茶樹組織培養(yǎng)常見問題研究進(jìn)展

李解　唐敏　翟秀明　侯渝嘉

摘? ?要? ?與其他植物組織培養(yǎng)的快速發(fā)展相比，茶樹組織培養(yǎng)至今仍未建立完善的高頻再生體系，究其原因，主要是茶樹組織培養(yǎng)過程中常會(huì)出現(xiàn)褐變、黃化、玻璃苗、畸形、污染等問題?；诖?，綜述了目前茶樹組織培養(yǎng)中的常見問題及其防治措施，并展望了茶樹組培的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

關(guān)鍵詞? ?茶樹;組織培養(yǎng);褐化;超度含水態(tài)

中圖分類號(hào)：S571.1? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.7.014

在茶樹種質(zhì)資源保存、新品種選育及種性改良等方面，茶樹組培技術(shù)具有打破種屬界限、克服遠(yuǎn)緣雜交不親和等問題的優(yōu)勢(shì)。茶樹組培技術(shù)從最初的以幼莖材料研究離體咖啡堿的合成[1]，到以茶樹子葉、花藥為材料誘導(dǎo)分化獲得再生植株[2-3]，再到目前以不同器官為外植體獲得植株[4-7]，其技術(shù)取得了顯著提高。茶樹為多年生木本植物，生長(zhǎng)速度慢，增殖率、成苗率較低，在組培工作中常會(huì)出現(xiàn)褐變、黃化、玻璃苗、畸形胚、污染等問題，這既影響組培實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，也阻礙了組培快繁技術(shù)的應(yīng)用。為此，本文就目前茶樹組織培養(yǎng)應(yīng)用過程中的常見問題及其防治措施進(jìn)行綜述，旨在為茶樹組培技術(shù)優(yōu)化、茶樹新品種選育及種質(zhì)資源保存等方面的研究提供參考。

1 茶樹組培中的褐化問題

1.1 外植體的選擇與切割方式

茶樹為木本植物，其植物體內(nèi)多酚類物質(zhì)含量較高，外界物理?yè)p傷破碎細(xì)胞后，酚類物質(zhì)開始發(fā)生氧化作用，導(dǎo)致茶樹外植體在組培過程中褐化現(xiàn)象顯著。因此，茶樹外植體的選擇與切割方式會(huì)直接影響外植體褐化程度。有研究表明，茶樹外植體褐化程度一般隨著材料的嫩度、組織木質(zhì)化程度的提高及外植體受傷害程度的增加而加深。黃皓等[8]在誘導(dǎo)茶樹愈傷組織選擇外植體研究中發(fā)現(xiàn)，隨著材料嫩度的降低（茶樹莖段→葉片→種子），外植體褐化程度降低而誘導(dǎo)率增高。黃燕芬等[9]在3種橫切方式對(duì)外植體褐變和腋芽萌動(dòng)生長(zhǎng)影響研究表明，腋芽葉片橫切后保留2/5與保留1/2、保留整個(gè)帶腋芽葉片相比，腋芽萌動(dòng)生長(zhǎng)狀況最好，褐化程度居中。張志蘭[10]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過消毒的山茶花莖段外植體剪去一段莖段接入培養(yǎng)基，會(huì)一定程度上降低褐化現(xiàn)象，表明盡量縮短外植體傷口與氧的接觸時(shí)間能夠較大程度地減少褐化危害。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

植物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類較多，如MS、N6等，因各類培養(yǎng)基內(nèi)所含成分不同，其組培褐變程度影響也有差異。目前茶樹組培中最常見的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，具有無(wú)機(jī)鹽含量高、微量元素豐富等特點(diǎn);但有研究者通過提高培養(yǎng)基內(nèi)無(wú)機(jī)鹽含量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，伴隨無(wú)機(jī)鹽濃度的增加，多酚類物質(zhì)的產(chǎn)生加快，外植體褐變程度加重[11]。成浩等[12]在研究大量元素對(duì)于莖段生長(zhǎng)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基大量元素減半能夠很好的降低莖段的褐變程度，同時(shí)也促進(jìn)了莖段的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。趙瑋[13]就鐵鹽濃度對(duì)于茶樹組培中茶樹莖段與愈傷組織的影響研究結(jié)果表明：培養(yǎng)基內(nèi)鐵鹽濃度的加大，二者褐化程度都逐漸增高，其中以對(duì)照組與0.25倍鐵鹽濃度褐變程度較低，而以生長(zhǎng)表現(xiàn)來說，0.5倍鐵鹽在茶樹組培過程中表現(xiàn)最好。

1.3 消毒時(shí)間及方式

目前，植物組培過程中滅菌劑與消毒方式的選擇較多，茶樹組培中常用的滅菌劑為酒精、升汞、次氯酸鈉等，通常選擇70%～75%酒精和0.1%～0.2%升汞進(jìn)行外植體消毒。有研究表明，通過加長(zhǎng)外植體消毒時(shí)間，能都達(dá)到更好的消毒效果，但褐變程度會(huì)加重[14];因此，在茶樹組培過程中能夠?qū)⑽廴韭屎秃只识冀档偷降退奖容^困難，同時(shí)證明，通過控制消毒時(shí)間來降低外植體褐變程度的操作較為困難。也有研究認(rèn)為，外植體消毒后清洗不徹底是導(dǎo)致其褐變程度嚴(yán)重的原因之一，姚永宏[15]在研究不同滅菌方式對(duì)褐化程度的影響研究中發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)比不同的滅菌方式其褐變程度差異不顯著，但在清洗方式上，磁力攬拌清洗方式的褐變程度顯著低于手搖和靜止的清洗方式。

1.4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

植物組培中常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑主要包括生長(zhǎng)素類（2，4-D、IBA等）、細(xì)胞分裂素（6-BA、KT等）、脫落酸（ABA）、GA3等。闕生全等[16]在生長(zhǎng)素類調(diào)節(jié)劑對(duì)于外植體誘導(dǎo)生長(zhǎng)及褐化影響的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高濃度的2，4-D會(huì)刺激外植體褐化時(shí)間提早，褐化率增高，褐變程度加深，導(dǎo)致外植體死亡，同時(shí)也會(huì)降低愈傷組織的誘導(dǎo)率。黃燕芬等[9]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度6-BA對(duì)于外植體褐變程度影響不同，在高濃度6-BA條件下的外植體褐化率極顯著高于低濃度，同時(shí)發(fā)現(xiàn)低濃度條件下的6-BA不僅褐變反應(yīng)慢，更適宜外植體莖尖的分化生長(zhǎng)。此外，秦廷豪等[17]研究發(fā)現(xiàn)通過含不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基交替培養(yǎng)可降低繼代培養(yǎng)中的多酚危害。

1.5 抗氧化劑和吸附劑的應(yīng)用

植物組培過程中不同抗氧化劑和吸附劑的使用也不同程度地影響外植體褐化。目前，茶樹組培中常見的抗氧化劑和吸附劑有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、活性炭（AC）、抗壞血酸（VC）等。張亞萍等[18]通過對(duì)比浸泡與沒有浸泡過VC的莖段、芽尖的褐變程度發(fā)現(xiàn)，浸泡過VC的莖段、芽尖的褐化程度都明顯降低。闕生全等在研究各種配比抗氧化劑和吸附劑培養(yǎng)基對(duì)于外植體褐化影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在控制褐變效果上，以添加吸附劑（AC和PVP）的控制效果最好，在添加抗氧化劑的培養(yǎng)基中表現(xiàn)為褐變程度較為嚴(yán)重，其中以添加Na2S2O3最為嚴(yán)重。然而就外植體愈傷組織生長(zhǎng)勢(shì)來看，添加VC的培養(yǎng)基要優(yōu)于添加吸附劑的培養(yǎng)基。因此，在培養(yǎng)基中添加少量適宜濃度的抗氧化劑和吸附劑，可以在控制褐變反應(yīng)的同時(shí)促進(jìn)外植體生長(zhǎng)。

2 茶樹組培中的黃化、畸形問題

2.1 培養(yǎng)基中礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不均衡

培養(yǎng)基中礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不均衡、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比不當(dāng)、瓶?jī)?nèi)乙稀等次生代謝物含量增高、光照不足、溫度不適等因素都可能導(dǎo)致茶樹組培苗黃化、畸形現(xiàn)象的產(chǎn)生。有研究表明，N、S、Mg、Fe、Mn、Cu、B、Zn是植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，植物正常生長(zhǎng)發(fā)育過程中，當(dāng)某一種元素缺失表現(xiàn)為不足時(shí)，其他元素會(huì)因最低因子律的制約導(dǎo)致其含量再多也無(wú)法發(fā)揮作用，植物本身出現(xiàn)失綠癥[19]。主要表現(xiàn)為：N缺乏，葉色變淡，乃至黃色，植株矮小，瘦弱;S缺乏，新葉失綠黃化;Mg缺乏，中下部葉脈間失綠黃化;缺Mn，茶樹葉片發(fā)黃，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)褐斑、干枯脫落;缺B、Zn，節(jié)間縮短，葉片失綠畸變，有簇生現(xiàn)象，生長(zhǎng)緩慢;缺Cu，葉片細(xì)胞失去膨壓呈萎凋狀態(tài)，葉薄色淺，嚴(yán)重時(shí)全株大量落葉;缺Fe，頂芽淡黃，嫩葉花白色，嚴(yán)重時(shí)葉片呈白色、枯死[20]。姚元濤等[21]在山東棕壤茶園幼齡茶樹葉片黃化病因診斷與防治的研究中發(fā)現(xiàn)，Mn、Cu、Zn在茶樹葉片葉綠素形成過程中表現(xiàn)為某些酶的活化劑，是葉片中葉綠素含量高低和葉綠體結(jié)構(gòu)完整性的重要調(diào)節(jié)元素。黃萍等[22]在4種因子對(duì)于馬鈴薯莖尖培養(yǎng)黃化影響的研究中發(fā)現(xiàn)，Mg、N、Fe在適宜濃度條件下都具有顯著抑制黃化苗發(fā)生的作用，但濃度過高或過低的Mg和N會(huì)導(dǎo)致黃化率的增高，而在高濃度下Fe鹽會(huì)顯著降低黃化苗的發(fā)生。

2.2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比不當(dāng)

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是組織培養(yǎng)中非常關(guān)鍵的一類成分，需要根據(jù)培養(yǎng)目標(biāo)給予適合的配比，過高或過低均會(huì)影響組培苗的生長(zhǎng)。史俊等[23]研究表明，在低生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平下，碧云茶樹組培苗生長(zhǎng)勢(shì)較好、葉色深綠，但隨著生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的提高，組培苗葉片開始發(fā)黃、生長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?，?yán)重時(shí)出現(xiàn)死亡。黃華艷等[24]研究表明，通過交替使用不同高低濃度的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素，組培苗的生長(zhǎng)效果更顯著。而張文珠等[25]在麗格海棠的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，交替使用最適培養(yǎng)基與無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑MS培養(yǎng)基相較于一直使用同一種培養(yǎng)進(jìn)行繼代培養(yǎng)，組培苗生長(zhǎng)勢(shì)更好。

2.3 乙烯等次生代謝物含量增高

乙烯是培養(yǎng)物在密閉環(huán)境中進(jìn)行生理代謝活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生與積累，對(duì)植物組織的影響有利有弊，其負(fù)面影響包括抑制芽的分化、阻礙植物成長(zhǎng)和促進(jìn)老化[26]。華智銳等[27]在研究不同濃度活性炭與黃芩組培苗黃化現(xiàn)象的關(guān)系實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，通過在培養(yǎng)基加入活性炭能夠顯著降低黃芩組培苗黃化率，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，當(dāng)培養(yǎng)基中活性炭含量由0.5 g·L-1提高到1g·L-1時(shí)，黃芩組培黃化率降低幅度最大，為30%下降到9%。研究者認(rèn)為活性炭作為吸附劑，能夠有效地吸附黃芩組培苗生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的乙烯等代謝產(chǎn)物，從而平衡培養(yǎng)基中各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，穩(wěn)定pH值，保障了組培苗的正常生長(zhǎng)。

2.4 類菌原體

植原體，原稱類菌原體，為單細(xì)胞原核生物，無(wú)細(xì)胞壁，由生物膜包圍，專性寄生于植物的韌皮部篩管系統(tǒng)[28]，可引起植物病害，如枝葉簇生成團(tuán)，似茶樹缺鋅癥狀，黃化，新生葉細(xì)小硬化，節(jié)間縮短，花器變態(tài)，生長(zhǎng)衰退甚至枯死等，且篩管內(nèi)往往有多量愈傷組織增生[29]。與黃化病有關(guān)的植原體最早在美國(guó)翠菊植株上發(fā)現(xiàn)的[30]。在茶樹上，植物菌原體黃化病害于早年在云南省保山茶區(qū)發(fā)現(xiàn)[31]。目前，對(duì)于該病害的防治，還未發(fā)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)保的藥物。

3 超度含水態(tài)

植物組織培養(yǎng)過程中，組培苗會(huì)出現(xiàn)矮小膨脹失去綠色、新梢或葉片表現(xiàn)為透明或半透明狀、葉片質(zhì)脆而卷曲的生長(zhǎng)異?，F(xiàn)象，這種試管苗生長(zhǎng)異?，F(xiàn)象為組培苗“玻璃化”，于1981年Debergh首次命名[32]，1990年改用“超度含水態(tài)”。該現(xiàn)象是植物組培過程中的一種特有的生理失調(diào)或生理病變，由培養(yǎng)條件中的多種因素相互作用導(dǎo)致組培苗細(xì)胞內(nèi)新陳代謝紊亂所致。這些生長(zhǎng)異常的組培苗，一般光合能力與酶活性都較低，器官功能不全，組織畸形，難以增殖分化、生根成苗，通常不會(huì)選擇作為繼代培養(yǎng)和擴(kuò)繁的材料[33]。

玻璃苗的發(fā)生與培養(yǎng)基中的瓊脂和蔗糖濃度偏低、離子種類或濃度不當(dāng)、以及培養(yǎng)溫濕度和光照等有關(guān)。張燕玲等[34]在絲石竹的玻璃化現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一定濃度條件下，絲石竹組培苗的玻璃化率與蔗糖含量呈負(fù)相關(guān)，培養(yǎng)基中蔗糖含量的增加會(huì)降低絲石竹組培苗玻璃化的發(fā)生。而龔明霞等[35]也在洋桔梗玻璃化苗的研究中發(fā)現(xiàn)，通過在培養(yǎng)基中加入適宜濃度的蔗糖能夠促進(jìn)洋桔梗組培苗玻璃化性狀的恢復(fù)。因此，為降低植物組培中玻璃化苗的產(chǎn)生，可從外植體選擇和培養(yǎng)基選擇，增加瓊脂、蔗糖用量及Zn2+、Ca2+等離子濃度等方面著手。

4 展望

茶樹組培在茶樹種質(zhì)資源保存、新品種的選育及種性改良等研究方面具有重要作用。今后茶樹組培的研究工作，需要加強(qiáng)各類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的調(diào)控作用研究，完善對(duì)珍稀茶樹資源的離體保存，豐富茶樹種質(zhì)資源，重點(diǎn)研究開發(fā)茶樹組培與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合的新方法，設(shè)計(jì)建立更優(yōu)的茶樹組培苗轉(zhuǎn)化體系技術(shù)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)移，最終培育出具有特、異、優(yōu)性狀的茶樹新品種。

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（責(zé)任編輯：敬廷桃）

收稿日期：2019-11-30

作者簡(jiǎn)介：李解（1991—），男，重慶墊江人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事茶樹育種?！鶠橥ㄐ抛髡撸珽-mail： 617393574@qq.com。