短時(shí)熱處理對(duì)低溫逆境下黃瓜不同部位的冷害及活性氧代謝影響

趙昱瑄，張敏,2,3*，姜雪，胡均如，李佳樂(lè)，蓋曉陽(yáng)

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海，201306) 3(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評(píng)價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海，201306)

黃瓜(CucumissativusLinn.)作為日常生活中最常見的果蔬之一，自身水分含量達(dá)98%，含有豐富的維生素、胡蘿卜素等營(yíng)養(yǎng)成分[1]。在常溫下貯藏，黃瓜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)快速流失，黃瓜容易衰老并發(fā)生腐敗;而適合的貯藏溫度雖然能夠減緩衰老[2]，防止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的損失，但黃瓜在低溫貯藏下會(huì)發(fā)生細(xì)胞膜的破壞，進(jìn)而發(fā)生冷害[3]。黃瓜果實(shí)冷害的發(fā)生受到諸多因素的共同影響[4]，冷害對(duì)果實(shí)品質(zhì)影響很大，在表面形成黑斑，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果實(shí)耐貯性逐漸下降，冷害面積逐漸增大，冷害程度加深，嚴(yán)重影響商品價(jià)值。故對(duì)黃瓜果實(shí)進(jìn)行冷藏的同時(shí)，還需采取一定的措施來(lái)減輕冷害的發(fā)生。熱處理能延長(zhǎng)水果貨架期，抑制生理病害，還能提高果蔬的抗冷性，減輕冷害，并且在食用方面有一定的安全性[5]。SHAO等[6]用45 ℃熱空氣處理枇杷果實(shí)3 h，顯著降低了枇杷的冷害發(fā)生率。李秀杰等[7]發(fā)現(xiàn)8 ℃熱水處理 10 min 的‘魯星’油桃可以減輕果肉褐變和腐爛，保持油桃風(fēng)味。喬勇進(jìn)等[8]通過(guò)對(duì)黃瓜進(jìn)行37 ℃熱空氣處理24 h，維持了細(xì)胞膜的完整性，減輕了低溫傷害，延緩了冷害的發(fā)生。IBRAHIM等[9]發(fā)現(xiàn)55 ℃熱水處理可提高黃瓜果實(shí)CAT、APX和POD的活性，降低果實(shí)的冷害發(fā)生率。熱處理同樣也能提高柑橘[10]、西葫蘆[11]、青椒[12]的抗冷性。黃瓜果實(shí)與果梗連接處含有一定量的苦味素也叫葫蘆素C，有抗腫瘤的功能[13]，具有一定的研究?jī)r(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在熱處理技術(shù)減輕果蔬冷害方面進(jìn)行了大量的研究，但都限于對(duì)黃瓜果實(shí)單一部位的影響，而對(duì)果實(shí)不同部位的冷害和活性氧代謝的研究較少見報(bào)道。

本研究以黃瓜為試驗(yàn)材料，根據(jù)前期的二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)選出的4 ℃貯藏溫度下最佳熱處理?xiàng)l件(39.4 ℃熱水中熱激24.4 min)，測(cè)定黃瓜果實(shí)活性氧清除酶的活性以及膜脂含量對(duì)低溫脅迫的變化,研究了短時(shí)熱處理對(duì)低溫逆境下黃瓜不同部位的冷害研究,為進(jìn)一步研究熱處理對(duì)貯藏保鮮與耐冷性的關(guān)系，并應(yīng)用于黃瓜的貯藏保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 試劑與儀器

NaOH、抗壞血酸、H2O2、硫代巴比妥酸、乙二胺四乙酸二鈉、甲硫氨酸、核黃素、三氯乙酸、無(wú)水乙醇、磷酸氫鈉、冰醋酸,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MDA測(cè)試盒、H2O2測(cè)試盒、超氧陰離子自由基測(cè)試盒、超氧化物歧化酶測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所。

BPS-100CA 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HSWX-600BS 型電熱恒溫水溫箱，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；H-2050R-1型高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；THZ-82A 型恒溫振蕩箱，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；GY-4型數(shù)顯果實(shí)硬度計(jì)，浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司；BJ2100D型數(shù)字孔式電子天平；DDS-307 型電導(dǎo)率儀，上海笛柏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 冷害指數(shù)的測(cè)定

分別隨機(jī)取15根黃瓜，觀察冷害狀況，判斷冷害等級(jí)[14]。冷害指數(shù)共分為5個(gè)等級(jí)，即0級(jí)，無(wú)冷害；1級(jí)，冷害面積小于25%；2級(jí)，冷害面積為25%～50%，輕度冷害；3級(jí)，冷害面積為50%～75%，中度冷害；4級(jí)，冷害面積為75%～100%，嚴(yán)重冷害。按照公式(1)計(jì)算冷害指數(shù)，重復(fù)3次。

(1)

1.3.2 硬度的測(cè)定

硬度測(cè)定參考曹建康等[14]的方法，在黃瓜果實(shí)頭部(花萼端)、赤道部位、尾部(果梗端)取1 cm厚果肉，將硬度計(jì)垂直打入黃瓜果實(shí)果肉處測(cè)定。

1.3.3 EL、MDA含量的測(cè)定

EL的測(cè)定參考曹建康等[14]的方法進(jìn)行修改。黃瓜切成薄片，用打孔器取圓片，加20 mL去離子水，振蕩后過(guò)濾，再加入離子水，測(cè)定初始電導(dǎo)率(R0)。真空干燥后放入振蕩箱振蕩，測(cè)定樣品溶液電導(dǎo)率(R)。煮沸取出后冷卻，測(cè)定溶液的電導(dǎo)率(R′)。按照公式(2)計(jì)算電解質(zhì)外滲百分率(Y)：

(2)

MDA含量采用MDA測(cè)試盒測(cè)定。

1.3.4 PPO活性的測(cè)定

參考曹建康等[14]的方法。PPO催化后形成產(chǎn)物在420 nm處有最大光吸收峰，可利用比色法測(cè)定。

1.3.5 可溶性蛋白含量的測(cè)定

采用紫外吸收法[14]測(cè)定。在280 nm處其吸光度值蛋白質(zhì)出現(xiàn)吸收高峰，其吸光度值與蛋白質(zhì)含量成正比。

1.3.6 CAT、POD、APX、SOD的活性測(cè)定

CAT、APX活性測(cè)定參考CHEN等[15]的方法；CAT以每克果肉1 min內(nèi)OD240值變化0.01為1個(gè)酶活單位；APX以每克果肉1 min內(nèi)OD290值變化0.01為1個(gè)酶活單位；POD含量參考曹建康等[14]的方法，采用愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行測(cè)定；超氧化物歧化酶含量的測(cè)定采用SOD測(cè)試盒測(cè)定。

1.3.7 H2O2含量和超氧陰離子自由基的測(cè)定

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行3次重復(fù)，SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位冷害指數(shù)的影響

冷害指數(shù)是能直觀地判斷冷害發(fā)生程度的指標(biāo)[16]。如圖1所示，黃瓜在4 ℃貯藏條件下，CK組和HWT組的冷害指數(shù)隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。在貯藏初期，黃瓜果實(shí)冷害癥狀不明顯，3 d后，HWT組和CK組黃瓜的頭部和中部均發(fā)生冷害，靠近頭部最嚴(yán)重，而尾部的冷害則推遲到第6天出現(xiàn)，之后冷害指數(shù)急劇上升，到第12天時(shí)CK組的頭部和中部的冷害指數(shù)達(dá)到0.6以上，HWT組的頭部和中部的冷害指數(shù)均低于對(duì)照組，HWT組尾部的冷害指數(shù)最低，僅為0.32，貯藏結(jié)束時(shí)CK組以及HWT組頭部、中部和尾部的冷害指數(shù)分別達(dá)到了0.84、0.85、0.62、0.79、0.80和0.55。黃瓜果實(shí)頭部、中部到尾部冷害指數(shù)逐漸上升，且存在顯著差異(P<0.05)。由此可見，黃瓜不同部位抑制冷害的效果不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明整個(gè)低溫貯藏期，熱處理可以減輕貯藏過(guò)程中冷害的發(fā)生時(shí)間，且HWT組的頭部和中部的冷害要高于HWT組的尾部。王靜等[17]研究發(fā)現(xiàn)哈密瓜果實(shí)經(jīng)過(guò)55 ℃熱水處理3 min，推遲了冷害的發(fā)生時(shí)間，使細(xì)胞膜破壞程度減輕，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖1 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位冷害指數(shù)的影響

2.2 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位硬度的影響

黃瓜果實(shí)硬度是衡量其貯藏壽命的重要指標(biāo)之一。如圖2所示，CK組和HWT組的硬度均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其降幅存在一定的差異。黃瓜果實(shí)貯藏3 d時(shí)，HWT組頭部、中部和尾部的黃瓜果實(shí)硬度分別比CK組的頭部、中部和尾部高1.56%、2.21%和2.34%。貯藏9 d后，HWT組的頭部、中部、尾部的硬度較0 d分別低12.34%、11.32%、9.96%，對(duì)照組的頭部、中部和尾部較0 d低15.79%、14.55%、10.54%。貯藏后期，隨著冷害的加重，CK組黃瓜果實(shí)中部的硬度降幅逐漸升高，說(shuō)明冷害程度加速硬度的下降，下降的原因可能是冷害的加深，導(dǎo)致細(xì)胞軟化程度加深。從圖2可以看出，熱處理能較好地維持果實(shí)較高的硬度，且不同部位的黃瓜果實(shí)硬度存在顯著差異(P<0.05)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，頭部和中部的下降幅度增大。HWT組黃瓜果實(shí)的頭部、中部和尾部的硬度分別高于CK組頭部、中部、尾部的硬度，說(shuō)明不同部位的黃瓜果實(shí)在低溫逆境下抑制硬度下降程度不同，而尾部的硬度比頭部和中部高，說(shuō)明黃瓜果實(shí)尾部能更好地抑制軟化程度的加深。

圖2 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位硬度的影響

2.3 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位電解質(zhì)外滲率和丙二醛含量的影響

黃瓜果實(shí)在低溫貯藏后細(xì)胞膜發(fā)生破壞，導(dǎo)致果實(shí)冷害的發(fā)生[18]。邵婷婷等[19]利用50 ℃強(qiáng)制對(duì)流熱空氣處理20 min能夠推遲青椒果實(shí)冷害發(fā)生的時(shí)間，能有效減輕低溫脅迫下活性氧的傷害，延緩了青椒果實(shí)冷害的發(fā)生。如圖3所示，CK組和HWT組的電解質(zhì)外滲率(EL)均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，且隨著貯藏時(shí)間的增加而增加。在4 ℃下貯藏9 d后，HWT組的頭部、中部、尾部的電解質(zhì)外滲率分別為59.6%、56.2%、53.26%，較CK組的頭部、中部和尾部低6.88%、7.62%、6.51%。說(shuō)明熱處理可以使黃瓜果實(shí)在低溫逆境下產(chǎn)生抗性，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞的膜脂狀態(tài)，而尾部的電解質(zhì)外滲率值比頭部和中部低，說(shuō)明黃瓜果實(shí)尾部的抗冷性更強(qiáng)。

圖3 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位電解質(zhì)外滲率(EL)的影響

丙二醛含量的變化跟電解質(zhì)外滲率一樣均表征細(xì)胞膜的破壞情況，細(xì)胞膜上的磷脂分子被氧化，生成過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛稱之為膜脂過(guò)氧化現(xiàn)象，丙二醛的累積會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性[20]。ENDO等[21]通過(guò)青梅果實(shí)在45 ℃水中浸泡5 min,抑制了丙二醛和過(guò)氧化氫的升高，延緩了抗壞血酸含量和總抗氧化能力水平的下降，顯著降低果實(shí)對(duì)CI的敏感性。如圖4所示，在第3天，MDA含量有下降的趨勢(shì)，尾部下降較為明顯；6 d后，各組的黃瓜MDA含量增加迅速；貯藏前9 d,CK組尾部的MDA含量低于HWT組的中部和頭部，與貯藏前期冷害程度較低有關(guān)；至貯藏末期，對(duì)照組的頭部MDA含量的增長(zhǎng)率最高，HWT組的尾部增長(zhǎng)率最小；在貯藏結(jié)束時(shí)，其數(shù)值由貯藏初期的3.45 nmol/g升至7.36 nmol/g，顯著小于其他處理組(P<0.05)，說(shuō)明熱處理能夠減輕細(xì)胞膜的破壞，從而減輕冷害，而熱處理組尾部的細(xì)胞膜破壞程度最低。

圖4 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位丙二醛含量的影響

2.4 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白作為果實(shí)組織中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)生物膜和細(xì)胞起到保護(hù)作用[22]。從圖5可以看出，貯藏過(guò)程中，黃瓜果實(shí)可溶性蛋白含量呈現(xiàn)出先急劇上升后緩慢下降的趨勢(shì)。貯藏前3 d，可溶性蛋白含量明顯上升，可能與冷敏果實(shí)受到低溫脅迫機(jī)體自身合成一些小分子蛋白有關(guān)，接著可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸下降，可能是與低溫引起的蛋白質(zhì)合成酶系統(tǒng)遭到破壞有關(guān)[23]。貯藏3 d后，可溶性蛋白含量逐漸下降，各組之間差異顯著(P<0.05)。HWT組尾部的可溶性蛋白含量由3 d時(shí)的0.70 mg/g下降至15 d時(shí)的0.49 mg/g，下降了42.86%。HWT組尾部的可溶性蛋白含量一直高于其他處理組，這可能是因?yàn)楣咴谠馐艿蜏啬婢趁{迫時(shí)，能合成小分子物質(zhì)，以增強(qiáng)其抗逆性。

圖5 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位可溶性蛋白含量的影響

2.5 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位多酚氧化酶活力的影響

在果蔬貯藏過(guò)程中，多酚氧化酶參與一系列由酶促活動(dòng)而引起的化學(xué)變化，多酚氧化酶使酚類物質(zhì)氧化，引起果實(shí)組織褐變[24]。如圖6所示，貯藏過(guò)程中，PPO活力呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。貯藏初期PPO的活力上升，但各組之間數(shù)值差別不大，至6 d時(shí)，多酚氧化酶活力變化出現(xiàn)差異，黃瓜果實(shí)的尾部增長(zhǎng)率最高達(dá)到8.03 U/g;至9 d時(shí)，多酚氧化酶活力再次上升，CK組尾部達(dá)到13.71 U/g，上升速度快、幅度大，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚氧化酶活力持續(xù)上升;15 d時(shí)CK組尾部比HWT組尾部高2.1(U/g)。在貯藏過(guò)程中，HWT組頭部的PPO活力相對(duì)最低，而CK組尾部的PPO活力在各組中相對(duì)最高.貯藏9 d后,HWT組尾部的PPO活力高于CK組的頭部和中部，與果實(shí)組織的成熟度有關(guān)，黃瓜果實(shí)尾部的成熟度大于頭部和中部。

圖6 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位多酚氧化酶(PPO)活力的影響

2.6 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位CAT、POD和APX、SOD酶活力的影響

在反應(yīng)過(guò)程中，CAT能催化H2O2形成H2O[25]，能夠有效地清除自由基，從而維持膜的穩(wěn)定性，減輕機(jī)體不良反應(yīng),如圖7所示。

圖7 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位過(guò)氧化氫酶(CAT)活力的影響

CAT酶活力呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，貯藏第9天時(shí)各處理組的CAT活力均達(dá)到峰值，隨后逐漸降低。HWT組的頭部和中部的CAT活力大于CK組的頭部和中部;CK組的頭、中、尾部較0 d的高1.74倍、2.05倍和2.27倍，HWT組的頭、中、尾部較0 d的高1.92倍、2.22倍和2.46倍，表明果實(shí)中CAT活力在熱處理時(shí)被誘導(dǎo)升高，經(jīng)過(guò)熱處理后黃瓜果實(shí)的活性氧較低，清除部分活性氧，細(xì)胞受傷害程度減小，從而抑制了冷害的發(fā)生，而且HWT組和CK組尾部的CAT活力都較高，說(shuō)明尾部的CAT活力對(duì)于催化植物體內(nèi)的H2O2分解為水和氧分子，從而減少H2O2對(duì)果蔬組織可能造成的氧化傷害的作用更顯著。

圖8 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位過(guò)氧化物酶(POD)活力的影響

抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)能催化抗壞血酸與H2O2發(fā)生反應(yīng)，清除果實(shí)內(nèi)H2O2，進(jìn)而提高果蔬的抗氧化能力[27]。如圖9所示，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組的APX活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；HWT組的APX活力在貯藏第6天達(dá)到最大值，頭、中、尾部的值分別為111.13、112.88、123.25 U/g，比0 d高3.72、3.76、和4.9倍，隨后迅速下降。CK組APX活力在貯藏第9天達(dá)到最大值，頭、中、尾部的值為87.88、88.38、91.13 U/g。上述結(jié)果表明，熱處理可以保持細(xì)胞較高的活性氧清除酶活力，從而減少活性氧的積累，且HWT組尾部的活性氧清除酶活力最高。

圖9 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活力的影響

超氧化物歧化酶(SOD)可催化超氧陰離子自由基歧化生成H2O2和O2，前者分解為無(wú)毒的H2O和O2，也能夠保護(hù)細(xì)胞膜的完整性[28]。如圖10所示，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組的SOD活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),HWT組的增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯。在貯藏第3天，SOD活力增長(zhǎng)差別較小，HWT組的頭部、中部小于CK組的尾部，是由于貯藏前期冷害不明顯，尾部的抗冷性更強(qiáng)；各組SOD活力在貯藏第6天達(dá)到峰值，HWT組頭、中、尾部的值分別比CK組高36.37%、34.05%、30.76%。上述結(jié)果表明，熱處理可以有效提高果實(shí)的SOD酶活力，增強(qiáng)了清除自由基的能力；HWT組的尾部增長(zhǎng)率高，說(shuō)明尾部的自我保護(hù)能力更高。

圖10 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響

2.7 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位H2O2含量和超氧陰離子自由基的影響

H2O2是植物體內(nèi)一種活性氧自由基，當(dāng)活性氧清除系統(tǒng)代謝不平衡時(shí)，H2O2將會(huì)大量累積導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞。由圖11可知，在貯藏期間(黃瓜H2O2含量總體呈上升的趨勢(shì))，可對(duì)黃瓜果實(shí)細(xì)胞組織造成損傷。在貯藏初期，各組H2O2含量的頭部和中部無(wú)顯著性差異。在貯藏后期，CK組的H2O2含量顯著大于HWT組，第12天，CK組頭部、中部和尾部的H2O2含量分別比HWT組的頭部、中部和尾部高出26.7%、35.6%及38.1%。貯藏15 d，果實(shí)CK組頭部、中部、尾部的H2O2含量比0 d高4.8、4.7和4.6倍；HWT組頭部、中部和尾部的黃瓜果實(shí)的H2O2含量比0 d高3.9、3.8和3.7倍，表明熱處理在貯藏期能明顯抑制黃瓜果實(shí)體內(nèi)H2O2含量上升，尾部的抑制效果更明顯。

圖11 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位H2O2含量的影響

圖12 短時(shí)熱處理對(duì)黃瓜果實(shí)不同部位的影響

3 結(jié)論

熱水處理能抑制黃瓜果實(shí)丙二醛含量以及電解質(zhì)外滲率的升高，能提高APX、CAT、POD活力，提高黃瓜果實(shí)的抗氧化能力和活性氧清除能力。趙宇瑛等[34]為了研究黃瓜果實(shí)采后的耐冷性,在2 ℃下貯藏9 d后,分別測(cè)定頭部(花萼端)、中部、尾部(果梗端)3個(gè)部位的指標(biāo)，黃瓜果實(shí)從尾部到頭部的耐低溫能力逐漸降低。本試驗(yàn)熱處理組的頭、中、尾部與對(duì)照組相比，冷害指數(shù)、電導(dǎo)率、MDA含量要低于對(duì)照組，熱處理組的頭、中、尾部硬度分別高于對(duì)照組的頭、中、尾部，POD、CAT活力要高于對(duì)照組，這說(shuō)明黃瓜果實(shí)不同部位熱處理均減輕了冷害帶來(lái)的影響,提高其抗冷性。且黃瓜果實(shí)尾部的冷害指數(shù)一直低于其他處理組，黃瓜頭部、中部、尾部的抗冷性存在差異,這種差異與POD和CAT的活性以及滲透作用存在密切的聯(lián)系。各處理組對(duì)黃瓜冷害抑制的程度為熱處理組>對(duì)照組，尾部>中部>頭部。