秀珍菇粉對H22荷瘤小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用研究

呂建敏，龔金炎，劉士旺

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所，杭州 310053； 2. 浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院/輕工學(xué)院，杭州 310023)

原發(fā)性肝癌位居全球腫瘤死亡率第2位[1]，常用的手術(shù)和西藥療法存在療效欠佳且藥物不良反應(yīng)嚴重等問題，而副作用較小的中草藥抗癌制劑在腫瘤輔助治療中具有獨特優(yōu)勢[2]。小鼠肝癌22(H22)是最常用的小鼠可移植性腫瘤細胞系之一，廣泛用于腫瘤動物模型復(fù)制，在中草藥抗腫瘤藥效學(xué)評價中發(fā)揮著重要作用[3-5]。秀珍菇Pleurotusgeesteranus是一種珍稀的藥食兼用食用菌，隸屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬[6]，研究發(fā)現(xiàn)，秀珍菇中所含多糖具有抗氧化、抗炎、抗衰老、保護肝等藥理功效[7-10]。盡管目前已利用H22荷瘤小鼠模型證實許多藥食兼用食用菌及其提取物具有抗腫瘤功效，且其抑瘤作用主要源于食用菌中的活性成分對機體免疫和抗氧化功能的改善[11-13]，但對秀珍菇的相關(guān)研究仍主要集中在多糖提取及其他藥理作用上[7-10]，還鮮有秀珍菇抗腫瘤作用的報道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，秀珍菇粉具有增強機體免疫功能和抗氧化的作用(尚未發(fā)表)，據(jù)此推測，秀珍菇可能也具有抗腫瘤功效。因此，本研究使用H22荷瘤小鼠模型，研究秀珍菇體內(nèi)抗腫瘤作用效果和機制，旨在為后續(xù)秀珍菇藥品和功能食品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 秀珍菇粉

新鮮秀珍菇由浙江省縉云縣珍稀食用菌專業(yè)合作社生產(chǎn)，并由浙江科技學(xué)院劉士旺教授鑒定。將新鮮秀珍菇于50 ～ 70℃下烘8 h，磨成粉末，過40目篩后裝在封口袋中放置于陰涼干燥處保存。秀珍菇粉末主要營養(yǎng)成分經(jīng)綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司檢測，結(jié)果見表1。

表1 秀珍菇粉主要營養(yǎng)成分表Table 1 Nutrient values of Pleurotus geesteranus fuit body powder

1.1.2 實驗動物與瘤株

60只雄性SPF級ICR小鼠，年齡為4周齡，體重為17 ～ 20 g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司【SCXK(滬)2018-0006】。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心SPF級動物實驗室【SYXK(浙)2018-0012】。飼養(yǎng)期間各組小鼠自由飲水，飼喂小鼠維持飼料由儀征安利卯生物科技有限公司提供。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，相對濕度40% ～ 70%，溫度控制在22 ～ 25℃，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。所有操作均符合浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心動物實驗倫理學(xué)要求(審批號：IACUC 2018091705)。H22小鼠肝癌瘤株購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心傳代保種。

1.1.3 試劑與儀器

環(huán)磷酰胺(CTX，Meilunbio，M0915A)；注射用氯化鈉(浙江國鏡藥業(yè)有限公司，B18050702)；小鼠免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)、小鼠細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-2)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(南京建成生物公司，20181206)；SOD、GSH-Px、CAT和MDA檢測試劑盒(南京建成生物公司，批號分別為20181207、20180817、20181205、20181208)。

電子天平(JJ300，常熟雙杰測試儀器廠)；電子分析天平(Mettler Toledo，瑞士)。酶標儀(BIO-RAD，美國)。MICROM AP-280組織包埋機、MICROM HM-335E型輪轉(zhuǎn)切片機(MICROM，德國)；LEICA染色機(LEICA，瑞士)，NanoZoomer -2.0RS數(shù)字切片掃描儀(濱松光電，日本)。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤小鼠實體瘤模型的建立

按常規(guī)方法復(fù)蘇H22小鼠肝癌細胞，取0.2 mL細胞懸液注射到雄性ICR小鼠腹腔內(nèi)，連續(xù)傳兩代獲得H22腹水瘤小鼠，用于本實驗。依據(jù)參考文獻[12, 14]的方法，在超凈工作臺中，取H22腹水瘤小鼠的腹水，經(jīng)生理鹽水清洗后稀釋成濃度為 1×106/mL細胞懸液，按每只0.2 mL接種劑量接種于經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后的ICR小鼠左側(cè)腋部皮下。

1.2.2 分組、給藥

ICR小鼠接瘤24 h后隨即分組，即模型組(Modle)、環(huán)磷酰胺陽性藥組(CTX)、秀珍菇低(PGP-L)、中(PGP-M)、高(PGP-H)劑量組，每組10只小鼠，另取10只正常小鼠作為空白對照組(Blank)。依據(jù)參考文獻[12,15]設(shè)置CTX和秀珍菇給藥劑量，空白組不給藥及生理鹽水，模型組灌服生理鹽水，陽性藥組隔天按20 mg/kg 體重的劑量腹腔注射CTX生理鹽水溶液，秀珍菇低、中、高劑量組分別按750、1500和3000 mg/kg 體重每天劑量灌服秀珍菇粉生理鹽水混懸液。各組小鼠接種瘤株后第2天開始給藥，給藥容量為 0.2 mL/10 g，連續(xù)給藥10 d。

1.2.3 腫瘤抑制率和臟器指數(shù)測定

末次給藥24 h后麻醉處死小鼠，剝?nèi)×鰤K，取脾、胸腺，稱重并計算抑瘤率和免疫器官臟器指數(shù)。腫瘤生長抑制率=(模型組平均瘤重 - 給藥組平均瘤重)/ 模型組平均瘤重×100%；臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/體重質(zhì)量(g)×100。

1.2.4 血清免疫球蛋白和細胞因子測定

實驗結(jié)束，小鼠頜下靜脈取血，分離血清，參照試劑盒說明書，利用酶聯(lián)免疫(ELISA)法測定小鼠血清中 IgA，IgG和 IgM含量及TNF-α，IL-6和IL-2的含量。

1.2.5 肝、腎組織抗氧化指標測定

麻醉處死小鼠，取肝、腎，制備肝、腎勻漿，參照試劑盒說明書，利用酶標儀測定分別測定小鼠肝、腎中SOD，GSH-Px和CAT的活性及MDA含量。

1.2.6 腫瘤和脾的組織病理學(xué)觀察

分別取各組小鼠瘤塊和脾，置于4%中性甲醛固定，將固定好的組織用常規(guī)石蠟包埋，再將石蠟包埋塊切片、脫蠟，進行HE染色，最后用數(shù)字切片掃描儀對切片進行圖像掃描。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 H22荷瘤小鼠模型成模和帶瘤生存情況

自接種H22瘤株第3天起，所有荷瘤小鼠腋窩處均出現(xiàn)明顯瘤組織，并逐天增大，表明模型復(fù)制成功。在實驗期間，所有荷瘤小鼠無自然死亡情況。

2.2 小鼠平均瘤重和腫瘤抑制率

由表2可見，陽性藥組及秀珍菇各劑量組小鼠平均瘤重均極顯著低于與模型組(P< 0.01)；腫瘤抑制率以陽性藥組最高、秀珍菇高、中劑量組次之，秀珍菇低劑量組最低。

2.3 小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)

由圖1可見，與空白組比較，模型組、陽性藥組和秀珍菇各劑量組小鼠脾指數(shù)均極顯著升高(P< 0.01)，陽性藥組小鼠胸腺指數(shù)顯著降低(P< 0.05)。秀珍菇各劑量組小鼠的脾和胸腺指數(shù)都有高于陽性藥組的趨勢，其中高劑量組的脾指數(shù)與陽性藥組比較有顯著性差異(P< 0.05)。

表 2 秀珍菇粉對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的的影響Table 2 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on growth of tumor in H22 tumor-bearing mice

注：同列數(shù)值肩標上無字母或有相同字母表示差異不顯著(P> 0.05)，肩標上小寫字母不同表示差異顯著(P< 0.05)，肩標上大寫字母不同表示差異極顯著(P< 0.01)。下表同。

Note. In the same line, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P> 0.05), while values with different small letter superscripts mean significant difference (P< 0.05), and with different capital letter superscripts mean very significant difference (P< 0.01). The same in the flowing tables.

注：各組間比較，小寫字母不同表示差異顯著(P< 0.05)，大寫字母不同表示差異極顯著(P< 0.01)。圖1 秀珍菇粉對H22荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Note. Compared among groups, values with different small letter superscripts mean significant difference (P< 0.05), and with different capital letter superscripts mean very significant difference (P< 0.01).Figure 1 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on spleed and thymus indices of H22 tumor-bearing mice

2.4 小鼠血清免疫球蛋白及細胞因子含量

由表3可知，與空白組比較，模型組小鼠血清IgA和TNF-α含量顯著升高(P< 0.01，P< 0.05)，模型組和秀珍菇中劑量組小鼠血清IL-2含量顯著降低(P< 0.01，P< 0.05)，模型組和秀珍菇低、中劑量組小鼠血清IL-6含量有上升趨勢(P> 0.05)。與模型組比較，陽性藥組和秀珍菇各劑量組小鼠血清IgA和TNF-α含量顯著降低(P< 0.01，P< 0.05)，陽性藥組和秀珍菇低劑量組小鼠血清IL-2含量顯著升高(P< 0.05)，秀珍菇高劑量組小鼠血清IL-6含量也顯著低于模型組(P< 0.05)。

2.5 小鼠肝組織抗氧化指標

由表4可知，與空白組比較，模型組小鼠肝MDA含量顯著升高(P< 0.05)，GSH-Px和CAT活力極顯著降低(P< 0.01)；陽性藥組和秀珍菇各劑量組小鼠肝GSH-Px活性顯著降低(P< 0.05，P< 0.01)。與模型組比較，陽性藥組、秀珍菇各劑量組小鼠肝CAT活性均顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)，秀珍菇中、高劑量組肝GSH-Px活力顯著高于模型組(P< 0.05)，而秀珍菇中劑量組小鼠肝MDA含量顯著低于模型組(P< 0.05)。

2.6 小鼠腎組織抗氧化指標

由表5可知，模型組小鼠腎組織SOD、GSH-Px和CAT活性均顯著低于空白組(P< 0.01，P< 0.05，P< 0.01)。與模型組比較，陽性藥組和秀珍菇各劑量組小鼠腎SOD和CAT活性極顯著升高(P<0.01)，秀珍菇低、中劑量組小鼠腎GSH-Px活性也顯著高于模型組(P< 0.05)。

2.7 荷瘤小鼠腫瘤細胞形態(tài)學(xué)觀察

由圖2可見，模型組腫瘤細胞形狀多呈橢圓形，體積大小不同，且排列密集，極少有出血壞死情況；CTX組的腫瘤細胞排列松散且呈不規(guī)則變形，多數(shù)腫瘤細胞破裂有明顯的胞漿溢出；秀珍菇各劑量組均可觀察到有腫瘤壞死細胞，且細胞形狀不規(guī)則，特別是秀珍菇中、高劑量組出現(xiàn)細胞破裂、壞死細胞堆積的情況較為明顯。

表 3 秀珍菇粉對H22荷瘤小鼠血清免疫球蛋白及細胞因子含量的影響Table 3 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on serum contents of immunoglobulins and cytokines in H22 tumor-bearing mice

表 4 秀珍菇粉對H22荷瘤小鼠肝組織抗氧化指標的影響Table 4 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on antioxidant indices in liver of H22 tumor-bearing mice

表 5 秀珍菇粉對H22荷瘤小鼠腎組織抗氧化指標的影響Table 5 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on antioxidant indices in kidney of H22 tumor-bearing mice

2.8 小鼠脾組織形態(tài)學(xué)觀察

由圖3可見，空白組小鼠脾細胞排列正常，紅髓與白髓兩者分界清晰，模型組和秀珍菇各劑量組小鼠脾細胞均較空白組增多，模型組脾紅髓與白髓分界模糊，CTX組和秀珍菇低劑量部分區(qū)域出現(xiàn)脾紅髓與白髓模糊不清現(xiàn)象，秀珍菇中、高劑量組脾紅髓與白髓兩者分界較清晰。

3 討論

3.1 秀珍菇對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用

食用菌抗腫瘤作用及有效成分提取近年來備受關(guān)注[16]，已有研究表明，香菇、灰樹花、猴頭菇、靈芝等藥食兼用食用菌均具有抗腫瘤功效[11-12, 17-18]，并發(fā)現(xiàn)食用菌中多糖是主要抑瘤活性成分[11,19]。目前有關(guān)秀珍菇及其提取物的藥理作用研究主要側(cè)重于抗氧化、抗炎、保護肝等方面[7-9]，很少涉及抗腫瘤作用研究，因此，我們在前期研究發(fā)現(xiàn)秀珍菇粉具有抗氧化、增強免疫功能的基礎(chǔ)上(還未發(fā)表)，進一步研究秀珍菇的抑瘤功效。本研究首先建立H22荷瘤小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠腋部接種H22瘤株3 d后即出現(xiàn)明顯腫塊，病理切片觀察結(jié)果顯示模型組小鼠腫瘤細胞呈橢圓形，且排列密集，表明腫瘤模型建立成功。研究還發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量秀珍菇均具有的抑瘤效果，秀珍菇中、高劑量組抑瘤率分別達到47.47%和48.80%，已接近陽性藥CTX的抑瘤效果(55.08%)，符合抗腫瘤中草藥有效性的標準(抑瘤率 > 30%)要求[20]。從病理切片上也觀察到荷瘤小鼠經(jīng)秀珍菇處理后出現(xiàn)了腫瘤細胞壞死，且壞死區(qū)域明顯增加現(xiàn)象，充分驗證了秀珍菇的抑瘤效果。

3.3 秀珍菇對H22荷瘤小鼠的免疫功能影響

脾指數(shù)和胸腺指數(shù)分別反映體液和細胞免疫功能[3]。本試驗發(fā)現(xiàn)小鼠荷瘤后脾過度增大，脾細胞明顯增多，這與荷瘤后各類免疫細胞轉(zhuǎn)移至脾后滯留有直接的關(guān)系[21]。環(huán)磷酰胺(CTX)主要通過免疫抑制來發(fā)揮抗腫瘤作用[22]，本試驗結(jié)果顯示，CTX組小鼠胸腺指數(shù)顯著低于空白組，脾指數(shù)有低于模型組趨勢，且脾紅髓與白髓模糊不清，而秀珍菇各劑量組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均高于CTX組，且秀珍菇中、高劑量組小鼠脾紅髓與白髓兩者分界也較清晰，說明秀珍菇抗腫瘤機制與CTX不同，可能是通過保護免疫器官提高機體免疫力來達到抑瘤固本效果。

圖2 H22荷瘤小鼠腫瘤細胞 HE 染色切片(×200)Figure 2 HE stained sections of tumor cells from H22 tumor-bearing mice (×200)

圖3 小鼠脾細胞HE染色切片(×200)Figure 3 HE stained sections of spleen cells in mice (× 200)

免疫球蛋白是反映機體體液免疫功能指標。研究顯示動物荷瘤后血清免疫球蛋白會發(fā)生異常表達，導(dǎo)致功能失調(diào)[23]。本試驗發(fā)現(xiàn)小鼠荷瘤后血清IgA含量異常升高，而秀珍菇能顯著降低荷瘤小鼠血清IgA水平，說明秀珍菇對荷瘤小鼠體液免疫功能也具有調(diào)節(jié)作用。

TNF-α、IL-2和IL-6等細胞因子通過結(jié)合相應(yīng)受體調(diào)節(jié)細胞生長、分化，調(diào)控免疫應(yīng)答[24]。一定濃度范圍內(nèi)的TNF-α具有組織修復(fù)功能，但TNF-α濃度異常升高可引起組織損傷[25]。很多腫瘤細胞會產(chǎn)生TNF-α，反過來TNF-α和IL-6等炎性因子又可刺激腫瘤生長[24]。而IL-2可促進T細胞和自然殺傷細胞功能，在抑制腫瘤細胞生長的特異性免疫反應(yīng)中起重要作用[26]。在本試驗中，小鼠荷瘤后，出現(xiàn)血清TNF-α含量顯著上升，IL-2含量顯著下降，IL-6含量有上升趨勢等異常改變，而經(jīng)秀珍菇處理后，上述異常改變得到逆轉(zhuǎn)，說明秀珍菇對荷瘤小鼠細胞因子水平具有正向調(diào)節(jié)作用。

3.3 秀珍菇對H22荷瘤小鼠肝、腎組織抗氧化能力的影響

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與宿主的自由基水平及其代謝產(chǎn)物有關(guān)[27-28]。SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶活性降低會導(dǎo)致機體清除自由基能力下降，引起氧自由基和MDA的堆積，造成機體損傷[29]。本試驗觀察到，小鼠荷瘤后，肝MDA含量顯著上升，肝和腎部分抗氧化酶活性顯著降低，而與模型組比較，秀珍菇各劑量組小鼠肝CAT活性及腎SOD和CAT活性顯著升高，秀珍菇中、高劑量組小鼠肝GSH-Px活力及低、中劑量組腎GSH-Px活性均顯著升高，而秀珍菇中劑量組小鼠肝MDA含量顯著降低，表明秀珍菇能顯著提高荷瘤小鼠抗氧化能力，并能清除過量表達自由基，從而起到抑制腫瘤生長和保護正常組織作用。

綜上所述，秀珍菇可顯著降低荷瘤小鼠平均瘤重，具有較好的抑腫瘤作用，并具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)功能。由此推測秀珍菇抗腫瘤的可能機制為：通過提高機體抗氧化能力，清除體內(nèi)過量自由基，下調(diào)異常升高的血清TNF-α和IL-6水平，減輕自由基和高濃度炎性細胞因子對組織損傷，進而改善機體在荷瘤狀態(tài)下的免疫細胞活性，抑制腫瘤生長；同時通過上調(diào)血清IL-2水平, 間接提高T細胞和NK細胞活性，促進腫瘤細胞壞死和凋亡，最終達到抗腫瘤效果。秀珍菇體內(nèi)抗腫瘤作用也可能還有其他作用機制，尚需進一步研究。