利用RT-qPCR技術(shù)篩選菊黃東方鲀的最適內(nèi)參基因

蔣彩云，喬 琨，許 旻，熊 靜，劉智禹，3*，黃文樹，3*

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；3.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361021)

逆轉(zhuǎn)錄(Reverse transcription，RT)與定量PCR(quantitative PCR，qPCR)相結(jié)合可快速分析大量樣本，具有較高的靈敏度和特異性，成為基因表達水平測定最常用的方法[1]。該方法是首先將目的基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA(cDNA)，再通過RT-qPCR測定cDNA的相對或絕對數(shù)量。為消除或減少由于樣品而產(chǎn)生的差異，如RNA數(shù)量和質(zhì)量的差異，需要采用內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻腸DNA量進行歸一化[2]。因此，樣本間內(nèi)參基因的穩(wěn)定性是RT-qPCR檢測準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。

理想的內(nèi)參基因在個體、組織、細胞、所有發(fā)育階段以及不同的實驗條件下均恒定表達[3]。研究發(fā)現(xiàn)管家基因表達水平受環(huán)境因素影響較小，而且是在個體各生長階段的大多數(shù)，或幾乎全部組織中持續(xù)表達，或變化小。目前已報道的管家基因有數(shù)百種之多，其中β-actin、18SrRNA(以下簡寫18S)、EF1-α和GAPDH常用作內(nèi)參基因。然而，已有研究結(jié)果表明，在所有組織、發(fā)育時、生理條件下均穩(wěn)定表達的理想內(nèi)參基因并不存在[4]，因此，有必要根據(jù)研究，選擇不同的內(nèi)參基因。

目前，對人、鼠、豬、羊、雞等動物的內(nèi)參基因穩(wěn)定性已有相關(guān)的報道[5]，而對鲀科魚類的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性研究甚少。近年來，對鲀科魚類的分子免疫學(xué)、毒性、生理發(fā)育以及毒素刺激相關(guān)的研究越來越多[6-8]。在這些研究中，相對定量PCR是目前比較常用的mRNA表達水平檢測方法，目前內(nèi)參基因在特定實驗條件下表達的穩(wěn)定性并沒有被驗證。所以對于不同的實驗體系，必須進行最適內(nèi)參基因的篩選，以減少實驗的誤差。菊黃東方鲀(Takifuguflavidus)隸屬于鲀形目、鲀科、東方鲀屬，是一種重要的經(jīng)濟魚類。本實驗以養(yǎng)殖菊黃東方鲀的三個發(fā)育階段(3月齡、6月齡和12月齡)，以及成魚養(yǎng)殖和野生菊黃東方鲀的12個組織(腎、腸、胃、脾、肝臟、鰾、心臟、鰓、皮膚、肌肉和性腺等)為研究對象，利用geNorm軟件、NormFinder軟件和BestKeeper軟件分析了β-actin、GAPDH、EF1-α和18S四個管家基因在不同發(fā)育階段不同組織中表達的穩(wěn)定性，以此篩選出最合適的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

養(yǎng)殖菊黃東方鲀購自漳州市漳浦縣和大徑河鲀養(yǎng)殖場，野生成年菊黃東方鲀捕自臺灣海峽。不同發(fā)育階段的菊黃東方鲀規(guī)格見下表1。

表1 采樣表

1.2 總RNA提取及cDNA合成

使用0.01%丁香油水門汀麻醉菊黃東方鲀后解剖并取樣(每個發(fā)育階段樣品分別取自6條魚)，取腎、腸、胃、脾、肝臟、鰾、心臟、鰓、皮膚、肌肉和性腺等12個組織，每個組織取約100 mg，剪成厚度小于0.5 cm的小塊放入2 mL RNase free 管中，加入1 mL RNAstore Reagent(TIANGEN，北京天根)試劑，4℃過夜后放入-20℃或-80℃保存?zhèn)溆?。使用動物組織總RNA提取試劑盒(TIANGEN，北京天根)抽提總RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀(TECAN，瑞士)測定RNA濃度及純度。

每份組織取4 μg總RNA按照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(TRANS，北京全式金)說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。得到的cDNA樣本，使用內(nèi)參基因EF1-α定量引物對cDNA質(zhì)量進行半定量驗證，反應(yīng)體系10 μL，包括2×Master Taq Mix(TAKARA，日本)5 μL，正反向引物(10 μM)用量各0.5 μL，模版用量0.5 μL，超純水3.5 μL。在PCR儀上進行擴增，反應(yīng)程序：94℃、4 min，(94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s)×25 cycles，72℃、10 min。PCR結(jié)束后，對反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。將質(zhì)量好的cDNA樣品置于-20℃保存待用。

1.3 引物設(shè)計和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在NCBI數(shù)據(jù)庫中，搜索已登錄的紅鰭東方鲀、暗紋東方鲀等的β-actin基因序列，在菊黃東方鲀基因組序列(Takifuguflavidus，GenBank：GCA_000400755.1)中BLAST檢索相似度高的基因序列。利用Softberry軟件預(yù)測出mRNA序列，再利用Primer 5.0軟件，設(shè)計跨內(nèi)含子的定量引物，命名為β-actin-F和β-actin-R。EF1-α、18S和GAPDH的引物設(shè)計步驟參照上述β-actin。引物相關(guān)信息見表2。

表2 RT-qPCR的內(nèi)參基因引物序列信息表

注：登錄號來自NCBI數(shù)據(jù)庫。

Note：Accession number came from NCBI database.

將含有目的基因(β-actin、GAPDH、EF1-α和18S)DNA片段的質(zhì)粒(107拷貝/μL)作為標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水進行10倍梯度稀釋至102拷貝/μL，以此6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進行qPCR擴增以獲得各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct(Cycle threshold)值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。Ct值使用Light cycler 96軟件(軟件版本1.0)調(diào)用，從標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率確定每個樣本的PCR效率和相關(guān)系數(shù)(R2)。計算公式：E=10-1/m，其中m為標(biāo)曲斜率，E為擴增效率。qPCR的可接受E值在1.9～2.1之間[9]。并通過熔解曲線分析確定PCR產(chǎn)物的特異性。

1.4 實時熒光定量PCR

采用LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche，德國)和Roche LightCycler 96 Real-time PCR儀(Roche，德國)在96孔板上進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：2×SYBR Green I Master 10 μL，cDNA模板(濃度為0.2 ng/μL)用量4 μL，β-actin、EF1-α、GAPDH和18SrRNA正反向引物(10 μM)各1 μL，補充超純水至20 μL。qPCR程序：95℃、10 min，(95℃、10 s，60℃、10 s，72℃、10 s)×45 cycles，在延伸階段檢測熒光強度收集信號；熔解曲線程序(95 ℃、10 s，65 ℃、60 s，97 ℃、1 s)，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，取平均值進行分析。每次運行包括一個陰性對照，以檢測反應(yīng)體系是否污染。所有樣品稀釋1 000倍。

1.5 數(shù)據(jù)分析

在geNorm分析中，根據(jù)geNorm指令，將原始Ct值轉(zhuǎn)換為相對表達量：2-△Ct，其中△Ct=所有樣品Ct值-最小Ct值[9]。geNorm程序通過計算出每個內(nèi)參基因穩(wěn)定性的M值來篩選出穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因，判定標(biāo)準(zhǔn)為M值越小，內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好，反之，則穩(wěn)定性越差[10]。NormFinder分析時數(shù)據(jù)前處理同geNorm，先獲得內(nèi)參基因表達穩(wěn)定值，再根據(jù)穩(wěn)定值大小來篩選最合適的內(nèi)參基因，判定標(biāo)準(zhǔn)為表達穩(wěn)定值最小的內(nèi)參基因為最適的內(nèi)參基因[11]。BestKeeper軟件可以直接計算Ct值的原始數(shù)據(jù)，而不用轉(zhuǎn)換為相對表達量[12]，判定原則為標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)越小，內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好，反之，穩(wěn)定性越差；此外，如果SD值大于1，則認(rèn)為它不能作為內(nèi)參基因[13]。最后采用Su等的加權(quán)賦值方法[14]，給每種分析方法中每個基因的表達穩(wěn)定性賦值，最穩(wěn)定為1分，其次依次為2、3、4分，然后把每個基因所得分?jǐn)?shù)相加進行重新排序，分?jǐn)?shù)越小越穩(wěn)定。

2 結(jié)果

2.1 總RNA和cDNA質(zhì)量鑒定

Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀檢測不同組織(腎、腸、胃、脾、肝臟、鰾、心臟、鰓、皮膚、肌肉和性腺等)樣品總RNA的OD260/280，結(jié)果為(2.0±0.2)，表明其純度高。用1.2%瓊脂糖凝膠對所提取的總RNA進行電泳，并使用Quantity One軟件分析其完整性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品28S的條帶亮度約為18S的兩倍(圖1-A)，表明總RNA沒有降解。

將所得總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，使用EF1-α定量引物對cDNA進行半定量檢測，PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示不同組織的產(chǎn)物均出現(xiàn)與預(yù)期大小相近的約150 bp大小的條帶(圖1-B)，說明cDNA質(zhì)量完好。

注：(A)各組織總RNA電泳圖；(B)各組織半定量電泳圖。M：DL 2 000 Marker；1：肌肉；2：皮膚；3：肝臟；4：脾臟；5：鰾；6：鰓；7：心臟；8：腸；9：胃；10：鰭；11：腎臟；12：性腺。

Notes：(A)Total RNA electrophoresis of each tissue；(B)Semi-quantitative electrophoresis map of each tissue；M：DL 2 000 Marker；1：Muscle；2：Skin；3：Liver；4：Spleen；5：Bladder；6：Gill；7：Heart；8：Gut；9：Stomach；10：Fin；11：Kidney ；12：Gonads.

2.2 引物特異性及RT-qPCR效率

已知RT-qPCR產(chǎn)物范圍為135～263 bp，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證每個內(nèi)參基因只有一條條帶(圖2-A)。此外，RT-qPCR熔解曲線也顯示出與預(yù)期熔解溫度相對應(yīng)的單峰(圖2-B)，分布在79～83℃之間，表明qPCR反應(yīng)產(chǎn)物具有較高的特異性，并且無二聚體產(chǎn)生。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出每個內(nèi)參基因的擴增效率，β-actin、GAPDH、EF1-α和18S基因的擴增效率分別為2.03、2.04、1.97和2.02，線性R2(相關(guān)系數(shù))范圍為0.993 9 ～1.000 0，符合本實驗要求。

2.3 備選內(nèi)參基因的表達譜

為分析每個內(nèi)參基因的表達豐度，采用RT-qPCR檢測不同樣品中備選內(nèi)參基因的循環(huán)閾值(Ct值)，這些基因的相對豐度可以通過循環(huán)閾值的形式反映出來，低Ct值表示高表達量[15]。本研究對300份樣品(每種組織各6份)進行檢測，采用Graphpad prism 5對每個內(nèi)參基因的原始表達數(shù)據(jù)Ct值進行統(tǒng)計繪圖(圖3)。4個內(nèi)參基因在所有樣品中Ct值范圍為11.35～35.48。其中18S的表達豐度最高，平均Ct值為(16.77±2.11)(Mean±SD)，EF1-α(21.08±0.77)次之，GAPDH(24.45±3.27)和β-actin(26.33±3.86)的表達豐度偏低。此外，EF1-α的變異性最低，其Ct值范圍也最窄，說明它在不同條件下表達水平較為恒定。

通常，Ct值可以直觀地顯示備選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性和表達水平。然而，為了進一步評估所選擇的4個備選內(nèi)參基因在所有實驗樣本中的穩(wěn)定性，需要對數(shù)據(jù)進行更系統(tǒng)的分析：將Ct值轉(zhuǎn)化相應(yīng)的數(shù)據(jù)，用geNorm、NormFinder和BestKeeper三種軟件程序分析其表達穩(wěn)定性。

注：(A)所有定量引物的RT-qPCR產(chǎn)物電泳圖，M：DL 2 000 Marker，1：GAPDH；2：18S；3：EF1-α；4：β-actin；(B)四個備選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。

Notes：(A)Electrophoresis of RT-qPCR products of all quantitative primers，M：DL 2 000 Marker，1：GAPDH；2：18S；3：EF1-α；4：β-actin；(B)Standard curves and fusion curves for the four candidate reference genes.

2.4 備選內(nèi)參基因在不同發(fā)育階段的菊黃東方鲀中穩(wěn)定性分析

2.4.1 geNorm分析

geNorm計算結(jié)果顯示(圖4)，在總樣本中，4個備選內(nèi)參基因的M值均超過1.5，故在菊黃東方鲀整個發(fā)育過程中沒有一個內(nèi)參基因是表達恒定的，因此需要對每個階段的內(nèi)參基因進行更進一步的穩(wěn)定性分析。在3月齡和6月齡中18S和EF1-α的M值最低，說明在發(fā)育早期18S和EF1-α是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。在發(fā)育中后期的M值排序均為GAPDH>18S>β-actin>EF1-α。

注：3M、6M和12M分別表示3月齡、6月齡和12月齡。

Note：3M，6M and 12M represented the ages of 3 months，6 months and 12 months，respectively.

2.4.2 NormFinder分析

NormFinder計算結(jié)果及排名如表3所示，EF1-α在總樣本以及各個發(fā)育階段中的穩(wěn)定值最小。在3月齡中β-actin的穩(wěn)定值最大，但在12月齡及后期發(fā)育階段β-actin的穩(wěn)定值僅大于EF1-α。18S在3月齡和6月齡中穩(wěn)定值排名僅次于EF1-α，在發(fā)育后期較不穩(wěn)定。GAPDH在菊黃東方鲀的各個發(fā)育階段以及不同生長環(huán)境中穩(wěn)定值均最大。

表3 根據(jù)NormFinder計算備選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性

2.4.3 BestKeeper分析

在總樣本和三月齡中，只有EF1-α的SD值小于1，所以僅EF1-α可作為該樣本的內(nèi)參基因。在養(yǎng)殖菊黃東方鲀6月齡、12月齡和成年魚中(表4)，EF1-α是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，它的(SD±CV)值最低，分別為(0.42±1.96)、(0.57±2.72)、(0.71±3.29)，而GAPDH是最不穩(wěn)定的，它的SD值始終大于1。在野生成年魚中，18S是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

表4 根據(jù)BestKeeper計算備選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性

2.4.4 綜合排名分析

根據(jù)表5統(tǒng)計結(jié)果可以看出，EF1-α是所有條件下得分最小的，排名第一，在總樣本、3月齡和6月齡排名次之的是18S，在12月齡、野生和養(yǎng)殖成魚中β-actin排名第二，GAPDH是除了3月齡外得分最高的。因此，綜合排名最穩(wěn)定的基因為EF1-α，最不穩(wěn)定的是GAPDH。

表5 geNorm、NormFinder和BestKeeper分析穩(wěn)定值排名

2.5 備選內(nèi)參基因在組織中的穩(wěn)定性分析

4個內(nèi)參基因在不同發(fā)育階段的菊黃東方鲀組織中表達總水平如圖5所示，從圖中可以直觀地看出偏差越大的穩(wěn)定性越差。其中鰭、鰓中GAPDH和精巢中GAPDH、β-actin的表達豐度較低，不適宜作為該組織的內(nèi)參基因。再根據(jù)geNorm、NormFinder和Bestkeeper計算出各組織的穩(wěn)定性值，并進行排序。表6列出了各組織的穩(wěn)定值和排序情況，EF1-α是胃、腸、脾臟、鰾、心臟、卵巢和精巢的最適內(nèi)參基因，其中在胃、脾臟和鰾中由于18S和GAPDH的SD值大于1，不能作為內(nèi)參基因，故選擇排名次之的EF1-α。GAPDH是心臟、鰓、皮膚和腎的最適內(nèi)參基因，18S是心臟、鰭、肝臟和精巢的最適內(nèi)參基因，β-actin是肌肉的最適內(nèi)參基因。

表6 由geNorm、Normfinder和Bestkeeper計算備選內(nèi)參基因的排序及其各自的基因穩(wěn)定性值

注：在各組織中每個軟件計算結(jié)果排序第一的加粗突出顯示。

Note：Bold highlighting of the first order of results for each software calculation in each organization.

3 討論

在qPCR分析過程中，評價作為校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參基因有多種分析方法。目前，已開發(fā)的用于內(nèi)參基因篩選的軟件包括：GeNorm軟件、NormFinder軟件和BestKeeper軟件。分別使用這三個軟件對數(shù)據(jù)進行分析，選出穩(wěn)定度最高的內(nèi)參基因，最后綜合這三個軟件得到最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。研究選擇4個常用的管家基因β-actin、GAPDH、18S、EF1-α作為備選內(nèi)參基因，以不同發(fā)育階段的菊黃東方鲀?yōu)檠芯繉ο螅ㄟ^實時熒光定量PCR技術(shù)檢測分析了4個備選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性，得到4個內(nèi)參基因的穩(wěn)定度。

β-actin是一種在動物或植物研究中最常用的內(nèi)參基因[16-19]。然而，越來越多的證據(jù)表明，β-actin在某些情況下有表達差異，其表達會受生長、分化，甚至一些生物刺激的影響[20]，因此，β-actin作為內(nèi)參基因時存在爭議。本研究數(shù)據(jù)也表明，β-actin表達水平在養(yǎng)殖菊黃東方鲀3月齡和6月齡時偏低且組織間差異較大，其中肌肉表達水平比其他組織的高很多，是影響β-actin在組織中表達穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素之一。但β-actin在肌肉中不論是菊黃東方鲀的不同發(fā)育階段還是不同生長環(huán)境中的表達差異甚小，且表達水平適中。因此，選擇β-actin作為內(nèi)參基因時應(yīng)酌情考慮。

GAPDH也是較常見的管家基因之一，在熒光定量PCR分析中經(jīng)常被用于基因表達數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化[21]。然而，GAPDH作為基因表達分析的內(nèi)參基因也存在一定的爭議。例如，張家?guī)X等報道了GAPDH在藍點馬鮫魚中表達量最不穩(wěn)定[22]；Tang等研究描述了9種內(nèi)參基因在斑馬魚胚胎發(fā)育和斑馬魚組織中的表達，結(jié)果表明GAPDH是最不適合作為兩種條件下的內(nèi)參基因[23]。本研究表明GAPDH基因表達水平在組織間差異顯著，在養(yǎng)殖菊黃東方鲀3月齡時表達水平適中，但在發(fā)育過程中以及成魚后，GAPDH在肌肉中的表達水平增加，而在鰓、鰭和脾臟中的表達水平急劇減小。故GAPDH不適于作為菊黃東方鲀基因表達定量分析的內(nèi)參基因。

一般來說，18S在生物體中表達最為豐富[24]。Olsvik等[23]和Tang等[25]檢測了大西洋三文魚和斑馬魚組織特異性表達，他們證實18S在不同組織類型間表達相對一致。同樣，本研究也證實了18S在部分組織中的表達是相對穩(wěn)定的。但是，一般不選擇18S，主要是因為rRNA占總RNA量的80%左右，呈高豐度表達，可能會比目的基因的表達豐度高很多，容易在試驗過程中和數(shù)據(jù)分析時放大誤差。

延伸因子1-α(EF1-α)參與mRNA的翻譯，是細胞中表達較多的蛋白質(zhì)[26]。最近的研究表明，EF1-α在梭子蟹正常條件下以及在白斑綜合征病毒刺激后各組織中表達水平始終較為穩(wěn)定[27]。Tsukamoto等在研究紅鰭東方鲀體內(nèi)的TIMP-2s定量表達時，同樣選擇以EF1-α作為內(nèi)參基因[28]。本研究發(fā)現(xiàn)EF1-α的表達量僅次于18S，表達豐度適中，是菊黃東方鲀各個發(fā)育階段表達水平最為穩(wěn)定的，可作為研究不同發(fā)育階段組織間基因水平變化的內(nèi)參基因。

總之，本研究驗證了4個管家基因在菊黃東方鲀不同發(fā)育階段以及不同生長環(huán)境中的穩(wěn)定性，并篩選出EF1-α是表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?？梢岳眠@些結(jié)果對菊黃東方鲀主要功能基因的定量分析進行校準(zhǔn)，以獲得準(zhǔn)確、可靠、有意義的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)將為闡明菊黃東方鲀重要的分子調(diào)控機制和加速菊黃東方鲀品種改良提供理論基礎(chǔ)。