嚙齒類動物插管技術(shù)用于藥動學(xué)采血的研究進展

杜飛飛，王鳳清，賈偉偉，徐方，馬越鳴

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203； 2. 中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203)

近幾十年來，跨越國界的科學(xué)合作和服務(wù)呈現(xiàn)不斷增長的趨勢，給全球范圍的研究合作方提出要求，即以動物福利為核心，在全球范圍內(nèi)整合協(xié)調(diào)實驗動物的使用標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，被業(yè)界廣泛接受的“3R原則”便是其中的核心內(nèi)容。“3R原則”由Russell和Burch于1959年提出，即替代(replacement)、減少(reduction)和優(yōu)化(refinement)，簡言之即通過使用無知覺物質(zhì)替代有知覺動物、盡量減少實驗動物數(shù)量及盡量減低非人道方法的使用頻率或危害程度，旨在鼓勵和提倡從多角度多層面保護實驗動物的福利[1-2]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)、國際醫(yī)學(xué)科學(xué)組織(CIOMS)和國際實驗動物科學(xué)理事會(ICLAS)均發(fā)布了國際指導(dǎo)原則[3-4]，將“3R原則”作為核心標(biāo)準(zhǔn)和準(zhǔn)則。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和歐盟強力推薦在有AAALAC認(rèn)證的實驗室開展動物實驗，該認(rèn)證采用了包括“OIE標(biāo)準(zhǔn)”在內(nèi)的4個全球評估標(biāo)準(zhǔn)[5-7]作為參考來源。

我國于1988年經(jīng)國務(wù)院批準(zhǔn)由國家科學(xué)技術(shù)委員會發(fā)布了《實驗動物管理條例》[8]，以加強實驗動物的管理工作，并于2001年的修訂中加入了有關(guān)動物福利的內(nèi)容。2006年由科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》[9]則是我國首個針對研究用動物的國家法規(guī)，進一步細(xì)化了善待實驗動物的規(guī)定。2018年2月由國家正式頒布并于9月1日實施的《實驗動物福利倫理審查指南》(GB/T 35892-2018)則是我國實驗動物福利倫理科技和管理領(lǐng)域的里程碑事件。該指南由實驗動物福利倫理專業(yè)委員會起草，是中國首部實驗動物福利倫理審查國家標(biāo)準(zhǔn)，在國際上獲得了積極的反響和贊譽[10-11]。

藥物代謝動力學(xué)研究中包含必不可少的動物實驗，在嚙齒類動物(如大鼠和小鼠)上采血則是其中常見的實驗操作。如何在動物實驗中貫徹動物福利及“3R原則”是本專業(yè)發(fā)展到一定階段和水平需要思考和關(guān)注的問題。本文對國內(nèi)外藥動學(xué)研究中將嚙齒類動物插管手術(shù)用于采血的技術(shù)進展進行綜述，希望對國內(nèi)藥動學(xué)研究領(lǐng)域的實驗動物福利保護有所助力。

1 藥代動力學(xué)研究中傳統(tǒng)的采血方法

藥代動力學(xué)研究是藥物發(fā)現(xiàn)過程中的一個重要組成部分?？紤]到嚙齒類動物體重較小而不需要花費大量的藥物且較容易采集多個生物樣本，通常選擇大鼠或小鼠等嚙齒類動物作為臨床前藥動學(xué)研究的主要實驗對象[12]。

采集動物血樣是藥動學(xué)研究中最常見的操作之一，關(guān)于進行大小鼠采血的方法已有較多報道，包括從眼眶后靜脈竇、側(cè)尾靜脈、舌下靜脈、隱靜脈及頜下靜脈[13]。長期以來最常用的是眼眶后靜脈竇穿刺采血，經(jīng)驗豐富的實驗人員可以單次采集較大量的血液(0.2 ～ 0.5 mL)。然而該方法也引起較大爭議，除了可能造成動物眼部組織損傷外，非麻醉狀態(tài)下采血引起的動物疼痛、掙扎及應(yīng)激也不利于實驗動物福利[14-15]，因此部分監(jiān)管機構(gòu)已經(jīng)禁止了該方法，除非該采血過程是動物處于麻醉狀態(tài)下的臨終前步驟[16]。側(cè)尾靜脈切開是另一種在過去被頻繁使用的方法，優(yōu)點是不需要麻醉且手術(shù)刀沿著血管側(cè)切造成的創(chuàng)傷小，但這種方法也有較多缺點，如采血量較少(0.1 ～ 0.15 mL)、在深色小鼠上較難操作、經(jīng)常需要對尾部進行預(yù)熱以確保血管擴張獲得足夠的血量以及采集單個血點耗時較長，同樣非麻醉下操作會給動物帶來疼痛及應(yīng)激。舌下靜脈采血的優(yōu)勢是采血量大而組織損傷較少，但操作相對復(fù)雜，需要約束動物、更多的練習(xí)和多人配合工作，并且有報道采血部位會出現(xiàn)紅腫[17]。隱靜脈穿刺較為耗時，無法滿足在短時間內(nèi)取血的要求。頜下靜脈采血雖然耗時少取血量較大，但需要約束動物自由并且造成較多組織損傷[13]。

以上采血方式在涉及動物福利方面都有缺陷，會造成實驗動物的“緊張”，即刺激引起實驗動物出現(xiàn)生理、心理狀態(tài)和行為的變化。實驗過程中的溫度變化、籠具移動、過度噪音以及約束自由都可能是潛在的刺激源[17]，如采血時捉持動物造成的緊張會改變胃排空時間、加快心率以及改變代謝，均會影響藥代動力學(xué)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。實驗動物面對刺激時產(chǎn)生反應(yīng)的個體差異更是藥動學(xué)研究中的一個不可控因素[12]。

2 運用于藥動學(xué)采血的插管技術(shù)

自上世紀(jì)八十年代起，針對大小鼠不同部位血管的插管手術(shù)技術(shù)相繼被開發(fā)，最為常見的插管部位包括頸動靜脈、股動靜脈及腹主動脈等。這些手術(shù)模型具備一個顯著優(yōu)點，就是在進行采血過程中，實驗動物保持清醒并可以自由活動，從而使它們受到的干擾或刺激降到最小[18-21]，如Yoburn等[22]發(fā)現(xiàn)大鼠股動脈插管可以增加插管的通暢度，相比其他部位插管手術(shù)，動物恢復(fù)到術(shù)前體重的速度最快。許多研究者都公開了插管手術(shù)的具體方法和流程[23-26]，有使用留置型插管以便多次連續(xù)的血樣采集[18-21,23,27-29]，也有研究者將血管插管引出并固定在實驗動物體外，實驗動物在采集血樣過程中無需麻醉、可自由活動且沒有創(chuàng)傷，顯然滿足可重復(fù)采血且較少限制自由的要求[18,30]。研究表明，與徒手捉持大鼠(30 s)和限制自由的綁定大鼠(5 min)相比，自由活動大鼠(頸靜脈插管)血漿內(nèi)腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺的基礎(chǔ)濃度更低[31]。大鼠血漿中皮質(zhì)酮水平同樣會在其被限制自由時升高，而經(jīng)歷頸靜脈插管手術(shù)后逐漸恢復(fù)穩(wěn)定[32]。

Jespersen等[33]用視頻及插圖的形式展示了大鼠股動脈及股靜脈插管的過程。研究者將插管尾端連接到可旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)上，術(shù)后單籠飼養(yǎng)大鼠可以減少動物間相互干擾，提高動物模型的穩(wěn)定性。為了保持插管的通暢，需要使用100 U/mL肝素化生理鹽水作為封管液并對其進行日常保養(yǎng)。研究者認(rèn)為通過精細(xì)的無菌手術(shù)過程、合適的手術(shù)插管材料和精心保養(yǎng)，是極有可能在較長時間(幾周)里保持大鼠健康狀態(tài)，長時間的采集血樣也就更有保證。Feng等[34]以視頻方式發(fā)表了大鼠頸動脈和頸靜脈插管手術(shù)流程，可用于監(jiān)測血壓、輸液和給藥及連續(xù)采集血樣。Tsai等[35]則設(shè)計了一種高效且成本低廉的大鼠頸靜脈插管裝置，術(shù)后大鼠可多只飼養(yǎng)，與單籠飼養(yǎng)大鼠相比，具有更好的活力和更多的日均體重增長。Ghali發(fā)表了用于大鼠股動脈及股靜脈插管的微創(chuàng)手術(shù)過程[36]。

Bardelmeijer等[37]開發(fā)并驗證了一種能在自由活動小鼠上連續(xù)采集血樣的方法。研究者將插管前端經(jīng)頸靜脈直達右心房，尾端經(jīng)皮下穿刺牽引至小鼠頸后部穿出，用絲線縫合固定在皮膚上，插管體外部分用帶有金屬彈簧的PVC套管保護。單個時間點可采集250 μL血樣并且小鼠受到的外部干擾很小。對6只頸靜脈插管小鼠靜脈注射10 mg/kg抗腫瘤藥物多西他賽后，將測得的血漿濃度-時間曲線與同樣劑量的50只非插管小鼠經(jīng)心臟穿刺取血后所測的結(jié)果進行比較，兩者無顯著差異，證明該方法在多西他賽的藥動學(xué)研究中可以有效替代傳統(tǒng)采血方法，大幅減少小鼠數(shù)量。

國內(nèi)研究者不斷學(xué)習(xí)國外先進技術(shù)，摸索和建立符合自身條件的動物實驗技術(shù)和方法。包倫等[38]建立了在大鼠股動脈和股靜脈插管的模型，并應(yīng)用于促紅細(xì)胞生成素和白細(xì)胞介素6的藥動學(xué)研究，結(jié)果證明注射簡單準(zhǔn)確，采血方便可控，大鼠自由清醒。研究者詳細(xì)介紹了手術(shù)的流程、大鼠術(shù)后的維護以及保證實驗順利的重要因素，值得國內(nèi)同行學(xué)習(xí)借鑒。王晶晶等[39]為解決藥代動力學(xué)實驗中反復(fù)靜脈給藥和取血的操作問題，建立大鼠頸靜脈插管方法。此法簡便易行、對動物損傷小且大大提高實驗人員的取血效率。代恒等[40]利用臨床常見的硬膜外麻醉導(dǎo)管和輸液器部件制作簡便實用的大鼠頸動脈插管，通過改進皮下留置導(dǎo)管和改變抓取大鼠的用力方式，有效避免操作不當(dāng)導(dǎo)致的插管模型失敗。史宏博等[41]借鑒前人的經(jīng)驗，在不同種系小鼠上成功建立經(jīng)顯微外科手術(shù)進行股動脈和股靜脈插管的模型，可在小鼠清醒和自由活動狀態(tài)下進行給藥、采血和血壓等體征的監(jiān)測。該文詳細(xì)介紹了手術(shù)流程并附圖說明以供同行借鑒。竇全林等[42]則利用自制的動脈插管建立了小鼠頸動脈插管模型，具有操作簡便、創(chuàng)傷小、動物存活率高、插管穩(wěn)定性強和術(shù)后不易感染的優(yōu)點。文科等[43]建立的大鼠股動脈插管手術(shù)模型，則通過連接三通閥實現(xiàn)連續(xù)采血同時監(jiān)控血壓。宋文煜等[44]發(fā)現(xiàn)小鼠右側(cè)頸橫靜脈與肩胛上靜脈匯入點之間為最佳插管前端位置，可大幅度提高小鼠術(shù)后存活率和導(dǎo)管通暢率。

3 藥動學(xué)采血技術(shù)的應(yīng)用

研究者將建立并優(yōu)化的插管技術(shù)，運用到各自藥代研究中，在保護動物福利的同時獲取更準(zhǔn)確合理的實驗結(jié)果。

(1)Baumann和Huestis的研究團隊[45-46]開展MDMA(常見濫用藥，俗稱搖頭丸，對人類具有神經(jīng)毒性)在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究。大鼠經(jīng)皮下注射不同劑量 MDMA，頸靜脈插管采集血樣中MDMA及其代謝物MDA的濃度與劑量呈非線性急劇增加，存在蓄積的可能，該結(jié)果與人體藥動學(xué)數(shù)據(jù)相似，可在合適的臨床劑量使用時作為參考。

(2)Xie等[47]研究了大鼠單次靜脈注射放射性標(biāo)記的二氫青蒿素(DHA)后的藥代動力學(xué)、組織分布、消除和質(zhì)量平衡。大鼠經(jīng)頸靜脈插管后接入自動采血儀。結(jié)果顯示大鼠腦中[14C]總濃度是血漿中的2倍，表明放射性物質(zhì)可以輕易穿透血腦屏障。紅細(xì)胞放射活性分布比血漿中高3 ～ 4倍，表明DHA在治療血液期瘧疾的強大效果可能與此相關(guān)。

(3)Minocha等[48]研究Sutherlandia(SLD，一種非洲草藥補充劑，南非衛(wèi)生部推薦用于治療艾滋病)在頸靜脈插管大鼠體內(nèi)短期和長期的暴露對抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物奈韋拉平(NVP)口服生物利用度和藥動學(xué)研究的影響。短期同服SLD后NVP的藥代動力學(xué)相關(guān)參數(shù)無顯著差異，而長期同服后NVP的體內(nèi)暴露則減少50%。體外誘導(dǎo)實驗結(jié)果顯示SLD能導(dǎo)致細(xì)胞色素氧化酶CYP3A4的mRNA表達水平和功能活性的升高。NVP與SLD長期合并使用時可能發(fā)生的潛在草藥與藥物相互作用，需要臨床研究結(jié)果的進一步證實。

(4)Legette等[49]研究啤酒花中膳食類黃酮Xanthohumol(XN，具有抗氧化、抗菌抗炎、保護心血管和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的潛在作用)的藥代動力學(xué)。頸靜脈插管大鼠灌胃給藥不同劑量XN，其在大鼠血中暴露與劑量有相關(guān)性，可用于預(yù)測穩(wěn)態(tài)血漿濃度水平，并幫助確定臨床研究用藥方案。該研究團隊還利用頸靜脈插管技術(shù)開展了雌馬酚(Equol)的代謝研究，雌馬酚是大豆異黃酮苷元經(jīng)小腸細(xì)菌作用產(chǎn)生的代謝物，對減輕更年期骨質(zhì)流失有潛在的治療效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌馬酚在卵巢切除模型大鼠體內(nèi)以葡萄糖醛酸結(jié)合物的形式為主(>90%)[50]。

(5)Gong等[51]在普通大鼠和易激腸合并癥模型大鼠上比較口服給藥黃連提取物后小檗堿和巴馬汀的藥動學(xué)。檢測頸靜脈插管采集血樣中小檗堿和巴馬汀的濃度后發(fā)現(xiàn)，二者在模型大鼠體內(nèi)的暴露明顯高于普通大鼠，均出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，可能與模型大鼠的腸功能異常有關(guān)。

(6)Shaik等[52]開展評價17-hydroxyprogesterone(17-OHPC，預(yù)防早產(chǎn))替代制劑的使用和替代給藥途徑的可行性。分別對頸靜脈插管的雌性大鼠靜注、肌注及灌胃自配溶液或肌注市售油劑。結(jié)果顯示，靜注或肌注自配溶液后，17-OHPC的平均半衰期約為11 h，后者生物利用度接近100%，而灌胃后的生物利用度不到3%。肌注市售油劑后17-OHPC體內(nèi)濃度雖相對較低，但持續(xù)時間較長，生物利用度接近100%，這跟油劑在給藥部位緩慢但持續(xù)的吸收有關(guān)。該結(jié)果側(cè)面證實了目前有早產(chǎn)史婦女預(yù)防早產(chǎn)的唯一治療選擇是每周肌注一次市售油劑。

(7)Lee等[53]通過使用頸靜脈插管大鼠驗證了化合物IDP-73152(韓國已批準(zhǔn)臨床用于治療革蘭氏陽性菌引起的感染)的定量檢測方法，證明其可滿足非臨床藥代研究的需要。

(8)Linnik等[54]用頸靜脈插管大鼠評估有無同位素標(biāo)記煙酰胺的大鼠藥動學(xué)差異，結(jié)果顯示兩者在臨床劑量范圍內(nèi)無顯著差異，為臨床使用同位素標(biāo)記煙酰胺作為MRI試劑提供數(shù)據(jù)支持。

以上藥代研究均采用了大鼠頸靜脈插管技術(shù)，這也是專業(yè)領(lǐng)域內(nèi)接受度最廣的技術(shù)方式，但也有研究者采用其他部位插管技術(shù)以滿足自身科研需要。例如Kielbasa和Fung[55]研究吸入性亞硝酸異丁酯(ISBN，揮發(fā)性有機亞硝酸鹽，治療心血管疾病，易于引起藥物濫用)在大鼠體內(nèi)的濃度-藥效關(guān)系，同時監(jiān)測血壓和心率。大鼠持續(xù)1 h吸入濃度范圍在20 ～ 1200 ppm的ISBN，股動脈插管采集血中的ISBN濃度在吸入期間達到相對穩(wěn)態(tài)且與吸入濃度成線性相關(guān)。吸入結(jié)束后，血壓和心率很快恢復(fù)，沒有撤藥后的反彈效應(yīng)。該結(jié)果對于了解該揮發(fā)性藥物的性質(zhì)、治療特點甚至減少藥物濫用都有所幫助。

近年來，有研究者開始關(guān)注插管技術(shù)中的細(xì)節(jié)對實驗動物的狀態(tài)乃至藥代研究結(jié)果造成的影響。Teilmann等[56]發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)頸動脈插管手術(shù)并接入自動采血儀器后會引起體內(nèi)IL-6水平的增高，并且會引發(fā)心、肝、腎及唾液腺的炎癥及器官損害。Gaud等[57]發(fā)現(xiàn)logP值大的化合物可能與插管材料存在非特異性吸附，其研究結(jié)果暗示靜注給藥和采血共用同一根大鼠頸靜脈插管可能導(dǎo)致藥動學(xué)研究結(jié)果的偏差，并建議可通過雙插管解決問題。Luca等[58]證明枸櫞酸鈉溶液替代肝素鈉溶液作為封管溶液時會有揮發(fā)現(xiàn)象，從而增加模型失敗率。研究者通過使用硝化纖維素防腐涂層增強插管尾端的密閉性，極大提高了模型的穩(wěn)定性。Chen等[59]比較了心內(nèi)注射和灌胃給藥8種化合物后，分別經(jīng)大鼠頸動脈插管和尾靜脈取血后測得藥物濃度-時間曲線下面積(AUC)，結(jié)果顯示非酸性化合物的AUC差別較大，頸動脈插管取血后測得的AUC遠(yuǎn)高于尾靜脈取血，且差異程度與該化合物的分布容積(VD)呈正相關(guān)。

4 小結(jié)

本人所在實驗室經(jīng)過多年摸索，建立起大鼠股動靜脈插管技術(shù)平臺，并成功運用于多個中藥多成分藥代課題的研究[60-65]，結(jié)合本文文獻內(nèi)容及自身使用經(jīng)驗，現(xiàn)將大小鼠不同插管部位的特點進行簡要比較和總結(jié)。

表1 不同插管部位的比較Table 1 Comparison of different intubation sites

由上表可知，兩類插管方法的最主要區(qū)別是插管部位不同，從而形成各自不同的特點。股動靜脈插管手術(shù)部位在腹股溝附近，遠(yuǎn)離心、肺和腦等重要組織器官，且血管相對較粗，采血速度也較快，初學(xué)者培訓(xùn)后較易上手及熟練掌握。但該處血管位置較深，分離組織多，手術(shù)視野較窄，穿刺時出血量較大，失血相對較多。導(dǎo)管前端推進體內(nèi)較遠(yuǎn)距離可獲得穩(wěn)定的采血速度和血量。插管尾端可順勢經(jīng)尾部皮下穿刺引出體外，再經(jīng)特殊套管固定于尾部，大鼠適應(yīng)時間短，恢復(fù)到術(shù)前狀態(tài)較快。實驗中捉持大鼠對插管部位的影響小，模型穩(wěn)定性高。而頸動靜脈插管手術(shù)部位在頸部兩側(cè)，存在影響心肺和腦部器官的風(fēng)險，手術(shù)失敗后實驗動物的死亡率相對較高，且血管相對較細(xì)，采血速度適中。該處血管較淺表，無需分離太多組織即可暴露手術(shù)視野，穿刺時出血量不大。插管前端無需推進太遠(yuǎn)即可進入心臟以獲得穩(wěn)定的采血速度和血量。插管尾端經(jīng)皮下至背部引出并縫合至皮膚或由“馬甲”裝置固定于背部，但大鼠需提前適應(yīng)佩戴該裝置，且術(shù)后恢復(fù)時間較長。實驗中捉持大鼠，尤其是灌胃等操作可能對插管部位的造成影響，模型穩(wěn)定性不如前者。

綜合以上，兩類插管手術(shù)各有其特點和使用范圍，如能結(jié)合研究藥物的藥效作用部位、藥理作用機制、給藥方式特征以及實驗技術(shù)人員的特長，選擇最適合研究項目的插管技術(shù)和方法，也許會對藥代課題研究進展起到更積極的推動作用。