田 翔,程崟家,張愛清
(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,武漢 4330074)
癌癥是當(dāng)今世界上大多數(shù)國家非常棘手的一大難題。目前傳統(tǒng)的癌癥治療方法有化療、放療、和手術(shù)切除法。但是以上方法各有利弊,例如:在傳統(tǒng)的化療過程中,由于抗癌藥物本身缺乏對癌細(xì)胞的治療特異性,因此在治療腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會對正常細(xì)胞造成損傷;放療的治療設(shè)備昂貴,其中的射線對病人的身體往往會造成很大的傷害;手術(shù)切除法雖然能夠去掉比較大的腫瘤,但是對于頭部腫瘤和心臟腫瘤等,手術(shù)難度極大,風(fēng)險(xiǎn)太高。隨著科技的發(fā)展,出現(xiàn)許多新型的癌癥治療方式,如光動(dòng)力治療(PDT)[1]、光熱治療、基因治療和免疫治療等。其中,PDT主要利用特定光誘導(dǎo)光敏劑產(chǎn)生活性氧簇(ROS),通過ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死,這種新型癌癥治療手段相較于傳統(tǒng)的癌癥治療手段,具有一系列優(yōu)勢,包括對表面皮膚腫瘤的高效性和無創(chuàng)性,利用光控制的對腫瘤區(qū)域和時(shí)間的可選擇性,以及可以重復(fù)治療的特性,因此在腫瘤高效治療方面獲得巨大優(yōu)勢。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2-5],單線態(tài)氧作為ROS家族中的成員,能夠破壞腫瘤血管,激活針對腫瘤的免疫反應(yīng),最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但是單線態(tài)氧的半衰期短(<40 ns),作用范圍有限(<20 nm)[6-7]。此外,常用的光敏劑如原卟啉(PpIX)、二氫卟吩等,雖然在特定波長的光照下能夠產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧(1O2),從而發(fā)揮PDT效應(yīng),但是其在水中的溶解性較差,不能有效靶向到腫瘤區(qū)域,因此嚴(yán)重影響其在生物體內(nèi)進(jìn)一步發(fā)揮PDT治療的效果。針對以上問題,如何將光敏劑運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞及其亞細(xì)胞器內(nèi),進(jìn)而有效提高PDT的治療效果的策略正在被廣泛研究[6,8-11]。
本文設(shè)計(jì)并合成了一種能夠靶向進(jìn)入癌細(xì)胞線粒體的兩親性嵌合肽 PpIX-GGK(TPP)G-GFLG-R8GD(PTGR),利用其在水溶液中能夠發(fā)生自組裝行為,從而得到以疏水性光敏劑為內(nèi)核,親水性多肽為外殼的兩親性前藥膠束,實(shí)現(xiàn)對疏水性光敏劑PpIX的有效負(fù)載。該前藥膠束主要利用靶向肽RGD特異性識別整合素αvβ3受體過度表達(dá)的HeLa細(xì)胞,并在R8肽的協(xié)助下快速穿膜進(jìn)入細(xì)胞。在癌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)過度表達(dá)的組織蛋白酶B的作用下,GFLG肽能夠發(fā)生特異性酶解斷裂[12],從而導(dǎo)致膠束結(jié)構(gòu)遭到破壞。在特定光照下,修飾在多肽側(cè)鏈上的三苯基膦(TPP)能協(xié)助光敏劑PpIX有效富集在癌細(xì)胞線粒體周圍,并產(chǎn)生大量活性氧,從而破壞癌細(xì)胞線粒體,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡或壞死。本文設(shè)計(jì)的嵌合肽具有較好的生物相容性和生物降解性,能夠避免不良的免疫反應(yīng)。此外,該兩親性嵌合肽可以提高將光敏劑靶向運(yùn)輸?shù)桨┘?xì)胞及其亞細(xì)胞器的能力,進(jìn)而有效提高腫瘤的PDT治療效果。
二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、甲醇、哌啶、二異丙基乙胺(DIEA)、三異丙基硅烷(TIS)、乙醚、水合肼、三氟乙酸、氫氧化鈉、無水硫酸鎂,國藥基團(tuán)化學(xué)試劑公司;Fmoc-Lys(Dde)-OH(K)、Fmoc-Gly-OH(G)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(R)、Fmoc-Leu-OH(L)、Fmoc-Phe-OH(F)、Fmoc-Lys(Dde)-OH(K)、Fmoc-Asp(OtBu)-OH(D)、1-羥基苯并三氮唑(HOBt)、苯并三氮唑-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、2-氯-三苯甲基氯樹脂(2-Chlorotrityl chloride resin),上海吉爾生化公司;2,7-二氯熒光素二乙酯(DCFH-DA),碧云天生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、胎牛血清(FBS),Gibco公司;噻唑藍(lán)(MTT), Geneview公司;4-羧丁基三苯基溴化膦(TPP)、原卟啉(PpIX),阿拉丁試劑有限公司。
熒光分光光度計(jì)(RF-5301 PC,日本島津公司);紫外分光光度計(jì)(Lambda Bio 40,美國鉑金埃爾默公司);超分辨顯微鏡(德國徠卡公司);納米粒度電位儀(Nano ZS ZEN3600,英國馬爾文公司);透射式電子顯微鏡(Tecnai G2 F20 S-TWIN,美國FEI公司);基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF,美國布魯克·道爾頓公司)。
1.2.1 PTGR的合成
PTGR的合成路線如圖1所示。取三苯甲基氯樹脂(0.8 g,0.97 mmol/g)于多肽固相合成柱中,加入適量DMF進(jìn)行溶脹45 min,溶脹結(jié)束后進(jìn)行抽濾。向多肽固相合成柱中加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3當(dāng)量)和DIEA(6當(dāng)量)的DMF混合液,反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后抽出濾液,并用DMF洗滌4次。然后向多肽固相合成柱中加入含有30%哌啶的DMF溶液反應(yīng)10 min,抽取濾液,脫除FMOC保護(hù)基團(tuán)。隨后向多肽固相合成柱中加入Fmoc-Gly-OH(2當(dāng)量),HBTU(2.4當(dāng)量),HOBt(2.4當(dāng)量)和DIEA(2 mL)的DMF混合液,反應(yīng)2 h,進(jìn)行抽濾,并用DMF洗滌數(shù)次。重復(fù)以上脫保護(hù)、洗滌和縮合步驟,至合成的嵌合肽序列為PpIX-GGK(Dde)G-GFLG-R8GD。接著向固相合成柱中加入含有20%水合肼的DMF溶液反應(yīng)5 min,抽取濾液,重復(fù)反應(yīng)8次,脫去Dde保護(hù)基團(tuán),用DMF洗滌數(shù)次至水合肼被完全洗掉。加入4-羧丁基三苯基溴化膦(4當(dāng)量),HBTU(4.8當(dāng)量),HOBt(4.8當(dāng)量)和DIEA(2 mL)的DMF混合液,反應(yīng)2 h后抽濾。然后用DMF、甲醇、二氯甲烷洗滌數(shù)次,真空干燥。干燥后,向反應(yīng)器中加入切落劑(體積占比為95% TFA、2.5% H2O、2.5% TIS)反應(yīng)100 min后,收集濾液,經(jīng)過旋蒸濃縮后,用冷乙醚沉淀后離心,真空干燥24 h,得到嵌合肽分子。多肽酶解前后的分子量均通過MALDI-TOF測得。
圖1 PTGR的合成路線
1.2.2 PTGR電勢和粒徑的測定
配置100 μg/mL的PTGR水溶液,取1 mL PTGR溶液裝入測試池內(nèi),使用納米粒度電位儀檢測其電勢和粒徑。
1.2.3 PTGR形貌的觀測
配置150 μg/mL的PTGR水溶液,取10 μL的PTGR溶液滴到銅網(wǎng)上,靜置一段時(shí)間后,用新配好的3%的磷鎢酸水溶液進(jìn)行負(fù)染,用TEM觀測其形貌。
1.2.4 PTGR臨界膠束溶度(CMC)的測定
兩親性嵌合肽膠束的CMC[13-14]是以芘為疏水性熒光探針,由熒光分光光度計(jì)測得。精確稱量9.7 mg芘,使其溶于10 mL丙酮,然后稀釋至4.6×10-6mol/L。向已配好的一系列濃度的3.6 mL PTGR溶液加入45 μL已配好的芘的丙酮溶液。將配置好的樣品放入搖床(150 r/min 37 ℃)震蕩24 h,讓丙酮完全揮發(fā)。利用熒光分光光度計(jì)測定溶液在360~400 nm范圍內(nèi)的激發(fā)光譜,設(shè)定激發(fā)波長為342 nm,發(fā)射光和激發(fā)光的狹縫狹縫寬度均為5 nm。記錄一系列濃度的溶液在393 nm與374 nm處的熒光強(qiáng)度。以兩個(gè)位置的熒光強(qiáng)度比值作為縱坐標(biāo),以溶液濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖,找出兩條直線的交點(diǎn)對應(yīng)的橫坐標(biāo)值,從而計(jì)算得到該膠束的臨界膠束濃度(CMC)。
1.2.5 PpIX紫外標(biāo)曲的測定
配置一系列不同濃度的PpIX的混合溶液(體積占比為1% DMSO、99% H2O),以純水的紫外可見光吸收光譜為基線,利用紫外分光光度計(jì)檢測PpIX溶液在300~650 nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜。記錄一系列濃度梯度的溶液在400 nm處的吸光度,以吸光度的強(qiáng)度作為縱坐標(biāo),PpIX溶液的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo),從而得到PpIX的紫外標(biāo)曲。
1.2.6 PTGR單線態(tài)氧產(chǎn)生性能表征
通過DCFH-DA檢測混合溶液在光照下525 nm處的熒光值的升高來表征單線態(tài)氧的產(chǎn)生,將DCFH-DA用0.01 mol/L NaOH處理0.5 h使其轉(zhuǎn)化成DCFH。配置兩組100 μg/mL的PTGR水溶液,隨后加入提前處理好的探針DCFH,使DCFH的最終溶度為20 μmol/L。將第一組材料溶液置于680 nm激光(30 mW/cm2)下照射,每隔一定時(shí)間用熒光分光光度計(jì)測定在488 nm激發(fā)波長下,PTGR溶液在525 nm處的熒光強(qiáng)度值。第二組材料在避光條件下重復(fù)上述熒光檢測的方法。
1.2.7 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
(1)共聚焦觀測細(xì)胞對材料的內(nèi)吞
將人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、非洲綠猴腎細(xì)胞(COS 7)分別接種到共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h,加入相當(dāng)于5 μg/mL的PpIX的PTGR溶液。培養(yǎng)4 h后,向培養(yǎng)皿中加入Hoechst33324染色30 min,用PBS洗滌培養(yǎng)皿3次,并通過超分辨顯微鏡觀測(激發(fā)波長:488 nm,PpIX接收通道:(630±10)nm。
(2)共聚焦光測材料靶向細(xì)胞線粒體
將人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)接種于共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h,加入相當(dāng)于5 μg/mL的PpIX的PTGR 溶液。培養(yǎng)4 h后,向培養(yǎng)皿中加入線粒體染料Mito Tracker Green染色30 min,用PBS洗滌3次,并通過超分辨顯微鏡觀測(激發(fā)波長488 nm,PpIX接收通道(630±10)nm,Mito Tracker Green接收通道(540±10)nm)。
(3)共聚焦觀測細(xì)胞內(nèi)的ROS生成
將HeLa細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h,加入含有5 μg/mL的PpIX的PTGR溶液。培養(yǎng)4 h后,加入DCFH,使DCFH在培養(yǎng)皿內(nèi)的最終濃為20 μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)30 min后,在680 nm激光(30 mW/cm2)下照射1 min,用PBS洗滌三次培養(yǎng)皿,并立即通過超分辨顯微鏡觀測(激發(fā)波長488 nm,接收通道(525±10)nm)。
(4)共聚焦光測細(xì)胞線粒體損傷
將HeLa細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h,加入相當(dāng)于5 μg/mL的PpIX的PTGR 溶液。培養(yǎng)4 h后,加入染料JC-1染色30min,在680 nm激光(30 mW/cm2)下照射1 min,用PBS洗滌3次,并通過超分辨顯微鏡觀測(激發(fā)波長488 nm,monomeric JC-1接收通道(520±10)nm,aggregated JC-1接收通道(580±10)nm)。
如圖2(a),利用MALDI-TOF對合成的PTGR進(jìn)行了表征。PTGR的理論分子量是3081,MALDI-TOF結(jié)果顯示該材料的分子量為3081,此分子量和理論分子量一致,證明了PTGR的成功合成。如圖2(b),利用MALDI-TOF對酶解24 h后的PTGR 進(jìn)行表征,與酶解前的相比,新出現(xiàn)了分子量為500、1 284和1 498的3個(gè)峰與PTGR含有的多肽片段LGRR、R7GD和GR8GD分子量相吻合,表明了PTGR 能夠被組織蛋白酶B瓦解。利用TEM觀測PTGR在水溶液中的自組裝形貌,由圖3(a)所示,不難發(fā)現(xiàn),PTGR通過自組裝形成了尺寸在60 nm左右的球形納米顆粒,分布比較均勻,表明鍵接上PpIX的多肽自組裝結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定,具有較好的分散性。此外,利用納米粒度電位儀分別檢測PTGR材料的電勢和粒徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)進(jìn)一步表明PTGR在水中能夠有效組裝成尺寸為140 nm左右的納米粒子,而且表面電勢為+21.1 mV,有助于PTGR快速穿過細(xì)胞膜進(jìn)入癌細(xì)胞。其中,TEM觀測到的納米顆粒尺寸比納米粒度電位儀檢測出的粒徑小,是由于PTGR在TEM測的是其干態(tài)下的納米粒徑,而納米粒度電位儀表征的是其水合粒徑[15]。據(jù)報(bào)道[16],具有兩親性結(jié)構(gòu)的納米材料在一定濃度的條件下會自組裝形成膠束,同時(shí)將芘包埋在其疏水性內(nèi)核中,從而引起芘的熒光發(fā)生變化。因此,用疏水性的芘做為熒光探針,對PTGR的CMC進(jìn)行測定,如圖3(b)所示,PTGR的CMC值是1.5 μg/mL,表明PTGR在極低的濃度下能夠自組裝形成膠束,且納米膠束的結(jié)構(gòu)緊湊。如圖3(c)所示,利用紫外分光光度計(jì)對PpIX的濃度進(jìn)行標(biāo)定,得到PpIX的紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而標(biāo)定PTGR中的PpIX含量。
圖2 (a)PTGR及(b)PTGR酶解后的質(zhì)譜
表1 PTGR的粒徑和電勢
圖3 PTGR的(a)透射式電子顯微鏡圖像,(b)臨界膠束濃度(CMC)和(c)PpIX 的紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖4 PTGR溶液分別在避光和680 nm激光(30 mW/cm2)誘導(dǎo)條件下,DCF在525 nm處的熒光強(qiáng)度隨光照時(shí)間的變化
最后對PTGR產(chǎn)生ROS的性能進(jìn)行了探究,如圖4所示,通過熒光分光光度計(jì)檢測,發(fā)現(xiàn)在360 s內(nèi),在680 nm激光的誘導(dǎo)下,PTGR溶液在525 nm處的熒光強(qiáng)度比初始的熒光強(qiáng)度高了20倍,而避光條件下的PTGR溶液在525 nm處的熒光強(qiáng)度變化較小。表明PTGR在特定波長的激光誘導(dǎo)下,能夠在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS,從而具備殺死細(xì)胞的潛力。而在避光的情況下,產(chǎn)生的ROS較少,則對細(xì)胞的毒性較小。因而可以通過光照時(shí)間的長短和光照區(qū)域的不同,控制PTGR產(chǎn)生ROS的量和位置,從而發(fā)揮光動(dòng)力治療。
2.2.1 對癌細(xì)胞靶向能力的檢測
由圖5可知,HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核周圍出現(xiàn)了大量的PpIX的紅色熒光,而COS 7細(xì)胞的細(xì)胞核周圍的紅色熒光較少。這是由于PTGR中含有靶向肽RGD,能夠識別HeLa細(xì)胞表面過度表達(dá)的整合素αvβ3,在穿膜肽R8的引導(dǎo)下,光敏劑PpIX能夠快速被運(yùn)輸?shù)紿eLa細(xì)胞內(nèi)。由于HeLa細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)的組織蛋白酶B能有效切斷GFLG序列,最終導(dǎo)致PTGR膠束瓦解并釋放出PpIX。但是,正常細(xì)胞COS 7表面表達(dá)整合素αvβ3較少,導(dǎo)致出現(xiàn)在COS 7細(xì)胞內(nèi)的PpIX較少。該實(shí)驗(yàn)證明PTGR能夠有效的被癌細(xì)胞內(nèi)吞并釋放出PpIX。
圖5 PTGR分別與HeLa細(xì)胞和COS 7細(xì)胞共同培養(yǎng)4 h的共聚焦顯微鏡圖像。比例尺:20 μm
2.2.2 對癌細(xì)胞線粒體靶向能力的檢測
如圖6所示,PpIX的紅色熒光與Mito track green的綠色熒光能夠很好的重合,這是由于PTGR材料經(jīng)過HeLa細(xì)胞內(nèi)吞后釋放PpIX,隨后在TPP的引導(dǎo)下,PpIX能有效到達(dá)HeLa細(xì)胞的線粒體周圍。這為PTGR在亞細(xì)胞器周圍發(fā)揮光動(dòng)力治療提供了可能。
圖6 PTGR靶向線粒體的能力,綠色熒光為Mito Tracker Green,紅色熒光為PpIX。比例尺:20 μm
2.2.3 對PTGR在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS性能的檢測
如圖7所示,實(shí)驗(yàn)組的HeLa細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈的DCF的綠色熒光,這是由于PTGR在680 nm波長的激光光照下產(chǎn)生大量的ROS,將不發(fā)光的DCFH氧化為發(fā)綠色熒光的DCF。而空白組和對照組培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞中幾乎沒有綠色熒光區(qū)域,表明避光條件下的PTGR在細(xì)胞內(nèi)基本沒有產(chǎn)生ROS。上述實(shí)驗(yàn)表明,PTGR可以通過光誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS,而ROS具有殺死癌細(xì)胞的能力。由此證明PTGR具有光動(dòng)力治療的潛能。
圖7 PTGR分別在避光和光照(功率密度:30 mW cm-2)條件下,在HeLa細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的情況。其中,blank為空白組。比例尺:20 μm
2.2.4 對癌細(xì)胞線粒體的損壞能力的檢測
如圖8所示,在避光條件下,HeLa細(xì)胞內(nèi)的JC-1染料基本沒有綠色熒光,隨著光照時(shí)間的增加,綠色熒光越強(qiáng),紅色熒光越弱。這是因?yàn)镻TGR釋放的PpIX富集在HeLa細(xì)胞的線粒體周圍,并通過激光誘導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS,有效破壞 HeLa細(xì)胞的線粒體。此外,隨著光照時(shí)間增加,PTGR對線粒體的破壞越大。以上實(shí)驗(yàn)表明PTGR能夠在光照條件下,有效破壞癌細(xì)胞的線粒體,從而實(shí)現(xiàn)光動(dòng)力治療的目的。
圖8 PTGR隨光照時(shí)間對線粒體的破壞,綠色熒光為Aggregated JC-1,紅色熒光為Monomeric JC-1。比例尺:20 μm
(1)本文通過合理設(shè)計(jì)多肽序列,利用多肽的固相合成法,成功合成得到含有光敏劑PpIX的兩親性嵌合肽PTGR。PTGR在水中能夠發(fā)生自組裝,得到具有核殼結(jié)構(gòu)的納米前藥膠束。
(2)膠束PTGR能主動(dòng)靶向進(jìn)入HeLa細(xì)胞,在細(xì)胞內(nèi)有效釋放出PpIX,并富集在癌細(xì)胞線粒體周圍。
(3)膠束PTGR在特定波長光照下,產(chǎn)生大量ROS,從而有效破壞癌細(xì)胞線粒體,以實(shí)現(xiàn)光動(dòng)力治療的目的。