系統(tǒng)性紅斑狼瘡血清外泌體miR-146a的表達(dá)及臨床意義*

李文根 劉蘇東 陳詠瑜 張 科 何雪春

1.梅州市人民醫(yī)院/中山大學(xué)附屬梅州醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，廣東 梅州 514031；2.梅州市人民醫(yī)院/中山大學(xué)附屬梅州醫(yī)院，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中心，廣東 梅州 514031

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種以血清中出現(xiàn)多種自身抗體、多系統(tǒng)受累為臨床特征的慢性自身免疫性疾病，目前發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前研究已證實(shí)，微小RNA(miRNA)參與SLE的發(fā)生發(fā)展[1]。外周血miRNAs的表達(dá)失調(diào)與SLE患者的臨床表現(xiàn)及臟器損害密切相關(guān)[2]。本研究通過檢測(cè)SLE患者血清外泌體miR-146a的表達(dá)水平，探討其在SLE的臨床意義。

1 資料和方法

1.1臨床資料

收集2018年1月至2018年8月38例初次確診為SLE患者的外周血，其中女性35例，男性3例，平均年齡(31.87±8.88)歲；所有病例均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修定的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)有無腎臟損害分為狼瘡性腎炎組(lupus nephritis,LN)和非LN組，其中狼瘡性腎炎17例，非狼瘡性腎炎21例，采用SLEDAI評(píng)分評(píng)估疾病活動(dòng)度。對(duì)照組為同期健康體檢者18例，其中女性16例，男性2例，平均年齡(29.44±5.48)歲。兩組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

按ExoQuick試劑操作說明，在250μl血清中加入ExoQuick試劑63μl混勻，4℃靜置30 min，1500×g 離心30min，管底可見沉淀物，100μl PBS重懸沉淀以備用。按Basic ExoRNA kit試劑說明書提取外泌體總RNA。700μl裂解緩沖液100μl加至外泌體重懸液后混勻，孵育5 min后加入140μl氯仿，震蕩30 s，然后在冰上孵育1分鐘后12000×g離心30 s，用15μl洗脫液洗脫柱上的總RNA。在提取前加入與人miRNAs無同源性的cel-miR-39外參照1μl (廣州銳博公司合成)。按照廣州銳博公司Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Starter Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，取5μl外泌體總RNA，以miR-146a的RT引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得miR-146a的cDNAs。逆轉(zhuǎn)錄的條件為37 ℃60 min，95 ℃5 min。然后以20μl反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)miR-146a的表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 min后，94℃15 s，55℃30 s，70 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。外參照cel-miR-39的檢測(cè)按照試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣品做2復(fù)孔。采用SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄每個(gè)孔中熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)(Ct值)。根據(jù)待測(cè)標(biāo)本的Ct值，以cel-miR-39作為外參，采用定量PCR中的相對(duì)定量法，用公式ΔCt來計(jì)算，其中ΔCt=Ct標(biāo)本miRNA-Ctcel-miR-39，ΔΔCt=ΔCt患者miRNA-Ct正常對(duì)照miRNA，以N=2-ΔΔCt表示外泌體miR-146a的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)，兩組間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)；采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析miR-146a的表達(dá)水平，miR-146a的表達(dá)水平與臨床參數(shù)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析miR-146a表達(dá)水平在LN診斷中的敏感性和特異性，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

SLE患者血清外泌體miR-146a的表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組(P=0.0015)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LN組miR-146a的表達(dá)水平略高于非LN組(P=0.067)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

A

B

在實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)方面，外泌體miR-146a表達(dá)水平與血沉及抗SSA抗體陽性率均呈負(fù)相關(guān)(分別為r=-0.370,P=0.022；r=-0.391,P=0.015)。miR-146a的表達(dá)水平與SLE患者的臨床表現(xiàn)、補(bǔ)體C3及C4、SLEDAI評(píng)分均無相關(guān)性，見表1。

ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-146a的表達(dá)水平對(duì)LN無臨床診斷價(jià)值，其AUC=0.367(95%CI:0.150～0.500,p=0.067)，見圖2。

圖2 ROC曲線分析血清外泌體miR-146a的表達(dá)水平在LN診斷中的敏感性和特異性。

表1 Spearman’s相關(guān)分析SLE患者外泌體miR-146a表達(dá)水平與臨床參數(shù)的相關(guān)性

注：*P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

miRNAs是一類非編碼的小分子RNA，其表達(dá)異常與自身免疫性疾病密切相關(guān)。外泌體是一種細(xì)胞分泌的大小為30～100納米的小膜囊，可從體液如血漿、血清、尿液等分離獲得。外泌體富含miRNAs，可參與炎癥反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，外周血中的miR-146a表達(dá)失調(diào)與SLE自身抗體的產(chǎn)生及臟器損害密切相關(guān)[1]。miR-146a可促進(jìn)淋巴細(xì)胞亞群分化，增加B細(xì)胞反應(yīng)性和自身抗體產(chǎn)生[4]。霉酚酸可使SLE患者T細(xì)胞的miR-146a表達(dá)上調(diào)[5]。這些研究結(jié)果提示miR-146a表達(dá)失調(diào)參與SLE的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，SLE患者血清外泌體miR-146的表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這與部分研究[6]結(jié)果相一致，但有研究發(fā)現(xiàn)外周血miR-146a表達(dá)上調(diào)[7]，Khoshmirsafa等[8]發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血miR-146a表達(dá)水平與健康對(duì)照組的不存在差異。血清miR-146a表達(dá)水平與SLE疾病活動(dòng)及尿蛋白存在負(fù)相關(guān)；LN患者的腎臟組織miR-146a 的表達(dá)顯著下降[9]；活動(dòng)性LN患者的尿外泌體miR-146a表達(dá)水平顯著升高，而且可以鑒別LN是否處于活動(dòng)，尿外泌體miR-146a可能是LN潛在的標(biāo)志物[10]。本研究發(fā)現(xiàn)外泌體miR-146a表達(dá)水平與臨床表現(xiàn)、尿蛋白及SLEDAI評(píng)分不存在相關(guān)性。ROC分析結(jié)果顯示外泌體miR-146a表達(dá)對(duì)LN無鑒別診斷意義。Sun等人通過meta分析發(fā)現(xiàn)外周血中miRN-146a可能不是SLE潛在的生物標(biāo)志物[6]。外周血miR-146a表達(dá)水平在SLE的意義有待深入研究。

綜上所述，本研究通過檢測(cè)SLE患者血清外泌體miR-146a的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)外泌體miR-146a的表達(dá)失調(diào)，而且與SLE的部分臨床特點(diǎn)密切相關(guān)，提示外泌體miR-146a可能參與SLE的發(fā)生發(fā)展。