次疾病復(fù)發(fā)時(shí)間≥6個(gè)月；KPS評(píng)分≥60分；預(yù)計(jì)生存時(shí)間≥3個(gè)月；化療前血常規(guī)、肝功能、腎功能正常；年齡≥18歲。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.2 化療方法 所有患者接受以5-FU類藥物(氟尿嘧啶、卡培他濱和替加氟等)為基礎(chǔ)的化療方案(FOLFOX、CapeOX化療方案)進(jìn)行化療，其中FOLFOX方案(FOLFOX4方案26例、mFOLFOX6方案8例)34例、CapeOX方案56例。FOLFOX4：奧沙利鉑85 mg/m2第1天靜脈滴注2 h；亞葉酸鈣200 mg/m2第1天、第2天靜脈滴注；氟尿嘧啶400 mg/m2第1天、第2天靜脈推注，氟尿嘧啶600 mg/m2第1天、第2天22 h持續(xù)靜脈滴注，每2周重復(fù)。mFOLFOX6：奧沙利鉑85 mg/m2第1天靜脈滴注；亞葉酸鈣400 mg/m2第1天靜脈滴注；氟尿嘧啶400 mg/m2第1天靜脈推注，氟尿嘧啶1 200 mg/m2第1天、第2天22 h持續(xù)靜脈滴注，每2周重復(fù)。CapeOX：奧沙利鉑130 mg/m2第1天靜脈滴注大于2 h；卡培他濱：每次1 000 mg/m2，口服，每日2次，第1～14天，每3周重復(fù)。所有病例在化療3個(gè)周期后評(píng)價(jià)療效[5]。

1.3 療效評(píng)價(jià) 收集臨床資料并隨訪，評(píng)價(jià)化療療效及不良反應(yīng)。至少完成3個(gè)周期化療評(píng)價(jià)療效(腫瘤進(jìn)展除外)，行體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查和影像學(xué)檢查。按實(shí)體瘤療效標(biāo)準(zhǔn)(RECIST)分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)和進(jìn)展(PD)，以CR+PR為有效計(jì)算疾病控制率。不良反應(yīng)評(píng)價(jià)參照WHO(1981年)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 DPYD、MTHFR和GSTP1基因分型檢測(cè) 所有熒光染色原位雜交測(cè)序檢測(cè)試劑均由北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司購(gòu)買。應(yīng)用TL998A型熒光染色原位雜交測(cè)序檢測(cè)系統(tǒng)(微測(cè)序基因分析系統(tǒng)，西安天隆科技有限公司)，直接讀取血液白細(xì)胞中的目標(biāo)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。抽取2 mL靜脈血，置于EDTA抗凝管，上下顛倒混勻，再取100 μL加入事先配置好的NH4Cl預(yù)處理液離心管中，3 000 r/min離心5 min。吸走殘余液體，加入1 mL生理鹽水徹底重懸白細(xì)胞，然后室溫3 000 r/min離心5 min。將殘余液體吸干凈，向富集有白細(xì)胞的離心管中加入100 μL PHARM-GENE 01 SNP分析保存液，用移液器反復(fù)吹打混勻直至成透明無(wú)團(tuán)塊狀，室溫靜置20～30 min。各取1 μL經(jīng)上述流程處理后的白細(xì)胞樣本，分別加入到DPYD(rs3918290、rs55886062)、GSTP1(rs1695)、MTHFR(rs1801133、rs1801131) PHARM-GENE 200 SNP分析樣品處理試劑，震蕩混勻，短暫離心。將待檢測(cè)的樣品處理試劑按照相應(yīng)序號(hào)位置，置于實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀(TL998A型熒光染色原位雜交測(cè)序檢測(cè)儀)中，選擇檢測(cè)基因類型，開始檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件?；蛐头植加搔?檢驗(yàn)分析是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，以P>0.05視為符合Hardy-Weinberg平衡。患者的一般資料和CRC化療方案療效的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)；DPYD(rs3918290、rs55886062)、GSTP1(rs1695)、MTHFR(rs1801133、rs1801131)基因多態(tài)性與CRC化療方案療效的關(guān)系采用二元Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC患者DPYD、MTHFR和GSTP1基因多態(tài)性分布 入選的90例晚期CRC患者納入檢測(cè)，共檢測(cè)了DPYD(rs3918290、rs55886062)、GSTP1(rs1695)、MTHFR(rs1801133、rs1801131)3個(gè)基因共5個(gè)位點(diǎn)。其中DPYD(rs3918290、rs55886062)2個(gè)位點(diǎn)均為野生型，該樣本不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。GSTP1 rs1695基因型中AA型57例(63.3%)、AG型27例(30.0%)，GG型6例(6.7%)，等位基因A、G占比分別為78.3%、21.7%。MTHFR rs1801133基因型中CC型30例(33.3%)、TC型46例(51.1%)、TT型14例(15.6%)，等位基因C、T占比分別為58.9%、41.1%。MTHFR rs1801131基因型中AA型58例(64.4%)、AC型28例(31.1%)、CC型4例(4.4%)，等位基因A、C占比分別為80.0%、20.0%。經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，基因型GSTP1 rs1695(χ2=1.22，P>0.05)、MTHFR rs1801133(χ2=0.28，P>0.05)、MTHFR rs1801131(χ2=0.07，P>0.05)在這些人群中的分布符合遺傳平衡，沒(méi)有明顯偏離的分布，說(shuō)明該研究資料具有群體代表性。

2.2 DPYD、GSTP1、MTHFR基因多態(tài)性與CRC患者近期療效的關(guān)系 90例晚期CRC患者治療后CR、PR、SD、PD分別為4、32、31、24例，總有效36例，總有效率為40.0%?；颊咝詣e、年齡、TNM分期、腫塊部位、化療方案(FOLFOX4、mFOLFOX6、CapeOX)和化療療效均無(wú)明顯相關(guān)性(P均>0.05)，詳見(jiàn)表1。90例CRC患者中，GSTP1 rs1695 AG+GG基因型患者化療失敗的可能性是AA基因型的3.193倍(OR=3.193，95%CI:1.307～7.804，P<0.05)，MTHFR rs1801133 TC+TT基因型患者化療失敗的可能性是CC基因型的4.000倍(OR=4.000，95%CI:1.431～11.180，P<0.05)；攜帶MTHFR rs1801131 AA、AC+CC基因型患者化療后有效率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表2。

表1 以5-FU類為基礎(chǔ)化療晚期CRC 患者臨床病理特征與療效的關(guān)系(例)

表2 以5-FU類為基礎(chǔ)化療晚期CRC 患者GSTP1、MTHFR基因型與療效的關(guān)系[例(%)]

3 討論

5-FU類藥物是治療消化道腫瘤的基礎(chǔ)藥物，5-FU類藥物治療療效和耐受性方面存在個(gè)體差異的原因與其代謝相關(guān)的酶密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，約80%的5-FU類藥物進(jìn)入人體后在肝臟經(jīng)由DPD降解失活，DPD是5-FU類藥物代謝的限速酶。因此，DPD活性高低直接決定了5-FU類藥物進(jìn)入合成代謝和產(chǎn)生核苷酸類似物的量，進(jìn)而影響5-FU類藥物治療療效[6]。DPYD作為DPD的編碼基因，其基因的多態(tài)性可導(dǎo)致DPD的結(jié)構(gòu)及活性的變化，目前已證實(shí)的突變位點(diǎn)超過(guò)100個(gè)[7]，其中較為明確的與DPD缺陷相關(guān)的突變?yōu)橐韵聨讉€(gè)單核苷酸多態(tài)性：DPYD*2A(rs3918290)和DPYD*13(rs55886062)[8,9]。但本研究入選的90例晚期CRC患者，DPYD(rs3918290、rs55886062)2個(gè)位點(diǎn)均為野生型，不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，故未納入后續(xù)研究。DPYD*2A(rs3918290)的變異較多，而中國(guó)臺(tái)灣和日本的研究[10,11]與我們結(jié)果一致，表明國(guó)內(nèi)或亞洲人DPYD基因型的多態(tài)性極低，后期可擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

MTHFR是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，能將5,10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)并產(chǎn)生一個(gè)甲基基團(tuán)。甲基基團(tuán)是dTMP合成過(guò)程中的必需原料，同時(shí)參與5-FU類藥物在體內(nèi)代謝的活性代謝物FdUMP和TS形成“FdUMP-dTMP-TS酶”三聚體復(fù)合物過(guò)程，進(jìn)而抑制TS的生物活性，最終增強(qiáng)5-FU類藥物化療效果[12,13]。故MTHFR基因多態(tài)性與5-FU類藥物化療效果敏感性引起密切關(guān)注，其中研究最多也最常見(jiàn)的與MTHFR酶活性有關(guān)的基因多態(tài)性位點(diǎn)為MTHFR C677T(rs1801133)和A1298C(rs1801131)。本研究結(jié)果顯示MTHFR rs1801133基因多態(tài)性與CRC患者以5-FU類為基礎(chǔ)的化療療效有顯著相關(guān)性，此結(jié)果與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道一致[14,15]。但本研究發(fā)現(xiàn)MTHFR rs1801131基因多態(tài)性和療效無(wú)顯著相關(guān)性，這與部分報(bào)道[16]不一致，可能和本次樣本數(shù)量偏少以及患者的不同種族有關(guān)。

谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶是一種可溶性的二聚體同工酶，具有強(qiáng)有力的催化效應(yīng)，是體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要的Ⅱ相代謝酶之一。它的主要功能是催化Ⅰ相酶代謝的親電子基團(tuán)(包括多種化療藥物)與谷胱甘肽結(jié)合，使其成為水溶性物質(zhì)而排出體外，消除它的細(xì)胞毒性。其同工酶家族中GSTP1廣泛存在于人體腫瘤組織中，在人體上皮來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)率較高，其活性變化與惡性腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性相關(guān)[17,18]。研究表明，GSTP1參與5-Fu類和奧沙利鉑等多種化療藥物的解毒過(guò)程，故導(dǎo)致GSTP1活性下降的基因突變會(huì)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[19]。本研究結(jié)果顯示,90例晚期CRC患者中，攜帶GSTP1 rs1695 AG+GG基因型患者化療失敗的可能性是AA型的3.193倍，提示GSTP1 rs1695基因多態(tài)性與CRC患者以5-FU類為基礎(chǔ)的化療療效有顯著相關(guān)性，此結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道一致[20,21]。

綜上所述，晚期CRC患者中與5-FU類藥物(氟尿嘧啶、卡培他濱和替加氟等)代謝途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶基因(MTHFR、GSTP1)多態(tài)性與以5-FU類為基礎(chǔ)的化療療效有顯著相關(guān)性。結(jié)合本研究結(jié)果及既往的文獻(xiàn)報(bào)道，MTHFR rs1801133、GSTP1 rs1695基因多態(tài)性與CRC患者接受以5-FU類為基礎(chǔ)藥物化療的臨床療效具有顯著相關(guān)性。因此通過(guò)檢測(cè)MTHFR rs1801133、GSTP1 rs1695單核苷酸多態(tài)性有利于指導(dǎo)和預(yù)測(cè)CRC患者接受以5-FU類為基礎(chǔ)藥物化療的化療療效，為CRC患者的個(gè)體化治療提供依據(jù)。