穩(wěn)尿膠囊對(duì)大鼠膀胱過度活動(dòng)癥的治療作用及機(jī)制研究

王丹妮，張 宸，高賢嫻，洪 鐵,2*，王小龍

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，長春130021；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春130012；3.吉林省婦幼保健院，長春130061）

膀胱過度活動(dòng)癥（Overactive Bladder，OAB）是一種以尿急為主要特征的伴有尿頻、夜尿、可伴或不伴急迫性尿失禁的臨床常見泌尿系統(tǒng)疾病。在尿流動(dòng)力學(xué)上可表現(xiàn)為膀胱逼尿肌過度活動(dòng)，也可為其它形式的尿道與膀胱功能障礙。引起膀胱過度活動(dòng)的主要原因?yàn)榘螂壮隹诠Ｗ瑁˙ladder outlet obstruction，BOO），即膀胱頸和/或尿道由于多種原因引起的尿道縮窄導(dǎo)致排尿困難。目前還未能發(fā)現(xiàn)針對(duì)性治療膀胱過度活動(dòng)癥的藥物及療法，多以改善癥狀為主。穩(wěn)尿膠囊是吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院泌尿外科專家以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)根據(jù)長期臨床實(shí)踐總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方，對(duì)機(jī)體的泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)具有較好的調(diào)節(jié)作用，可用于治療具有膀胱過度活動(dòng)癥狀的泌尿系統(tǒng)疾病。在具有膀胱出口梗阻病變的一類疾病中，梗阻的發(fā)生部位絕大部分位于膀胱頸及近端尿道，例如男性良性前列腺增生癥、女性產(chǎn)后膀胱頸梗阻等。因此本研究選用結(jié)扎膀胱-近端尿道連接處的大鼠膀胱出口梗阻模型模擬人類膀胱過度活動(dòng)癥以研究穩(wěn)尿膠囊對(duì)膀胱過度活動(dòng)癥的治療作用。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD 大鼠，雌性，60只，體質(zhì)量220～240g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，將動(dòng)物于動(dòng)物室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，溫度為20～24℃，濕度為40%～70%，12h明暗交替照明，給予維持飼料，自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

酒石酸托特羅定片由山東魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn)；大鼠神經(jīng)生長因子（NGF）ELISA試劑盒由武漢默沙克生物科技有限公司生產(chǎn)；大鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供；丙二醛（MDA）測定試劑盒（TBA法）、總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（WST-1法）由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；科耐普計(jì)量智能型恒流泵，重慶科耐普蠕動(dòng)泵有限公司；全波長酶標(biāo)儀，Biotek公司；手持式高速勻漿機(jī)，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；BS124S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；3-18k低溫高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；XPX-9052 MBE數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立與分組給藥

將60只SD雌性大鼠，按體重隨機(jī)分為6組，正常對(duì)照組6只，膀胱梗阻模型（BOO）組14只，其余各給藥組各10只，分別為穩(wěn)尿膠囊高劑量組（5.4mg/kg），穩(wěn)尿膠囊中劑量組（2.7mg/kg），穩(wěn)尿膠囊低劑量組（1.35mg/kg），陽性對(duì)照托特羅定片（0.5mg/kg）組。大鼠分籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食飲水。

大鼠行膀胱梗阻手術(shù)模擬大鼠膀胱過度活動(dòng)癥。腹腔注射10%水合氯醛 （0.3ml/100g）對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，麻醉成功后仰臥位固定大鼠于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，消毒腹部及會(huì)陰部，取硬膜外麻醉導(dǎo)管自制導(dǎo)尿管經(jīng)尿道插入膀胱并固定，用以支撐尿道。沿骨盆趾骨上緣做下腹部正中切口，逐層剪開皮膚、腹直肌層及腹膜，推開覆蓋的子宮和附著的脂肪，顯露膀胱，沿膀胱向下，稍分離筋膜顯露膀胱頸及近端尿道，手術(shù)彎針帶4-0絲線穿過膀胱頸周圍韌帶，在靠近膀胱頸-近端尿道處進(jìn)行結(jié)扎，絲線結(jié)扎力度以能滑動(dòng)尿道中導(dǎo)管并帶動(dòng)周圍組織為度。以上操作均為同一術(shù)者實(shí)施。假手術(shù)組采用相同術(shù)式但不做結(jié)扎處理，其余操作相同。結(jié)扎后移除導(dǎo)尿管，逐層縫合下腹部切口，局部用碘伏消毒后，腹腔內(nèi)注射青霉素80萬U/只，大鼠保持體溫，完全復(fù)蘇后放回籠中。術(shù)后3天大鼠給予同等劑量青霉素抗感染，早晚各一次，并觀察大鼠下腹部傷口和排出尿液情況。術(shù)后第4天開始給藥，給藥組按組別灌胃給予不同濃度受試藥，每日1次連續(xù)6周，假手術(shù)組及BOO組灌胃給予同等體積蒸餾水。

2.2 觀測指標(biāo)

2.2.1 大鼠一般狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠一般狀態(tài)，包括體重、排尿情況、毛發(fā)、精神狀態(tài)等。

2.2.2 大鼠尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測定

末次給藥2h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰臥位固定大鼠，消毒腹部及會(huì)陰部，沿腹部原創(chuàng)口位置做一切口，完全暴露膀胱，將膀胱頸周圍脂肪、增生組織分離，將膀胱口-近端尿道結(jié)扎線拆除，經(jīng)尿道口插入導(dǎo)尿管導(dǎo)出膀胱內(nèi)尿液。用鑷子輕提膀胱頂端，眼科剪在頂端做一小孔，將兩根PE-50軟管（內(nèi)徑0.58mm外徑0.96mm）經(jīng)小孔插入膀胱內(nèi)部約5mm深，固定軟管，軟管1連接壓力換能器后連接BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，軟管2連接蠕動(dòng)泵，排凈系統(tǒng)內(nèi)殘留空氣后調(diào)零，輕壓膀胱排出多余尿液，將此時(shí)的膀胱壓力調(diào)至基線。系統(tǒng)穩(wěn)定后，膀胱灌注溫生理鹽水（灌注速度為0.1ml/min），看見有尿液流出立即停止灌注，記錄尿流動(dòng)力學(xué)波形圖及排尿點(diǎn)壓PT（mmHg）、排尿壓峰值 MP（mmHg）。至少記錄 3 個(gè)排尿周期。

收集排出尿液稱量體積UV（ml），測定結(jié)束時(shí)導(dǎo)尿管連接注射器將膀胱中殘余尿液吸出，記錄剩余尿量 RV（ml），計(jì)算膀胱容量 TUV（ml）:

TUV(ml)=UV(ml)+RV(ml)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取大鼠膀胱組織，稱重記錄膀胱濕重（mg），計(jì)算膀胱指數(shù)：

膀胱指數(shù) （%）=膀胱濕重 （mg）/大鼠體重（g）x100%

2.2.3 大鼠尿液中NGF含量測定

大鼠尿液靜置1h后離心分離上清，離心條件4℃下，4000r/min，10 min，-80℃凍存?zhèn)溆?。采?ELISA 法嚴(yán)格按照說明書的指導(dǎo)測定大鼠尿液中神經(jīng)生長因子NGF的含量變化。

2.2.4 大鼠膀胱組織中SOD、MDA、IL-1β的含量測定

取大鼠膀胱組織，液氮速凍后轉(zhuǎn)-80℃凍存?zhèn)溆?。取適量膀胱組織，加入冰生理鹽水，置于冰浴中用組織勻漿器制成膀胱組織勻漿，離心取上清液，離心條件4℃下，3500 r/min，10 min。 取適量上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書的要求測定膀胱組織上清液中IL-1β含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的要求測定膀胱組織上清液中SOD、MDA含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行。根據(jù)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)資料的正態(tài)性和方差齊性，各組數(shù)據(jù)均用x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)比較差異的顯著性。P＜0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀況及膀胱形態(tài)變化

建立模型早期大鼠進(jìn)食量稍減，體重稍減，后期恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察各組大鼠膀胱形態(tài)，假手術(shù)組膀胱大小正常，表面略粉色，觸之有彈性；BOO組膀胱明顯增大，表面被膜充血，顏色較深，觸之較硬，膀胱壁明顯增厚，留存尿液增多。其余各給藥組膀胱形態(tài)有不同程度恢復(fù)。

（上圖為膀胱出口梗阻大鼠膀胱形態(tài)變化示意圖）

3.2 大鼠尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果

假手術(shù)組大鼠膀胱充盈期呈低壓狀態(tài)，排尿期膀胱壓升高隨排尿活動(dòng)進(jìn)行而逐漸降低，具有規(guī)律的尿流動(dòng)力學(xué)波形；與假手術(shù)組相比，BOO組大鼠膀胱充盈期出現(xiàn)逼尿肌不穩(wěn)定收縮，收縮頻率明顯增高，形成不規(guī)則的鋸齒狀圖形；與BOO組相比各濃度給藥組波形有不同程度的改善，其中穩(wěn)尿膠囊高劑量組與陽性藥組更接近于假手術(shù)組尿流動(dòng)力學(xué)波形，詳見圖1。與假手術(shù)組相比，BOO組大鼠排尿點(diǎn)壓力MP升高、排尿壓峰值PT升高、膀胱剩余尿量RV增多、排除尿量UV減少、膀胱容量TUV減?。ㄎ戳谐觯螂诐裰卦黾樱ㄎ戳谐觯?、膀胱指數(shù)升高，均有顯著性差異（P＜0.01）；與BOO組相比，穩(wěn)尿膠囊高劑量組和陽性對(duì)照組可降低PT、MP，使RV減少UV增加，降低膀胱重量及膀胱指數(shù)，均具有顯著性差異（P＜0.01）。尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果見表1。

圖1 穩(wěn)尿膠囊對(duì)BOO大鼠尿流動(dòng)力學(xué)影響結(jié)果

表1 穩(wěn)尿膠囊對(duì)BOO大鼠尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及膀胱指數(shù)的影響結(jié)果（x±s）

3.3 大鼠體內(nèi)NGF、SOD、MDA、IL-1β含量測定結(jié)果

與假手術(shù)組相比，BOO組大鼠尿液NGF含量顯著增加（P＜0.01），膀胱組織上清液中 MDA、IL-1β 含量增加 （P＜0.05，P＜0.01），SOD 含量顯著減少 （P＜0.01）；與BOO組相比，穩(wěn)尿膠囊高劑量組和陽性對(duì)照組大鼠尿液NGF含量顯著降低，膀胱組織上清液中 MDA、IL-1β 含量降低（P＜0.01，P＜0.05），SOD 含量顯著升高（P＜0.01），結(jié)果見表 2。

表2 穩(wěn)尿膠囊對(duì)BOO大鼠大鼠體內(nèi)各因子含量的測定結(jié)果（x±s）

4 討論

膀胱過度活動(dòng)癥（overactive bladder，OAB）是由膀胱逼尿肌的過度活動(dòng)引起的以尿頻、尿急、尿不盡為主要癥狀的的常見泌尿外科疾病，引起OAB的原因多為下尿路梗阻、膀胱持續(xù)處于刺激狀態(tài)及膀胱-尿道炎癥等[1]。OAB患者膀胱逼尿肌的過度活動(dòng)會(huì)導(dǎo)致膀胱頻繁無規(guī)律性收縮，使膀胱喪失儲(chǔ)尿功能，頻繁引起尿意，并且可隨著患病時(shí)間增長而引起其他尿道—膀胱功能障礙，提示下尿路梗阻是引起逼尿肌不穩(wěn)定的主要原因。膀胱出口梗阻 (Bladder outlet obstruction，BOO)可引起膀胱組織結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為膀胱增大肥厚失去彈性使順應(yīng)性降低，導(dǎo)致排尿期壓力降低，使尿液潴留而導(dǎo)致下尿路梗阻和膀胱持續(xù)刺激癥狀。本文采用大鼠BOO模型模擬梗阻后膀胱的異常變化，常用于模擬人類OAB膀胱病變過程。

尿液中神經(jīng)生長因子 （nerve growth factor，NGF）的含量測定是近年來臨床研究最多的無創(chuàng)診斷OAB的方法，有望替代尿流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測以快速診斷OAB。已有許多研究顯示NGF直接參與OAB發(fā)病過程及癥狀表現(xiàn)[2]。尿液NGF主要由膀胱上皮細(xì)胞表達(dá)。許多研究表明OAB患者尿液中NGF表達(dá)升高[3～4]，在膀胱平滑肌和黏膜組織中分泌明顯增加[5]。本實(shí)驗(yàn)中大鼠尿液NGF的表達(dá)升高提示膀胱處于過度活動(dòng)狀態(tài)，可作為判斷實(shí)驗(yàn)性O(shè)AB模型成功的指標(biāo)。白細(xì)胞介素-1β是常見的致炎因子，已有研究表明膀胱炎癥反應(yīng)和IL-1β是BOO引起膀胱逼尿肌過度活動(dòng)的核心通路，已被證實(shí)IL-1β可直接刺激膀胱逼尿肌，介導(dǎo)膀胱炎癥反應(yīng)[6]。BOO發(fā)生后膀胱會(huì)進(jìn)行周期性缺血-再灌注，產(chǎn)生很多氧化應(yīng)激因子造成膀胱黏膜損傷，這些氧化應(yīng)激因子可與脂質(zhì)反應(yīng)生成大量過氧化產(chǎn)物丙二醛附著于膀胱黏膜表面使粘膜通透性增加。超氧化物歧化酶是抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，可清除氧自由基，調(diào)節(jié)膀胱內(nèi)氧化應(yīng)激因子含量，降低BOO引起的膀胱缺血-再灌注損傷。已有研究證實(shí)兔膀胱發(fā)生BOO后，膀胱MDA含量增加、SOD活性降低[7]。

穩(wěn)尿膠囊是根據(jù)多年治療OAB及具有BOO癥狀的泌尿道疾病的臨床經(jīng)驗(yàn)而總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方，具有利尿排毒、益氣固本的作用。組方中的君藥黃芪作為利水藥材多用于治療膀胱過度活動(dòng)癥[8]，具有補(bǔ)氣固表，托毒排膿，利尿生肌的作用，也常用來治療自汗水腫、慢性腎炎蛋白尿、糖尿病等疾病。已有研究表明，黃芪可改善逼尿肌不穩(wěn)定大鼠下尿路癥狀[9]，抑制體外膀胱逼尿肌收縮頻率和張力[10]。綜上，穩(wěn)尿膠囊可能通過改善尿流動(dòng)力學(xué)、抑制NGF表達(dá)、抑制膀胱炎癥及氧化-應(yīng)激反應(yīng)等治療膀胱過度活動(dòng)癥，其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。