連錢草活性成分的濁點(diǎn)萃取工藝優(yōu)化

周子軒 謝建開(kāi) 季澤濤 申奧 黃菊

摘? ?要：為優(yōu)化濁點(diǎn)萃取法提取連錢草中活性成分的工藝條件，以提取液對(duì)DPPH自由基清除率為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)預(yù)先確定各因素的適宜水平，再進(jìn)一步利用正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)工藝條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)料液比為1∶35，平衡時(shí)間為60 min，離子濃度為0.7 mol/L，表面活性劑質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)，連錢草活性成分的提取率最大，對(duì)DPPH自由基清除率為88.22%。

關(guān)鍵詞：濁點(diǎn)萃取;活性成分;連錢草;正交實(shí)驗(yàn)

連錢草屬于唇形科活血丹屬，分布區(qū)域廣泛，在全國(guó)各地都很常見(jiàn)。作為中醫(yī)主要藥材，通常用于民間醫(yī)學(xué)治療高尿酸血癥、風(fēng)濕病、痛風(fēng)、腎炎、腎結(jié)石、尿道炎和膀胱炎。從連錢草中提取得到的化學(xué)成分主要是黃酮及其苷類、萜類化合物[1]。目前，常用的天然植物提取方法包括水提法、有機(jī)溶劑提取以及超臨界萃取等，但各自都存在一定的缺點(diǎn)，如耗時(shí)長(zhǎng)、污染環(huán)境等，尤其是當(dāng)今社會(huì)對(duì)低污染的需求越來(lái)越大、重視程度越來(lái)越高，因此，選擇一種簡(jiǎn)單、高效、環(huán)境友好的提取方法對(duì)連錢草的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[2-3]。

濁點(diǎn)萃取法是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新興的液-液萃取技術(shù)，以中性表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點(diǎn)現(xiàn)象為基礎(chǔ)，改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)引發(fā)相分離，將疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)分離[4-5]。具有操作簡(jiǎn)單、提取率高、活性成分在提取過(guò)程中不易變性、不使用揮發(fā)性有機(jī)溶劑和環(huán)境友好等特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選用TritionX-110為表面活性劑進(jìn)行濁點(diǎn)萃取，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化提取工藝參數(shù)，考察表面活性劑質(zhì)量濃度、料液比、離子強(qiáng)度、溫度和平衡時(shí)間等對(duì)提取效果的影響，從而獲得連錢草活性成分提取的最佳工藝條件。

1? ? 實(shí)驗(yàn)部分

1.1? 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.1.1? 儀器

離心機(jī)H1850，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)T6，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;超聲波清洗機(jī)JP-040S，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司;電子天平JA2003，上海方瑞儀器有限公司;鼓風(fēng)干燥箱DHG-9070A，蘇州江東精密儀器有限公司。

1.1.2? 試劑

聚乙二醇鋅基苯基醚（TritionX-110），阿拉丁試劑公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），美國(guó)Sigma公司;無(wú)水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉和水楊酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2? 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 連錢草活性成分提取

連錢草烘干粉碎后過(guò)60目篩，稱取1 g粉末樣品，加入TritionX-110水溶液按一定料液比混合均勻，超聲30 min后放入高速離心機(jī)（8 000 r/s）中離心30 min，上層液體轉(zhuǎn)移至錐形瓶，加入適量氯化鈉，置于45 ℃水浴鍋中，出現(xiàn)分層，提取油性部分，加入15 mL無(wú)水乙醇，充分震蕩后放入離心機(jī)中離心5 min（6 000 r/s），上層液體倒入容量瓶中定容，待測(cè)。

1.2.2? DPPH自由基清除率測(cè)定

將連錢草活性成分提取液稀釋成最佳樣品質(zhì)量濃度，用移液槍準(zhǔn)確獲得待測(cè)樣品液2 mL，吸取濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液6 mL，轉(zhuǎn)到試管中，充分震蕩，在暗室低溫情況下靜放50 min，無(wú)水乙醇作參比液，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值為A1;把2 mL的無(wú)水乙醇加入到6 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液中，并測(cè)得其吸光度值為A0，把2 mL的無(wú)水乙醇加入到6 mL的待測(cè)樣品液中，測(cè)得其吸光度值為A2。DPPH自由基清除率（S）計(jì)算公式為：

S=

1.2.3? 單因素實(shí)驗(yàn)

選取對(duì)連錢草活性成分提取率影響較大的4個(gè)因素：料液比（表面活性劑溶液體積與連錢草粉末質(zhì)量之比，mL/g）、離子強(qiáng)度（氯化鈉的濃度，mol/L）、平衡時(shí)間（min）、表面活性劑質(zhì)量濃度（g/L），進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)從而確定各因素的適宜水平。

1.2.4? 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素選取3個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，如表1所示。

2? ? 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1? 平衡時(shí)間對(duì)DPPH清除率的影響

如圖1所示，當(dāng)平衡時(shí)間增加時(shí)，連錢草活性成分提取液的DPPH清除率急劇上升，從40 min開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的下降。因此，選定最優(yōu)平衡時(shí)間為40 min。

2.1.2? 料液比對(duì)清除率的影響

由圖2可知，當(dāng)料液比從1∶15到1∶55時(shí)，提取液的DPPH清除率先上升而后下降，在1∶35時(shí)達(dá)到峰值。這是因?yàn)殡S著液料比增大，提取溶劑越多，活性成分提取率就越大，這就使DPPH清除率提高，所以，濁點(diǎn)萃取的最優(yōu)料液比為1∶35。

2.1.3? 離子濃度對(duì)清除率的影響

由圖3可知，當(dāng)溶液的離子濃度從0.5 mol/L提高到0.6 mol/L時(shí)，連錢草活性成分提取液的DPPH清除率上升得非?？?，而當(dāng)離子濃度超過(guò)0.6 mol/L時(shí)，清除率便開(kāi)始緩慢下降。這是由于TritionX-110的聚集數(shù)隨著離子強(qiáng)度的增加而增加，TritionX-110對(duì)連錢草活性成分的增溶能力得到提高。同時(shí)，加入NaCl能改變非離子表面活性劑的濁點(diǎn)溫度。但是，如果NaCl溶液的濃度不斷地提高，溶液濃縮系數(shù)會(huì)不斷上升，當(dāng)達(dá)到一定值時(shí)，會(huì)導(dǎo)致萃取效率變化不明顯，此時(shí)，NaCl濃度的影響就不大，同時(shí)，考慮到成本的節(jié)約以及回收資源的問(wèn)題，最終選定NaCl濃度為0.6 mol/L。

2.1.4? 表面活性劑質(zhì)量濃度對(duì)活性成分提取效率的影響

由圖4可知，當(dāng)表面活性劑質(zhì)量濃度從20 g/L增加到40 g/L時(shí)，提取液的清除率都可達(dá)到一個(gè)較高的值。當(dāng)表面活性劑質(zhì)量濃度從40 g/L升到50 g/L時(shí)，對(duì)DPPH清除率下降。而當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)50 g/L時(shí)，又出現(xiàn)上升趨勢(shì)，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)表面活性劑質(zhì)量濃度達(dá)到一定值時(shí)，隨著其質(zhì)量濃度的增長(zhǎng)出現(xiàn)增溶等問(wèn)題。因此，TritionX-110的最佳質(zhì)量濃度為30 g/L。

2.2? 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

連錢草活性成分提取液的DPPH清除率正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析可知，料液比對(duì)連錢草活性成分提取物DPPH清除率的影響最大，平衡時(shí)間對(duì)清除率的影響緊隨其后，影響最小的是離子濃度。因此可得，影響連錢草活性成分提取物DPPH清除率的先后順序?yàn)锽>A>D>C，即料液比>平衡時(shí)間>表面活性劑的質(zhì)量濃度>離子濃度。分析k值可知，濁點(diǎn)萃取連錢草活性成分的最優(yōu)工藝條件為A3B2C2D3，即平衡時(shí)間60 min，料液比1∶35，離子濃度0.7 mol/L，表面活性劑（TritionX-110）的質(zhì)量濃度50 g/L。

按照最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，將提取液稀釋至40 g/L，通過(guò)使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量各組的DPPH清除率，分別為84.30%、88.73%和87.64%，其平均值為86.89%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為2.66%。可以確定此濁點(diǎn)萃取工藝可行。

3? ? 結(jié)語(yǔ)

利用濁點(diǎn)萃取工藝提取連錢草中的活性成分，以對(duì)DPPH自由基清除率為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了連錢草活性成分提取的最優(yōu)條件。

（1）各個(gè)因素對(duì)提取效率的影響強(qiáng)弱順序是：料液比>平衡時(shí)間>表面活性劑質(zhì)量濃度>離子濃度。連錢草活性成分的最優(yōu)提取工藝是：料液比1∶35，平衡時(shí)間60 min，表面活性劑質(zhì)量濃度50 g/L，離子濃度0.7 mol/L。驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)得出其清除率平均值為86.89%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.66%，在標(biāo)準(zhǔn)偏差之內(nèi)。

（2）濁點(diǎn)萃取法用于連錢草活性成分的提取是一種行之有效的方法，黃酮類活性成分可以被表面活性劑有效萃取，實(shí)驗(yàn)以純水為提取劑，不使用有機(jī)溶劑等揮發(fā)性物質(zhì)，成本低、無(wú)污染，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步表征提取物的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)。

[參考文獻(xiàn)]

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