高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶快速篩選方法的建立與初步應(yīng)用

趙繼華，牛丹丹，NOKUTHULA Peace Mchunu，田康明，苗佳，王正祥,

1(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院)，天津,300457) 2(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津,300457) 3(Biotechnology Platform, Agricultural Research Council, Pretoria 0001, South Africa)

低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides，GOS)是一種公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)益生元，是功能性低聚糖的重要組成部分，以重要原輔料應(yīng)用于乳品和代乳品、發(fā)酵制品、飼料和微生態(tài)制劑等工業(yè)[1-3]。通過(guò)酶法催化乳糖轉(zhuǎn)苷為半乳二糖、半乳三糖、半乳四糖等低聚半乳糖，是目前工業(yè)化制備GOS的主要方法。具有轉(zhuǎn)苷活性的乳糖酶則是制約這一產(chǎn)業(yè)發(fā)展的核心要素。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)缺乏制備GOS所必需的高轉(zhuǎn)苷活性專業(yè)酶制劑，GOS產(chǎn)品質(zhì)量與生產(chǎn)技術(shù)水平較低。

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, EC 3.2.1.23)，又稱乳糖酶(lactase)，能夠催化乳糖水解形成葡萄糖和半乳糖或轉(zhuǎn)苷形成低聚半乳糖[4-6]。利用乳糖酶的水解活性，可以進(jìn)行牛奶中乳糖的水解，消除健康人群對(duì)乳糖的不耐受性；借助乳糖酶的轉(zhuǎn)苷活性，則可以將乳糖轉(zhuǎn)化為功能價(jià)值更優(yōu)的GOS。在這一過(guò)程中，低聚半乳糖形成的比例取決于β-半乳糖苷酶的水解活性和轉(zhuǎn)苷活性比例關(guān)系[7-10]。因此，獲得具有高轉(zhuǎn)苷活性的β-半乳糖苷酶新酶分子，對(duì)推動(dòng)酶法制備GOS技術(shù)進(jìn)步極為重要。

現(xiàn)有評(píng)價(jià)β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)苷活性的方法，主要通過(guò)HPLC或TLC等檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)樣本中GOS的形成量[11-12]。這些方法準(zhǔn)確可靠，但檢測(cè)通量有限，無(wú)法應(yīng)用于大規(guī)模樣本的快速篩選。為此，筆者研究并建立了一種基于GOS和生物量相關(guān)關(guān)系的新型高轉(zhuǎn)苷活性β-半乳糖苷酶的高通量篩選方法，運(yùn)用此方法對(duì)菌種庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模篩選，獲得了具有顯著轉(zhuǎn)苷活性β-半乳糖苷酶的產(chǎn)酶菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究供試細(xì)菌分離物保藏物共3 759株，其中2 259株從中國(guó)高校工業(yè)微生物資源與信息中心(CICIM-CU)獲得，另1 500株細(xì)菌分離物為近期從乳品樣本和環(huán)境土樣等自然樣本中分離、鑒定并保藏。細(xì)菌的分子鑒定按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行[13]。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，K2HPO42，檸檬酸三銨2，乙酸鈉5，葡萄糖20，吐溫-80 1(mL)，MgSO41，MnSO40.5，瓊脂粉20；pH 6.0。

篩選培養(yǎng)基A(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，K2HPO42，檸檬酸三銨2，乙酸鈉5，GOS 20，吐溫-80 1(mL)，MgSO41，MnSO40.5，瓊脂粉20；pH 6.0。

篩選培養(yǎng)基B(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，K2HPO42，檸檬酸三銨2，乙酸鈉5，乳糖5，半乳糖5，葡萄糖5，吐溫-80 1(mL)，MgSO41，MnSO40.5，瓊脂粉20；pH 6.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 指示菌的篩選

將待檢菌株用相應(yīng)培養(yǎng)基活化后，分別點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基A和篩選培養(yǎng)基B，37 ℃培養(yǎng)60 h，記錄生長(zhǎng)情況與生長(zhǎng)菌落大小，分別標(biāo)注為“-”或“+”。以“-”表示不生長(zhǎng)，“+”表示有明顯生長(zhǎng)，“+”越多表示菌落生長(zhǎng)越顯著。

1.2.2 GOS-生物量相關(guān)關(guān)系

以篩選培養(yǎng)基A為基礎(chǔ)，調(diào)整其中的低聚半乳糖添加量分別為：0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0 g/L。接入指示菌后于37 ℃下液體培養(yǎng)一定時(shí)間，在600 nm下檢測(cè)指示菌株的生長(zhǎng)情況，用OD600表示。

1.2.3 半乳糖基轉(zhuǎn)移活性的篩選

將待篩選菌株在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為200 g/L的乳糖，50 ℃條件下孵育12 h，離心收集上清再經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾除菌后備用；將上述反應(yīng)液按照體積分?jǐn)?shù)10%的添加量，添加至不含GOS組分的液體篩選培養(yǎng)基A中；接入指示菌，于37 ℃培養(yǎng)下培養(yǎng)，檢測(cè)指示菌的增殖情況，用OD600值表示。

1.2.4 搖瓶發(fā)酵與酶液的制備

在250 mL三角瓶中進(jìn)行，培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基A液體培養(yǎng)基，裝液量為50 mL。培養(yǎng)在37 ℃、230 r/min下進(jìn)行。發(fā)酵過(guò)程中定時(shí)取樣，離心收集上清液，分析酶活力。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，離心取上清液并凍干，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5 β-半乳糖苷酶酶活力測(cè)定

β-半乳糖苷酶酶活力測(cè)定：1 mL反應(yīng)體系中含有200 g/L的乳糖和一定體積的酶液，用0.05 mol/L的醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至5.0，在50 ℃水浴中反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，在沸水中滅活20 min，再通過(guò)生物傳感儀檢測(cè)葡萄糖的含量。β-半乳糖苷酶的活性定義為：在pH 5.0、50 ℃下1 min催化乳糖底物釋放1 μmol/L葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(u)。

1.2.6 酶解乳糖及其產(chǎn)物分析

采用300 g/L乳糖為底物，添加20 u/g的β-半乳糖苷酶，反應(yīng)在50 ℃下進(jìn)行，定時(shí)取樣，采用HPLC法分析酶促產(chǎn)物特征與生成。色譜條件為：流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)65%乙腈，1.0 mL/min流速；TSK-GEL G3000PWXL-CP(7.8 mm×300 mm，7 μm)色譜柱，柱溫25 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度90 ℃，載氣流速2.2 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 指示菌的獲得

鑒于現(xiàn)有GOS檢測(cè)方法無(wú)法用于乳糖酶轉(zhuǎn)苷活性的高通量篩選目的[11-12]，建立適合高通量篩選目的的篩選方法是必要的。為此，本文試圖建立起基于指示菌以GOS為碳源的生長(zhǎng)狀況的高通量篩選方法。即：運(yùn)用可利用GOS生長(zhǎng)，但對(duì)乳糖、葡萄糖和半乳糖的代謝利用弱或不利用的微生物菌株為指示菌，進(jìn)而以此菌對(duì)樣本中形成的GOS(細(xì)菌分離物形成的乳糖酶轉(zhuǎn)化乳糖為GOS)的生長(zhǎng)為依據(jù)，篩選獲得具有轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶產(chǎn)酶菌株。

對(duì)分離保藏的細(xì)菌菌株進(jìn)行GOS為唯一碳源生長(zhǎng)的篩選，并以乳糖、葡萄糖和半乳糖為混合碳源為對(duì)照，通過(guò)篩選，獲得了27株在GOS唯一碳源平板上生長(zhǎng)，在乳糖、葡萄糖和半乳糖為混合碳源平板上不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)較弱的菌株(表1)。具備指示菌屬性的細(xì)菌分離物主要來(lái)源于乳桿菌屬和雙歧桿菌屬，其中乳桿菌屬16株，雙歧桿菌屬9株，戊糖片球菌和糞鏈球菌各1株。以生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)最為明顯的長(zhǎng)雙歧桿菌B1172菌株作為最佳指示菌用于后續(xù)研究。

表1 初篩獲得的指示菌株及其生長(zhǎng)情況

注：“-”表示不生長(zhǎng)，“+”表示有明顯生長(zhǎng)，“+”越多表示菌落生長(zhǎng)越顯著

2.2 指示菌B1172篩選靈敏度范圍確認(rèn)

考察了指示菌B1172以GOS為碳源的生長(zhǎng)情況(圖1)。以不添加GOS的篩選培養(yǎng)基為對(duì)照，添加1.0 g/L GOS后，菌株B1172生物量已超過(guò)0.5，比不添加GOS條件下菌株菌體量高10倍以上(對(duì)照條件下菌體積累量為0.05)?？梢?jiàn)，培養(yǎng)體系中，較低的GOS質(zhì)量濃度(≥1.0 g/L)下即可通過(guò)指示菌的生長(zhǎng)情況反映出來(lái)，指示菌的生物量與GOS質(zhì)量濃度存在良好的相關(guān)關(guān)系(圖1)，可以用于對(duì)樣本中GOS形成情況和形成量進(jìn)行快速批量檢出。

圖1 GOS-指示菌B1172生物量相關(guān)關(guān)系

2.3 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活力的高通量篩選

在供試的菌種培養(yǎng)物中加入最終質(zhì)量濃度為200 g/L的乳糖液，50 ℃反應(yīng)后收集上清液用于GOS生成的快速檢測(cè)樣本，以10%的補(bǔ)加量替代篩選培養(yǎng)基A中的GOS碳源，接入指示菌B1172，培養(yǎng)后測(cè)定指示菌生長(zhǎng)情況。從3 700余株細(xì)菌分離保藏菌中，獲得了5株具有較強(qiáng)轉(zhuǎn)化乳糖為GOS的菌株(表2)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，菌株B0212和B2301的轉(zhuǎn)半乳糖苷酶活力主要集中于胞內(nèi)，菌株B0809、B2809和B3156的轉(zhuǎn)半乳糖苷酶活力則主要集中于發(fā)酵液中；以菌株B2301為對(duì)象，進(jìn)一步確認(rèn)其乳糖酶產(chǎn)酶水平和催化GOS合成情況。

表2 轉(zhuǎn)半乳糖苷酶活高通量篩選結(jié)果

2.4 菌株B2301產(chǎn)酶水平及其催化GOS合成

在搖瓶發(fā)酵下，定時(shí)取樣并檢測(cè)乳糖酶酶活力。發(fā)酵中后期，由于菌株B2301的裂解等原因，可在其發(fā)酵上清液中測(cè)定到乳糖酶酶活力(圖2)，發(fā)酵95 h時(shí)發(fā)酵上清液中酶活力達(dá)到最高，約為2.5 u/mL。

圖2 搖瓶條件下菌株B2301產(chǎn)乳糖酶進(jìn)程

以300 g/L乳糖為底物，添加20 u/g的B2301乳糖酶，在50 ℃下反應(yīng)不同時(shí)間，取樣進(jìn)行HPLC糖譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢钥闯觯珺2301乳糖酶具有催化乳糖底物轉(zhuǎn)化為GOS的能力，最高轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到54.5%；B2301乳糖酶水解乳糖的能力較低，僅生成較低水平的游離葡萄糖(圖3)。

圖3 B2301乳糖酶合成GOS的高能力

基于GOS依賴性生物量相關(guān)關(guān)系，建立了乳糖酶半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活力的高通量篩選方法。現(xiàn)有乳糖酶酶活力測(cè)定方法[14-18]主要包括：1)使用天然底物乳糖，通過(guò)檢測(cè)葡萄糖和/或半乳糖的生成量確定酶活力；2)使用化學(xué)合成底物，如鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，通過(guò)檢測(cè)所生成的發(fā)色產(chǎn)物生成量確定酶活力。上述方法皆基于乳糖酶的水解活性，無(wú)法應(yīng)用于乳糖酶的轉(zhuǎn)苷活性的檢測(cè)與篩選。HPLC是目前定量檢測(cè)GOS組成與含量的基本方法，但操作成本與操作時(shí)限無(wú)法滿足高通量篩選目的[11,19]。本文首次報(bào)道了基于GOS-指示菌生物量相關(guān)關(guān)系的高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶的高通量篩選方法，成功用于具有轉(zhuǎn)苷活性的乳糖酶產(chǎn)生菌株的篩選，此方法也將有助于后續(xù)乳糖酶的轉(zhuǎn)苷活性分子進(jìn)化突變庫(kù)的高通量篩選。

3 結(jié)論

基于GOS-生物量相關(guān)關(guān)系，建立了一種高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶的高通量快速篩選方法，成功運(yùn)用此方法進(jìn)行了3 700余株細(xì)菌分離物的篩選并獲得高轉(zhuǎn)苷活性乳糖酶產(chǎn)生菌。