斑馬魚發(fā)育毒性與致畸性相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

戴明珠，黃燕烽，彭逸，張雙陽(yáng)，張立將，李春?jiǎn)?*

(1. 杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，杭州 310051；2. 浙江省人用物品安全性評(píng)價(jià)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室早期評(píng)價(jià)基地，杭州 310053)

1996年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)規(guī)定，藥物在獲批準(zhǔn)許人類使用之前需進(jìn)行生殖和發(fā)育毒性評(píng)估[1]?，F(xiàn)行的發(fā)育毒性指導(dǎo)原則主要包括經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD)條例TG414[2]、TG416[3]、TG421[4]、TG422[5]和人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議(International Conference on Harmonization，ICH)準(zhǔn)則S5(R3)[6]，其中建議使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以選擇常規(guī)種屬(大鼠、兔、小鼠)、非常規(guī)種屬(食蟹猴、小型豬)、有限使用種屬(豚鼠、倉(cāng)鼠、犬、雪貂)和其他替代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[7]。為快速、準(zhǔn)確推行和實(shí)施減少(reduction)、替代(replacement)和優(yōu)化(refinement)原則，實(shí)現(xiàn)保護(hù)動(dòng)物福利和減少哺乳動(dòng)物等較高級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用量，斑馬魚(Zebrafish，Daniorerio)發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)替代哺乳動(dòng)物模型已廣泛應(yīng)用于藥物的發(fā)育毒性與致畸性研究[8-9]。本文介紹了國(guó)內(nèi)外斑馬魚發(fā)育毒性與致畸性研究最新進(jìn)展。

1 發(fā)育毒性試驗(yàn)替代方法

食品、藥品和環(huán)境安全問(wèn)題是當(dāng)前全人類都必須面臨的一個(gè)嚴(yán)峻的問(wèn)題。如，目前人們普遍認(rèn)為，膳食纖維可分為兩種，可溶性膳食纖維(低聚果糖、果膠、菊粉等)和不可溶性膳食纖維(維生素等)。前者易在腸道中被細(xì)菌降解，產(chǎn)生短鏈脂肪酸等一系列益于人體的代謝產(chǎn)物，后者則不容易被消化酶降解，而起到促進(jìn)腸道蠕動(dòng)的作用。然而2018年10月18日，《細(xì)胞》(Cell)雜志發(fā)表文章表明，長(zhǎng)期喂食水溶性纖維會(huì)導(dǎo)致小鼠發(fā)生癌癥[10]。這里并不宣揚(yáng)膳食纖維是有害的，相反，應(yīng)該說(shuō)經(jīng)過(guò)高度處理的可溶性膳食纖維并不是那么安全，有可能會(huì)引起腸道菌群的過(guò)度生長(zhǎng)和失調(diào)，可能會(huì)增加罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。

2009年9月，歐洲化學(xué)品管理局(European Chemicals Agency，ECHA)新聞稿就已報(bào)道，有超過(guò)143 835種已預(yù)先注冊(cè)的化學(xué)品會(huì)污染食品和環(huán)境[11]，但其中約86%的化學(xué)品和其他現(xiàn)有化學(xué)品的安全性檢測(cè)數(shù)據(jù)即時(shí)缺失的[12]，這些實(shí)際數(shù)字遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了人們的認(rèn)知。又根據(jù)OECD指導(dǎo)方針，評(píng)估一種化學(xué)品的發(fā)育毒性需要5816只動(dòng)物，費(fèi)用為1 883 200英鎊[13]。因此，促使研究和發(fā)展發(fā)育毒性試驗(yàn)的替代方法是順勢(shì)而為的。早期的替代方法大概可分為整體胚胎培養(yǎng)試驗(yàn)、哺乳動(dòng)物微驢試驗(yàn)、爪蛙試驗(yàn)和胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)。前兩個(gè)模型仍然使用完整的哺乳動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，仍屬于高費(fèi)-低效系統(tǒng)，而蛙類專長(zhǎng)于神經(jīng)纖維興奮傳遞類實(shí)驗(yàn)，胚胎干細(xì)胞本身一直是一個(gè)具有爭(zhēng)議的領(lǐng)域。

因此，斑馬魚發(fā)育毒性試驗(yàn)替代方法似乎是適用的。斑馬魚胚胎在母體外發(fā)育，從合子期到孵化期僅72 h，且發(fā)育的完整過(guò)程均是透明的，利于實(shí)時(shí)觀察和檢測(cè)(斑馬魚、大鼠和人胚胎發(fā)育時(shí)期的比較見表1)。斑馬魚幼魚長(zhǎng)3 ～ 4 mm，擁有6-384孔板的高通量檢測(cè)體系，可實(shí)現(xiàn)低費(fèi)-高效篩選。斑馬魚與人類基因同源性達(dá)到87%[14-16]，用于藥物的體內(nèi)快速評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性強(qiáng)。故可以利用斑馬魚早期各個(gè)階段的發(fā)育形態(tài)，準(zhǔn)確高效的確定藥物暴露在胚胎中的毒性，廣泛應(yīng)用于藥物的發(fā)育毒性與致畸性研究。

表1 斑馬魚、大鼠和人胚胎發(fā)育時(shí)期的比較Table 1 Comparison of embryonic development periods among zebrafish, rat and human

2 斑馬魚發(fā)育毒性國(guó)內(nèi)外最新研究進(jìn)展

2010年，Brannen等[14]利用斑馬魚胚胎評(píng)價(jià)31種已知對(duì)體內(nèi)哺乳動(dòng)物胚胎致畸/不致畸化合物的致畸性，證實(shí)斑馬魚與哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)育毒性與致畸性評(píng)價(jià)的一致性為87%。同一年，由阿斯利康(AstraZeneca)牽頭的4個(gè)實(shí)驗(yàn)室間[15]利用斑馬魚對(duì)20種化合物的發(fā)育毒性進(jìn)行盲法評(píng)估，并詳細(xì)規(guī)范了斑馬魚發(fā)育毒性與致畸性的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)指標(biāo)和結(jié)果判定(毒性/畸形分級(jí)以及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn))，最終，4個(gè)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果與哺乳動(dòng)物數(shù)據(jù)的整體一致性范圍在60% ～ 70%。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的調(diào)整，更多因素如pH、絨毛膜的通透性、胚胎的攝取率等考慮在內(nèi)。2014年，阿斯利康又在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)平行對(duì)38種化合物的發(fā)育毒性與致畸性進(jìn)行了評(píng)估，此次兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室間的總一致性達(dá)到62% ～ 82%[16]。近年來(lái)國(guó)外斑馬魚發(fā)育毒性研究報(bào)告匯總詳見表2。

2013年，魯疆等[17]、夏繼剛等[18]先后成功利用斑馬魚胚胎評(píng)價(jià)氯化鉻等重金屬離子和全氟辛烷磺酸等有機(jī)污染物對(duì)水生生態(tài)的毒理學(xué)效應(yīng)。2016年，許冰潔等[19]利用斑馬魚評(píng)價(jià)5種已知對(duì)人類胚胎致畸藥物的毒性與安全性，證實(shí)斑馬魚胚胎模型可用于初步評(píng)價(jià)藥物的發(fā)育毒性和安全性。

表2 斑馬魚發(fā)育毒性研究報(bào)告匯總Table 2 Summary of developmental toxicity study reports in zebrafish

3 斑馬魚發(fā)育毒性與致畸性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)

國(guó)外學(xué)者利用斑馬魚進(jìn)行化合物發(fā)育毒性與致畸性評(píng)價(jià)，其化合物一般可歸為五類：A妊娠初3個(gè)月用藥，經(jīng)臨床對(duì)照未發(fā)現(xiàn)對(duì)胎兒有損害；B動(dòng)物實(shí)驗(yàn)未顯示對(duì)胎仔有危害，但缺乏臨床觀察資料；C動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)胎仔有危害，但未在妊娠早期臨床試驗(yàn)中證實(shí)；D對(duì)人類胎兒有危害，但利大于弊；X妊娠婦女禁用藥。實(shí)驗(yàn)一般規(guī)范選用受精后6 h(hours post fertilization，6 hpf)野生型AB系斑馬魚于24孔板中，每孔處理1個(gè)胚胎，每孔藥液體積為1 mL，12個(gè)1組，每個(gè)化合物均統(tǒng)一給予五個(gè)濃度(0.1、1、10、100和1000 μmol/L濃度，調(diào)節(jié)pH使控制在6.4 ～ 8.4)，在受精后第5天(day post fertilization，5 dpf)觀察斑馬魚的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)/器官并進(jìn)行評(píng)價(jià)。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果將與哺乳動(dòng)物數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，計(jì)算斑馬魚與哺乳動(dòng)物的一致性，由表2可知，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測(cè)性最低為50%，最高可達(dá)92%。

許冰潔[22]等利用斑馬魚胚胎評(píng)價(jià)了環(huán)磷酰胺、乙酸地塞米松、乙酰水楊酸、鹽酸四環(huán)素和阿扎胞苷5種已知對(duì)人類胚胎致畸藥物的毒性和安全性。實(shí)驗(yàn)選用已知的胚胎致畸性陽(yáng)性藥沙利度胺和陰性藥維生素C建立斑馬魚胚胎發(fā)育毒性模型，并設(shè)立格列本脲、頭孢噻肟鈉兩種陰性藥對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。挑選4 hpf AB系斑馬魚于6孔板中，每孔處理30個(gè)胚胎，每孔藥液體積為3 mL，每個(gè)化合物均統(tǒng)一給予4個(gè)濃度：1/10 MNLC、1/3 MNLC、MNLC(maximum non-lethal concentration，最大非致死濃度)和LC10(10%死亡濃度)，并分別以0.5%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和人工海水為溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組，在28.5℃條件下發(fā)育至5 dpf，觀察斑馬魚的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)/器官和死亡數(shù)量并進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，5種藥物50%死亡濃度(median lethal concentration，LC50)由大到小為環(huán)磷酰胺 > 阿扎胞苷 > 鹽酸四環(huán)素 > 乙酰水楊酸 > 乙酸地塞米松，半最大效應(yīng)濃度(concentration for 50% of maximal effect，EC50)由大到小為環(huán)磷酰胺 > 鹽酸四環(huán)素 > 阿扎胞苷 > 乙酰水楊酸 > 乙酸地塞米松。乙酸地塞米松毒性最強(qiáng)，乙酰水楊酸次之，其次鹽酸四環(huán)素、阿扎胞苷，環(huán)磷酰胺毒性較弱。格列本脲和頭孢噻肟鈉則均未出現(xiàn)明顯的致畸作用。

此外，斑馬魚胚胎還被廣泛運(yùn)用于Cd2+、Cu2+、Hg2+等重金屬離子[23-24]的發(fā)育毒性效應(yīng)研究；農(nóng)乳602(苯乙基酚聚氧乙烯醚)、寧乳33#(苯乙烯基苯酚甲醛樹脂聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚醚)、農(nóng)乳700號(hào)(烷基酚聚氧乙烯醚甲醛縮合物)、OP-10(辛基酚聚氧乙烯醚)、NP-10(壬基酚聚氧乙烯醚)，農(nóng)乳1602(三苯乙基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚)等多種市售表面活性劑[25]的發(fā)育毒性效應(yīng)研究；甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、異丙甲草胺等多種酰胺類除草劑[26]以及其他農(nóng)藥的毒理研究等。

4 斑馬魚發(fā)育毒性與致畸性量化評(píng)價(jià)指標(biāo)

2012年，約翰威立國(guó)際出版公司(John Wiley & Sons)聯(lián)合賽諾菲-安萬(wàn)特(Sanofi-Aventis)出版了書籍《斑馬魚：評(píng)估藥物安全性和毒性的方法》(《Zebrafish: Methods for Assessing Drug Safety and Toxicity》)，書中指出，與其他動(dòng)物模型相比，斑馬魚胚胎的快速發(fā)育和透明性是其作為新型模式生物的重要優(yōu)勢(shì)，斑馬魚發(fā)育毒性試驗(yàn)是為了繪制毒-效效應(yīng)曲線，并評(píng)估藥物的致死性。得出LC50、EC50、TI(Teratogenic Index，=LC50/EC50，致畸指數(shù))和畸胎指數(shù)[27]。因此，書中詳細(xì)描述了5 dpf時(shí)期斑馬魚發(fā)育毒性與致畸性形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)(表3)，并基于TI的截?cái)嘀怠?”來(lái)判定藥物的發(fā)育毒性和致畸性：TI > 1，表明這種化合物是具有致畸性的，提示50%斑馬魚出現(xiàn)發(fā)育異常的濃度低于50%致死濃度；TI < 1，表明非致畸性的；TI=1，提示發(fā)育毒性與致畸性評(píng)估必須在精確的LC50濃度下進(jìn)行，以確定斑馬魚是否在這個(gè)濃度下表現(xiàn)出畸形。

近年來(lái)，有學(xué)者[18]應(yīng)用軟件擬合出的EC50值再回到實(shí)驗(yàn)中去進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)擬合EC50值多低于實(shí)際半最大效應(yīng)濃度，此外，僅用TI評(píng)價(jià)藥物的致畸性不夠全面。因此，可以見到有些學(xué)者會(huì)通過(guò)統(tǒng)計(jì)死亡率，得到無(wú)明顯損害作用的最大染毒濃度(No Observed Adverse Effect Level，NOAEL)和產(chǎn)生畸形的最低濃度(Lowest Observed Adverse Effect Level，LOAEL)，再通過(guò)軟件擬合得到LC25(25%死亡濃度)，最終計(jì)算TI(LC25/NOAEL)值。

另外，在前期多以描述的方式進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)估的基礎(chǔ)上，有學(xué)者們對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，將形態(tài)學(xué)進(jìn)行0.5 ～ 5評(píng)分進(jìn)而對(duì)毒性/畸形進(jìn)行分級(jí)[28]。一般觀察指標(biāo)為軀干、脊索、尾部、鰭、心臟、面部結(jié)構(gòu)(眼睛、耳石、嗅覺區(qū)域)、神經(jīng)管和下頜(以上指標(biāo)均進(jìn)行毒性/畸形分級(jí)以及評(píng)分)，肝臟、卵黃囊、鰾和色素沉著(僅描述)。評(píng)分對(duì)于的毒性/畸形分級(jí)為：“5”正常形態(tài)學(xué)，“4(=NOAEL)”微變等效，“3(=LOAEL)”輕度異常，“2”中度畸形，“1”重度畸形，“0.5”結(jié)構(gòu)缺失。

2014年，F(xiàn)DA發(fā)表一篇文章，其中僅僅以斑馬魚胚胎體長(zhǎng)(Fiber length)和體周長(zhǎng)(Body length))作為毒性的統(tǒng)計(jì)量化終點(diǎn)[29]。

5 展望

發(fā)育毒理學(xué)是指研究出生前暴露于環(huán)境有害因子導(dǎo)致的異常發(fā)育結(jié)局及有關(guān)的發(fā)病機(jī)制、發(fā)病原理、影響因素和有毒物質(zhì)動(dòng)力學(xué)等。人類成功妊娠結(jié)局的比率低，且有復(fù)發(fā)性傾向，發(fā)病原因復(fù)雜[30]。我國(guó)藥物毒理學(xué)研究起步較晚，化藥和中藥毒理基礎(chǔ)數(shù)據(jù)較少，如僅2015版《中國(guó)藥典》指出的83種有毒中藥中，至少15種完全不能檢索到任何一項(xiàng)基礎(chǔ)毒性數(shù)據(jù)信息，過(guò)半主要毒性成分和毒性靶器官不明確[31]。常規(guī)發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)常采用嚙齒類動(dòng)物(鼠、兔等)進(jìn)行，先將成年的正處于發(fā)情期的雌雄鼠合籠，判斷雌鼠妊娠，至妊娠中后期，方才收集樣本進(jìn)行檢測(cè)[32-33]。如此實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，過(guò)程不可控，藥物用量大，費(fèi)用高，無(wú)法批量或規(guī)模性緩解目前中藥/化合物(發(fā)育)毒理學(xué)評(píng)價(jià)存在的問(wèn)題，且哺乳動(dòng)物試驗(yàn)無(wú)法對(duì)胚胎及其發(fā)育體系進(jìn)行時(shí)-實(shí)監(jiān)測(cè)。用胚胎發(fā)育透明的斑馬魚模式生物進(jìn)行藥物發(fā)育毒性與致畸性的高通量篩選和機(jī)制研究，其快速-高效-經(jīng)濟(jì)體系克服了傳統(tǒng)哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的劣勢(shì)，篩選結(jié)果預(yù)測(cè)性好、可比度高，應(yīng)用前景廣泛。

表3 發(fā)育毒性與致畸性評(píng)價(jià)指標(biāo)Table 3 Evaluation indicators of developmental toxicity and teratogenicity