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    幽門螺桿菌毒力蛋白cagA基因敲除突變株構(gòu)建及鑒定*

    2020-05-06 01:35:12李抄陳定宇張曉怡趙艷王琴容周建獎(jiǎng)謝淵
    關(guān)鍵詞:原代同源基因組

    李抄,陳定宇,張曉怡,趙艷,王琴容,周建獎(jiǎng),謝淵

    (貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550004)

    胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤。據(jù)2018年全球流行病學(xué)資料顯示,全球胃癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第6位,死亡率居第5位;在中國(guó),胃癌的發(fā)病率和死亡率分別占全部腫瘤的第4位和第2位[1-2]。胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)方面,主要包括宿主遺傳學(xué)、環(huán)境因素和幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)感染[3]。Hp是一種螺旋狀革蘭陰性微需氧菌,它定殖在人類的胃黏膜上皮,是引起胃炎、消化性潰瘍、胃癌的主要病因。Hp的發(fā)現(xiàn)加深了人類對(duì)慢性感染、炎癥和癌癥之間關(guān)系的認(rèn)知,1994年世界衛(wèi)生組織將Hp列為 I 類致癌因子[4-5]。全世界有近半數(shù)人感染Hp,但僅少數(shù)會(huì)發(fā)展成胃癌,究其原因,除宿主與環(huán)境因素外,HpcagA毒力表達(dá)是導(dǎo)致其感染后不同臨床結(jié)局的可能原因[6]。細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白(cytotoxin associated gene A,cagA )是由HpcagA致病島編碼的一種120~145 kDa的蛋白質(zhì),通過IV型分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion system,TFSS)注入胃上皮細(xì)胞,參與胃癌的發(fā)生發(fā)展,是目前所知的唯一被Hp注入胃上皮細(xì)胞并能模擬細(xì)胞內(nèi)蛋白發(fā)揮作用的“癌蛋白”(oncoprotein),但其致癌機(jī)制還不完全清楚[7-9]?;虼虬?gene targeting)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù),是利用基因轉(zhuǎn)移方法將外源DNA序列導(dǎo)入靶細(xì)胞后,通過外源DNA 序列與靶細(xì)胞內(nèi)染色體上同源DNA序列間的重組,將外源DNA定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn),或?qū)δ骋活A(yù)先確定的靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變,從而改變細(xì)胞遺傳特性的方法[10-11]。目前基因打靶技術(shù)已應(yīng)用在改造生物、培育新的生物品種,研究基因結(jié)構(gòu)與功能、表達(dá)與調(diào)控,研究細(xì)胞生活周期調(diào)控機(jī)制,遺傳病的基因治療等多方面。為進(jìn)一步明確cagA在Hp致胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用,本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用基因打靶技術(shù)構(gòu)建敲除cagA基因的Hp突變株,為后續(xù)研究cagA致病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料、主要試劑及儀器

    1.1.1材料 pACYC184質(zhì)粒、pUCmT載體及細(xì)菌DNA提取試劑盒(上海生工生物公司),幽門螺桿菌HP1004及胃癌原代細(xì)胞(貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存)。

    1.1.2主要試劑和儀器 雙抗(美國(guó) HyClone公司),改良型RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Gibco 公司),氯霉素(chloramphenicol,Cm,中國(guó) Beyotime公司),哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(英國(guó)Oxoid公司),Taq DNA聚合酶和T4 DNA ligase(日本TAKARA公司),anti-cagAantibody和anti-GAPDHantibody(美國(guó)CST公司);電轉(zhuǎn)化儀Electroporator 2510(中國(guó) Eppendorf),全制動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析儀(中國(guó) 上海天能科技公司);Primer5.0設(shè)計(jì)引物合成于上海生工,見表1。

    1.2 方法

    1.2.1cagA基因的上、下游同源重組臂擴(kuò)增 高保真PCR酶從Hp基因組上擴(kuò)增cagA基因的上、下游同源重組臂,反應(yīng)體系為50 μL[Hp基因組DNA 0.5 μL、10×pfu buffer 5 μL、dNTP(2.5×10-2mol/L) 0.5 μL、cagA-5F/3F及cagA-5R/3R (5×10-6mol/L)各0.5 μL,pfu DNA polymerase(5×10-3U/L) 0.5 μL,DMSO(5%) 2.5 μL,ddH2O補(bǔ)足體積];聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)循環(huán)程序?yàn)?5 ℃、5 min,95 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、60 s,5個(gè)循環(huán),72 ℃延伸7 min。

    表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

    1.2.2Cm的表達(dá)框序列擴(kuò)增 從pACYC184質(zhì)粒上擴(kuò)增Cm的表達(dá)框序列,Cm抗性基因的擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL:pACYC184質(zhì)粒DNA 0.5 μL,10×pfu buffer 5 μL,dNTP(2.5×10-2mol/L) 0.5 μL,cagA-Cm-F和cagA-Cm-R (5×10-6mol/L)各0.5 μL,pfu DNA polymerase(5×10-6U/L) 0.5 μL,ddH2O 補(bǔ)足;PCR循環(huán)程序同方法1.2.1。

    1.2.3融合PCR構(gòu)建打靶片段cagA基因上、下游同源重組臂經(jīng)設(shè)計(jì)與Cm抗性基因序列有部分重疊,可通過PCR直接融合,獲得全長(zhǎng)的打靶片段。反應(yīng)總體系100 μL:上、下游同源重組臂PCR產(chǎn)物、Cm抗性基因PCR產(chǎn)物、5%DMSO各5 μL,10×pfu buffer 10 μL、dNTP(2.5×10-2mol/L)、cagA-5F、cagA-3R (5×10-6mol/L)及pfu DNA polymerase(5×10-6U/L)各1 μL,dH2O補(bǔ)足;PCR循環(huán)程序同方法1.2.1,循環(huán)數(shù)為25次。

    1.2.4打靶載體(pUCmT-ΔcagA::Cm)的構(gòu)建 在打靶片段PCR產(chǎn)物中直接加入Taq DNA聚合酶(5×10-6U/L),于72 ℃反應(yīng)30 min電泳并切膠純化后與然后與50 mg/L pUCmT載體進(jìn)行連接反應(yīng),反應(yīng)體系10 μL:pUCmT(5×107ng/L) 2 μL,打靶片段(5×107ng/L) 6 μL,10×T4 buffer 1 μL,T4 DNA ligase(5×10-6U/L) 1 μL;16 ℃反應(yīng)過夜。

    1.2.5打靶載體的電轉(zhuǎn)化 取4 mL液體培養(yǎng)(布氏肉湯加10%胎牛血清)的Hp分裝于2 mL無菌Ep管中,4 ℃、6 000 r/min離心5 min收集菌體;等體積無菌去離子水輕柔吹打洗滌,4 ℃、6 000 r/min離心5 min收集菌體,相同方法重復(fù)洗滌1次;用100 μL無菌10%甘油輕柔懸浮菌體,取40 μL分裝在預(yù)冷的0.5 mL無菌Ep管中即可用作電轉(zhuǎn)化細(xì)胞。取500 ng預(yù)冷的打靶質(zhì)粒加入40 μL新鮮制備的電轉(zhuǎn)化細(xì)胞,4 ℃放置2 min,轉(zhuǎn)移入2 mm Eppendorf電擊轉(zhuǎn)化杯,迅速放入電轉(zhuǎn)化儀,2 500 V電壓下電擊轉(zhuǎn)化;加入Hp培養(yǎng)液1 mL懸浮菌體,轉(zhuǎn)入50 mL無菌尖底離心管,加入液體培養(yǎng)基5 mL,2.5 L厭氧罐內(nèi)37 ℃、100 r/min震蕩培養(yǎng)過夜。

    1.2.6cagA基因敲除菌株Hp/ΔcagA::Cm的篩選 吸取500 μL打靶載體電轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接5 mL液體培養(yǎng)液(含Cm 2×10-2μg/L),于上述同樣培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)3~4 d,直至培養(yǎng)液渾濁;取微量渾濁培養(yǎng)液劃線接種固體培養(yǎng)基(Karmali培養(yǎng)基,加10%脫纖維綿羊血和2×10-2μg/L Cm),于微需氧厭氧罐內(nèi)培養(yǎng)至單克隆形成。

    1.2.7cagA基因敲除菌株Hp/ΔcagA::Cm的PCR鑒定 隨機(jī)挑選若干陽(yáng)性克隆,分別接種3 mL布氏肉湯(含10%胎牛血清),厭氧罐條件下37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至菌體明顯渾濁,取少量菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增;用cagA外側(cè)引物擴(kuò)增時(shí),如cagA基因未被替換,PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為5 014 bp;而打靶載體替換成功時(shí),產(chǎn)物長(zhǎng)度則縮短為2 150 bp;反應(yīng)體系50 μL:基因組DNA 0.5 μL,10×TaqPlus buffer 5 μL,dNTP(2.5×10-2mol/L) 0.5 μL,cagA-outF及cagA-outR(5×10-6mol/L)各0.5 μL,5% DMSO 2.5 μL,Taq Plus DNA polymerase(5×10-6U/L) 0.5 μL及ddH2O 補(bǔ)足;PCR循環(huán)程序同方法1.2.1,循環(huán)數(shù)為35次,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

    1.2.8原代胃癌細(xì)胞培養(yǎng)及Hp/ΔcagA::Cm、Hp/cagA感染原代胃癌細(xì)胞 按1.0×106/孔細(xì)胞數(shù)量接種于含DMEM完全培養(yǎng)基(10% FBS)6孔板中,37 ℃的 5%CO2孵育箱常規(guī)培養(yǎng),感染前將6孔板中換成無雙抗含Gibco血清培養(yǎng)基;Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA培養(yǎng)3 d,感染復(fù)數(shù)(mutiplicity of infection,MOI) 30 ∶1的比例分別感染原代胃癌細(xì)胞,24 h后倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),并分別收集各組細(xì)胞,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

    1.2.9Western blot檢測(cè)原代胃癌細(xì)胞內(nèi)cagA存在 按全蛋白提取試劑盒進(jìn)行細(xì)胞全蛋白提取,按BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量,10%PAGE分離蛋白,上樣蛋白體積20 μL,電泳,濕轉(zhuǎn)PVDF膜,5% 脫脂牛奶封閉,4 ℃孵育cagA一抗(1 ∶1 000/4 000)過夜,二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h,TBST清洗3次,按化學(xué)發(fā)光底物試劑盒進(jìn)行反應(yīng),利用熒光凝膠成像系統(tǒng)曝光、顯影及分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,Graphpad Prism 7.0軟件繪圖,組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 融合PCR構(gòu)建打靶片段鑒定

    cagA基因上、下游同源重組臂經(jīng)設(shè)計(jì)與Cm抗性基因序列有部分重疊,可通過PCR直接融合,獲得全長(zhǎng)的打靶片段,長(zhǎng)度為1 794 bp,見圖1。

    注:1為打靶片段,M為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照(DNA Maker)。圖1 打靶片段融合PCR結(jié)果Fig.1 Target fragment fusion PCR map

    2.2 Hp/ΔcagA::Cm突變株P(guān)CR鑒定

    PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果顯示,Hp/ΔcagA::Cm陽(yáng)性克隆擴(kuò)增產(chǎn)物為2 150 bp,野生型Hp/cagA菌株擴(kuò)增產(chǎn)物為5 014 bp,表明成功獲得Hp/ΔcagA::Cm敲出突變菌株,見圖2。

    注:1為野生Hp/cagA菌株,2為 Hp/ΔcagA::Cm突變株,M 為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖2 Hp/ΔcagA::Cm突變株P(guān)CR鑒定結(jié)果Fig.2 Hp/ΔcagA::Cm mutant PCR identification map

    2.3 Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染的原代胃癌細(xì)胞形態(tài)

    Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA分別感染3株胃癌原代細(xì)胞,24 h后熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變,可見感染野生型Hp/cagA的原代胃癌細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞形態(tài)改變,由鈍圓變?yōu)殚L(zhǎng)梭形、紡錘形、不規(guī)則形,細(xì)胞死亡數(shù)量多,感染Hp/ΔcagA::Cm突變株的細(xì)胞形態(tài)改變較小,死亡細(xì)胞數(shù)量少,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),見圖3。

    注:A為Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染3株胃癌原代細(xì)胞,B為細(xì)胞數(shù)量的直條圖;(1)與WZKHp/cagA,YHDHp/cagA組比較,P<0.01;(2)與HZMHp/cagA組比較,P<0.05。圖3 Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染細(xì)胞形態(tài)改變 (100×)Fig.3 Hp/ΔcagA::Cm and Hp/cagA infected cell morphology changes (100×)

    2.4 原代胃癌細(xì)胞內(nèi)cagA蛋白表達(dá)

    Western blot檢測(cè)cagA蛋白(分子量135 kDa)表達(dá)情況,結(jié)果表明野生型Hp/cagA菌株及其感染3株原代細(xì)胞內(nèi)cagA蛋白表達(dá)水平較Hp/ΔcagA::Cm突變型菌株及其感染3株原代細(xì)胞明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖4。

    注:A為Western blot檢測(cè)cagA蛋白條帶,B為cagA蛋白表達(dá)量的條圖;(1)與HZMHp/ΔcagA::Cm組比較,P<0.01;(2)與WZKHp/ΔcagA::Cm組比較,P<0.01;(3)與YHDHp/ΔcagA::Cm組比較,P<0.01;(4)與Hp/ΔcagA::Cm組比較,P<0.01。圖4 細(xì)菌及其感染細(xì)胞內(nèi)cagA 表達(dá)情況Fig.4 CagA expression in bacteria and infected cells

    3 討論

    全球約50%人口存在Hp感染,多數(shù)感染患者為無癥狀胃炎,少數(shù)發(fā)展為萎縮性胃炎甚至胃癌[12]。cagA是HP感染引起炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)蛋白,被Hp注入胃上皮細(xì)胞的cagA發(fā)生磷酸化,磷酸化的cagA和Scr同源區(qū)2結(jié)合激活Scr同源區(qū)的磷酸化酶活性,從而引起瀑布式的級(jí)聯(lián)反應(yīng);通過干擾細(xì)胞信息傳導(dǎo)通路引起組織嚴(yán)重的炎癥損傷,參與胃癌的形成過程[13]。cagA可引起胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡紊亂[14]。臨床檢出的Hp包括cagA陽(yáng)性和cagA陰性2種類型;cagA陽(yáng)性Hp感染患者發(fā)生胃癌的風(fēng)險(xiǎn)高于cagA陰性者[15]?,F(xiàn)有研究認(rèn)為cagA與Hp引起疾病的嚴(yán)重程度相關(guān);Hp/cagA+菌株可引起更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),更容易引起胃萎縮和胃腺癌的發(fā)生,是Hp/cagA-菌株的2.0~28.4倍[16-17];因此cagA在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。為了更好地研究Hp中cagA蛋白的致病功能,通過基因打靶的同源重組原理構(gòu)建了HpΔcagA基因缺失突變株,為系統(tǒng)研究cagA基因功能創(chuàng)造了條件,也為進(jìn)一步闡明Hp致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    基因打靶是分析基因功能的重要技術(shù),用于定位功能基因,研究模式生物和一些重要微生物的全基因組功能,被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)的研究領(lǐng)域[18]?;虼虬屑夹g(shù)以同源重組為理論基礎(chǔ),同源重組機(jī)制在原核和真核生物中普遍存在,是保證物種遺傳信息穩(wěn)定性和多樣性的一種重要機(jī)制[19]。有研究發(fā)現(xiàn),新的遺傳物質(zhì)可以通過同源重組引人生物細(xì)胞的基因組,井對(duì)基因進(jìn)行特異性修飾和改造[20-22];也有研究報(bào)道,構(gòu)建出了cagA全基因缺失的Hpylori突變株[23-24],本研究利用高保真PCR酶從Hp基因組上擴(kuò)增cagA基因的上、下游同源重組手臂;從pACYC184質(zhì)粒上擴(kuò)增Cm表達(dá)框序列。通過融合PCR技術(shù)獲得cagA基因敲除用的打靶片段(上游同源手臂-氯霉素抗性基因-下游同源手臂),將其克隆入通用載體pUCmT,獲得打靶載體pUCmT-ΔcagA::Cm。然后通過電轉(zhuǎn)化,將pUCmT-ΔcagA::Cm質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)入Hp,在抗生素壓力的幫助下,打靶片段和菌體基因組發(fā)生同源重組,通過氯霉素抗性篩選得到帶有抗性標(biāo)記的重組菌,隨后因突變載體不能在Hp1004菌體內(nèi)生長(zhǎng)復(fù)制而丟失。

    檢測(cè)突變株Hp/ΔcagA::Cm是否還存cagA基因或蛋白,是最后認(rèn)證cagA基因缺失突變株構(gòu)建成功與否的關(guān)鍵。本研究對(duì)Hp/ΔcagA::Cm突變型菌株和野生型Hp/cagA菌株的基因組進(jìn)行了PCR鑒定,用cagA外側(cè)引物擴(kuò)增時(shí),野生株可以擴(kuò)出完整的cagA基因和非編碼序列的長(zhǎng)約5 014 bp,而cagA缺失突變株cagA基因被打靶載體替換,產(chǎn)物長(zhǎng)度則縮短為2 150 bp。另外本研究用Hp/ΔcagA::Cm突變型菌株和野生型Hp/cagA菌株感染原代胃癌細(xì)胞,Western blot實(shí)驗(yàn)均能從野生型Hp/cagA菌株及其感染細(xì)胞檢出cagA蛋白,而Hp/ΔcagA::Cm突變型菌株及其感染細(xì)胞內(nèi)均不能檢出cagA蛋白,從而在蛋白水平上證實(shí)了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,表明本次cagA缺失突變株Hp/ΔcagA::Cm構(gòu)建成功。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)感染野生型Hp/cagA的原代胃癌細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞形態(tài)改變,由鈍圓變?yōu)殚L(zhǎng)梭形、紡錘形及不規(guī)則形,細(xì)胞死亡數(shù)量多,而感染Hp/ΔcagA::Cm突變株的細(xì)胞形態(tài)改變較小、死亡細(xì)胞數(shù)量少;這進(jìn)一步證實(shí)cagA被Hp注入細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞有一定的毒性作用。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了Hp/ΔcagA::Cm突變株,并在感染細(xì)胞中成功驗(yàn)證,且證實(shí)cagA蛋白對(duì)細(xì)胞有一定的毒性作用,為進(jìn)一步研究Hp中cagA基因的功能,闡明其在Hp致病中的地位及作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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