核蛋白14對(duì)黑素瘤新生血管形成的影響及機(jī)制研究

李璟蓉 趙瑞 王康瑋 方銳華

1廣州市第一人民醫(yī)院皮膚科 510180；2廣州市第一人民醫(yī)院病理科 510180

核蛋白14（nucleolar protein 14，NOP14）是一種含有857 個(gè)氨基酸的核蛋白，是40S 核糖體成熟所必 需 的 蛋 白 質(zhì)［1?2］。 在 卵 巢 癌 患 者 血 液 中 發(fā) 現(xiàn)NOP14 表達(dá)下調(diào)，低表達(dá)的NOP14 顯著降低卵巢癌患者的總生存期［3］。體內(nèi)和體外研究表明，過(guò)表達(dá)NOP14 能夠抑制乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移［4］。但NOP14 在胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞系及臨床腫瘤組織樣本中表達(dá)水平上調(diào)，抑制NOP14 可抑制胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞的遷移和侵襲，NOP14 通過(guò)突變型p53 調(diào)控miR?15對(duì)P21的表達(dá)，從而促進(jìn)胰腺導(dǎo)管癌的生長(zhǎng)和侵襲［5］。我們的前期研究結(jié)果表明，NOP14 在黑素瘤組織中低表達(dá)，與腫瘤的大小和淋巴轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)，發(fā)揮抑制黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用［6?7］。鑒于血管形成和黑素瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的密切關(guān)系［8］，我們推測(cè)NOP14可能參與調(diào)控黑素瘤的血管新生。本研究中我們探討NOP14 表達(dá)與黑素瘤血管形成的關(guān)系，進(jìn)一步探索NOP14 抑制黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為黑素瘤的靶向治療提供新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：納入 2016 年 1 月至 2018 年 12 月在廣州市第一人民醫(yī)院經(jīng)病理確診的40 例黑素瘤患者的黑素瘤組織作為實(shí)驗(yàn)組。所有標(biāo)本均為廣州市第一人民醫(yī)院病理科留存的石蠟標(biāo)本。本研究取得廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：K?2017?107?01和 K?2017?083?01）。

2.材料：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）、黑素瘤細(xì)胞 A375 和 SK?MEL?1 產(chǎn)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。NOP14 抗體產(chǎn)自美國(guó) Proteintech 公司。CD31 抗體產(chǎn)自中國(guó)臺(tái)灣Arigo Biolaboratories 公司。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）一抗產(chǎn)自美國(guó)Abcam 公司。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗以及Western 印跡所需二抗產(chǎn)自美國(guó) Cell Signaling Technology 公司。Transwell 小室產(chǎn)自美國(guó)Corning 公司。免疫組化二抗NovoLink 聚合物檢測(cè)系統(tǒng)RE7280?K 檢測(cè)試劑盒產(chǎn)自德國(guó)Leica公司。人VEGFB 和人VEGFR 1/Flt1 ELISA 檢測(cè)試劑盒產(chǎn)自武漢華美生物工程有限公司。Lipofectamine 2000 產(chǎn)自美國(guó)Promega 公司。CCK8試劑盒產(chǎn)自日本Dojindo Molecular Technologies 公司。Trizol試劑來(lái)自美國(guó)Invitrogen公司。

3.免疫組化及結(jié)果判定：組織切片脫蠟后，按常規(guī)行抗原修復(fù)、CD31 或者NOP14 一抗孵育和顯色反應(yīng)。封片后，按照文獻(xiàn)［9］方法判讀CD31 和NOP14染色結(jié)果。NOP14染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)色為 0 分，黃色為 1 分，棕黃色為 2 分，棕褐色為 3 分；陽(yáng)性率計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：未染色為0 分，1% ～25%細(xì)胞陽(yáng)性為 1 分，26% ～ 50% 為 2 分，51% ～ 75%為3 分，＞75%為4 分。NOP14 染色強(qiáng)度計(jì)分和陽(yáng)性率計(jì)分的乘積即為NOP14 表達(dá)的總評(píng)分，總評(píng)分 1 ～ 4 分為低表達(dá)，5 ～ 8 分為中表達(dá)，9 ～ 12 分為高表達(dá)。 CD31 的染色結(jié)果以微血管密度（microvessel density，MVD）表示：以任何一個(gè)獨(dú)立的淡黃-棕褐色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞群作為1 個(gè)血管，在低倍鏡下選取血管高密度區(qū)，在400 倍視野下，分別隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個(gè)不重疊視野的微血管數(shù)，取其平均值即為每例的MVD 值。以上判讀均由3 位病理診斷醫(yī)師分別以雙盲方法綜合評(píng)估完成后取平均值，忽略組間及組內(nèi)觀察者差異。

4.NOP14 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及NOP14 siRNA合成：通過(guò)PCR 調(diào)取NOP14 的全長(zhǎng)編碼區(qū)，所需引物如下，正向引物5′? tacaagtccggactcagatctGCCACC ATGGCGAAGGCGAAGAAGG?3′和反向引物 5′?gtaccgtcgactgcagaattcTTATTTTTTGAACTTTTTCCTC TTCAG?3′?；厥?NOP14 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到pEGFP?C1 載體中，通過(guò)測(cè)序確定連接成功。靶向NOP14 的siRNA（siNOP14）序列為5′?GGAAAGAG CUGAUUGAAGA ?3′ ，陰 性 對(duì) 照 siRNA 的 序 列（siNC）為5′?AGGUGGAAAUAUGGAAGAC?3′。引物和siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

5.實(shí)驗(yàn)分組：按照上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供的方法培養(yǎng)A375和SK?MEL?1細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度50% ～ 60% 時(shí) ，將 0.5 μg NOP14 過(guò) 表 達(dá) 載 體（NOP14 組）、0.5 μg pEGFP?C1 空載體（空載體組）、50 nmol/L siNOP14（siNOP14 組）以及 50 nmol/L siNC（siNC 組）分別轉(zhuǎn)染到A375和SK?MEL?1中，轉(zhuǎn)染方法參考Lipofectamine 2000 說(shuō)明書。轉(zhuǎn)染24 h后收集以上各組 A375 和 SK?MEL?1 細(xì)胞，分別與HUVEC共培養(yǎng)作為共培養(yǎng)組。

6.熒光定量 PCR 檢測(cè) NOP14 mRNA 的表達(dá)：收集各組A375 和SK?MEL?1 細(xì)胞（約106個(gè)），Trizol試劑提取總RNA。按照前期報(bào)道的方法［6］檢測(cè)細(xì)胞中NOP14 和內(nèi)參照18S mRNA 的表達(dá)水平。采用2-△△Ct法計(jì)算NOP14 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

7.細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 8（CCK8）檢測(cè) HUVEC 增殖：將1×105HUVEC接種于Transwell小室下室，培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜；次日，上室加入各組A375和SK?MEL?1細(xì)胞200 μl（2 × 105個(gè)/ml），培養(yǎng)24 h 后，收集下室細(xì)胞及培養(yǎng)基，接種在96孔培養(yǎng)板中，分別于1、2、3 和 4 d 后，按照 CCK8 試劑盒說(shuō)明，檢測(cè) 450 nm 波長(zhǎng)處吸光度（A值）。以只加CCK8 試劑的孔作為空白孔，每組細(xì)胞的A450 值減去空白孔的A450 值作為實(shí)驗(yàn)組最終A450值，表示細(xì)胞增殖活性。

8.Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC 遷移和侵襲能力：遷移實(shí)驗(yàn)中，于Transwell 小室的下室分別加入各組 A375 和 SK?MEL?1 細(xì)胞懸液 600 μl（2 ×105個(gè)/ml），待貼壁后換成600 μl 無(wú)血清培養(yǎng)基，上室加入HUVEC 200 μl（2×104個(gè)/ml），培養(yǎng)24 h后，0.1%結(jié)晶紫染色。于200倍相差顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)5 個(gè)視野下的穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值作為遷移細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)中Transwell 上室用Matrigel 膠包被，其余步驟同上，計(jì)數(shù)5 個(gè)視野下的穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值作為侵襲細(xì)胞數(shù)。

9.Matrigel 血管擬態(tài)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的管腔形成能力：實(shí)驗(yàn)前 1 天使用 Matrigel 膠包被 Transwell 下室，取500 μl（2×104個(gè)/ml）HUVEC 接種在Matrigel膠上；上室加入各組A375 和SK?MEL?1 細(xì)胞 200 μl（2 × 105個(gè)/ml），37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 6 h，于200 倍相差顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)5 個(gè)視野下分支節(jié)點(diǎn)數(shù)，取平均值作為各組細(xì)胞的分支節(jié)點(diǎn)。

10.Western 印跡檢測(cè) NOP14、VEGF 和 VEGFR在各組細(xì)胞中的表達(dá)：收集各組A375 和SK?MEL?1細(xì)胞（約106個(gè)），RIPA 裂解液提取總蛋白。按照文獻(xiàn)［7］中方法檢測(cè)NOP14、VEGF 和VEGFR 在各組細(xì)胞中的表達(dá)，并利用美國(guó)Media Cybernettics 公司的 Image Pro?Plus 6.0 軟件分析 Western 印跡的條帶灰度值，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量= 目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

11.ELISA 檢測(cè)培養(yǎng)基上清液中VEGF 和VEGFR 的含量：收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液，按照人VEGFB 和VEGFR 1/Flt1 ELISA 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)VEGF和VEGFR的含量。

12.統(tǒng)計(jì)處理：應(yīng)用SPSS 19.0 軟件，計(jì)量資料以表示，采用線性回歸模型分析黑素瘤組織中NOP14 表達(dá)水平與MVD 的關(guān)系，多因素方差分析檢驗(yàn)細(xì)胞增殖活性的差異，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩組間實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.黑素瘤組織中NOP14 表達(dá)和CD31 表達(dá)的相關(guān)性：免疫組化檢測(cè)NOP14 和CD31 表達(dá)的代表圖見圖1。NOP14 高表達(dá)組（20 例）CD31 相對(duì)表達(dá)水平（MVD）為44±13，中表達(dá)組（17例）為58±16，低表達(dá)組（3 例）為62 ± 11。相關(guān)性分析顯示，NOP14 表達(dá)和 MVD 呈負(fù)相關(guān)（r= -0.525，P=0.017），見圖2。

2.NOP14 過(guò)表達(dá)和RNA 干擾驗(yàn)證：見圖3。與siNC 組相比，siNOP14 組 A375 和 SK?MEL?1 細(xì)胞中NOP14 mRNA（t值分別為25.00、40.92，均P＜ 0.01）及蛋白表達(dá)水平（t值分別為3.76、4.16，均P＜ 0.01）均顯著降低，說(shuō)明NOP14 被成功沉默。與空載體組相比，NOP14組A375和SK?MEL?1細(xì)胞中NOP14的mRNA（t值分別為4.06、5.35，P＜ 0.05、0.01）和蛋白表達(dá)水平（t值分別為4.30、4.35，均P＜ 0.01）顯著升高，且可以檢測(cè)到相對(duì)分子質(zhì)量為126 000 的NOP14 和 EGFP 的融合蛋白，說(shuō)明 NOP14 已成功過(guò)表達(dá)。

3.NOP14 對(duì)黑素瘤細(xì)胞 VEGF 和 VEGFR 表達(dá)的影響：Western 印跡檢測(cè)（圖4）顯示，與空載體組相比，NOP14 組 A375 和 SK?MEL?1 細(xì)胞中 VEGF（t值分別為 5.60、2.91，P值分別 ＜ 0.01、0.05）和VEGFR 的表達(dá)水平顯著降低（t值分別為3.18、3.38，均P＜ 0.05）；與siNC 組相比，siNOP14組A375和SK?MEL?1 細(xì)胞中 VEGF（t值分別為 15.81、3.88，P值分別 ＜ 0.01 和 0.05）和 VEGFR（t值分別為3.97、3.46，均P＜ 0.01）表達(dá)水平顯著增加。ELISA結(jié)果（圖5）顯示，與空載組相比，NOP14 組A375 和SK?MEL?1 細(xì)胞培養(yǎng)基中 VEGF（t值分別為 224、113.7，均P＜ 0.01）和 VEGFR（t值分別為 59.12、22.16，均P＜ 0.01）含量顯著降低；與siNC 組相比，siNOP14 A375 和 SK?MEL?1 細(xì)胞培養(yǎng)基中 VEGF（t值分別為30.91、121.20，均P＜ 0.01）和VEGFR 的含量顯著增加（t值分別為14.45、14.23，均P＜ 0.01）。

4.NOP14 對(duì) HUVEC 增殖能力的影響：見圖 6。與 A375 或 SK?MEL?1 空載體共培養(yǎng)組相比，A375或SK?MEL?1 NOP14共培養(yǎng)組HUVEC 的A450值在培養(yǎng)后第1、2、3 和4 天均顯著降低，不同時(shí)間的增殖活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為168.61、172.37，均P＜ 0.01），不同分組間增殖活性差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為131.85、189.10，均P＜0.01），分組和時(shí)間存在交互作用（F=28.08、35.44，均P＜ 0.01）。與 A375 或 SK?MEL?1 siNC 共培養(yǎng)組相比，A375 或者 SK?MEL?1 siNOP14 共培養(yǎng)組HUVEC 的A450 值在培養(yǎng)后第 1、2、3 和 4 天均顯著升高，不同時(shí)間共培養(yǎng)組HUVEC 細(xì)胞的增殖活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為477.76、394.20，均P＜ 0.01），不同分組間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為79.92、157.02，均P＜ 0.01），分組和時(shí)間存在交互作用（F值分別為9.95、17.89，均P＜ 0.01）。

圖1 免疫組化檢測(cè)黑素瘤組織中核蛋白14（NOP14）和CD31的表達(dá)（×200）

圖2 40 例黑素瘤組織中核蛋白14（NOP14）與CD31 表達(dá)量（微血管密度）的相關(guān)性分析

圖3 實(shí)時(shí)PCR和Western印跡分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染核蛋白14過(guò)表達(dá)載體（NOP14 組）或者siNOP14（siNOP14 組）后 A375 和SK?MEL?1 細(xì)胞中NOP14 mRNA（3A）和蛋白（3B、3C、3D）表達(dá)水平 NOP14組和siNOP14 組細(xì)胞NOP14 分別被成功過(guò)表達(dá)和沉默。siNC：陰性對(duì)照siRNA；siNOP14：靶向NOP14 的siRNA；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶。n=3，a：P ＜ 0.05

5.NOP14 對(duì)HUVEC 遷移和侵襲能力的影響：見圖7。與A375 空載體共培養(yǎng)組HUVEC 相比，A375 NOP14 共培養(yǎng)組HUVEC 的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低（遷移：22 ± 5 比 63 ± 8，t= 7.07，P=0.002；侵襲：14 ± 5 比45 ± 10，t=4.94，P=0.008）。與 A375 siNC 共培養(yǎng)組 HUVEC 相比，A375 siNOP14 共培養(yǎng)組HUVEC 的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加（遷移：152 ± 30 比 59 ± 4，t= 5.36，P=0.006；侵襲：134 ± 21比50 ± 8，t=6.40，P=0.003）。與不同組SK?MEL?1細(xì)胞共培養(yǎng)后，HUVEC 遷移和侵襲能力的變化趨勢(shì)和與A375細(xì)胞共培養(yǎng)一致。

6.NOP14 對(duì)HUVEC 管腔形成能力的影響：見圖 8。與 A375 或 SK?MEL?1 空載體共培養(yǎng) 組HUVEC 相比，A375 或 SK?MEL?1 NOP14 共培養(yǎng)組HUVEC 形成的分支節(jié)點(diǎn)數(shù)顯著降低（A375：8 ± 2比14 ± 3，t= 5.06，P＜ 0.001；SK?MEL?1：11 ± 1 比19 ± 3，t= 6.93，P＜ 0.001）。與 A375 或 SK?MEL?1 siNC 共培養(yǎng)組 HUVEC 相比，A375 或 SK?MEL?1 siNOP14 共培養(yǎng)組HUVEC 形成的分支節(jié)點(diǎn)數(shù)顯著增加（A375：27 ± 3 比15 ± 4，t= 6.10，P＜ 0.001；SK?MEL?1：28 ± 4比16 ± 2，t=7.25，P＜ 0.001）。

討論

2012 年的一項(xiàng)調(diào)查顯示，在較發(fā)達(dá)地區(qū)黑素瘤的發(fā)病率和死亡率分別為9.3/10 萬(wàn)和1.2/10 萬(wàn)，欠發(fā)達(dá)地區(qū)分別為 0.7/10 萬(wàn)和 0.3/10 萬(wàn)［10］。據(jù)估計(jì)，2015 年在美國(guó)有73 870 例新病例被診斷，并有9 940 人將死于黑素瘤［11?12］。我國(guó)等亞洲國(guó)家的黑素瘤發(fā)病率與歐美國(guó)家相比較低，但發(fā)病率增長(zhǎng)較快。2003—2007 年中國(guó)44 個(gè)腫瘤登記地區(qū)黑素瘤發(fā)病率合計(jì)為0.49/10萬(wàn)，死亡率合計(jì)為0.24/10萬(wàn)［13］。與1988 年相比，2007 年北京市和上海市黑素瘤發(fā)病率和死亡率明顯上升［13］。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致黑素瘤患者死亡的重要原因，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移其5 年生存率大約只有16%［14］，中期生存時(shí)間大約只有11 個(gè)月［15］。因此，如何抑制黑素瘤的轉(zhuǎn)移是目前亟待突破的關(guān)鍵問(wèn)題。

圖4 Western 印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染核蛋白14（NOP14）過(guò)表達(dá)載體（NOP14 組）或者NOP14 siRNA（siNOP14 組）對(duì)A375 和SK?MEL?1 細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和VEGF受體（VEGFR）表達(dá)水平的影響 4A：代表性電泳圖譜；4B：蛋白相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果。siNC：陰性對(duì)照siRNA；siNOP14：靶向NOP14 的siRNA。n = 3，a：P ＜ 0.05圖5 ELISA 檢測(cè)轉(zhuǎn)染核蛋白14（NOP14）過(guò)表達(dá)載體（NOP14 組）或者NOP14 siRNA（siNOP14 組）后A375 和SK?MEL?1 細(xì)胞培養(yǎng)基中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和VEGF 受體（VEGFR）表達(dá)水平 siNC：陰性對(duì)照siRNA；siNOP14：靶向NOP14 的siRNA。n=3，a：P ＜ 0.05

圖6 CCK8 實(shí)驗(yàn)分析核蛋白14（NOP14）對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖能力的影響 與空載體共培養(yǎng)組相比，NOP14 共培養(yǎng)組HUVEC 增殖能力降低；與siNC 共培養(yǎng)組相比，siNOP14 共培養(yǎng)組HUVEC 增殖能力增強(qiáng)。siNC：陰性對(duì)照siRNA；siNOP14：靶向NOP14 的siRNA。n=3，a：P ＜ 0.05

血管形成是黑素瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［8］。研究顯示，癌組織中微血管增加可促進(jìn)癌細(xì)胞的合成代謝，為腫瘤細(xì)胞的快速增長(zhǎng)及物質(zhì)代謝提供物質(zhì)基礎(chǔ)［16］。MVD 越高，進(jìn)入血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞數(shù)及其誘發(fā)微血管形成的能力越強(qiáng)。因此研究腫瘤血管形成對(duì)了解惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為和機(jī)制以及抗腫瘤血管形成有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果表明，黑素瘤中NOP14 的表達(dá)水平和MVD（CD31 的表達(dá)）呈負(fù)相關(guān)，提示NOP14 可能在調(diào)控血管新生中發(fā)揮重要作用。隨后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)NOP14 的黑素瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF 和VEGFR 的能力明顯減弱，且干擾NOP14 表達(dá)的黑素瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF 和VEGFR 的能力明顯增強(qiáng)。VEGF 可通過(guò)結(jié)合臨近血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的VEGFR 來(lái)啟動(dòng)腫瘤血管新生，在腫瘤的血管新生過(guò)程中扮演重要角色［17］。這些結(jié)果表明，NOP14 可能通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞VEGF分泌影響臨近血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管再生能力。通過(guò)建立黑素瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC 的Transwell共培養(yǎng)模型，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)NOP14的黑素瘤細(xì)胞可明顯抑制HUVEC的增殖、遷移、侵襲和管腔形成能力，反之干擾NOP14 表達(dá)的黑素瘤細(xì)胞則可明顯促進(jìn)HUVEC的增殖、遷移、侵襲和管腔形成能力。既往研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和管腔形成能力的增強(qiáng)是血管新生的必備條件［18］。因此，我們推測(cè)，NOP14 在調(diào)控血管新生中發(fā)揮重要作用，NOP14可以作為抑制黑素瘤血管新生的潛在重要靶點(diǎn)。

圖7 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)核蛋白14（NOP14）對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）遷移和侵襲能力的影響 與空載體共培養(yǎng)組相比，NOP14 共培養(yǎng)組HUVEC 遷移和侵襲能力降低；與siNC 共培養(yǎng)組相比，siNOP14 共培養(yǎng)組HUVEC 遷移和侵襲能力增強(qiáng)。siNC：陰性對(duì)照siRNA；siNOP14：靶向NOP14 的siRNA

圖8 Matrigel 血管擬態(tài)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)核蛋白14（NOP14）對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）管腔形成能力的影響 與空載體共培養(yǎng)組相比，NOP14 共培養(yǎng)組HUVEC 管腔形成能力降低；與siNC 共培養(yǎng)組相比，siNOP14 共培養(yǎng)組HUVEC 管腔形成能力增強(qiáng)。siNC：陰性對(duì)照siRNA；siNOP14：靶向NOP14 的siRNA

我們首次提出NOP14 參與調(diào)控腫瘤血管新生，NOP14可以抑制黑素瘤血管新生。NOP14在其他腫瘤中的作用可以從另一個(gè)方面支持我們的結(jié)論［4］。以往研究表明，過(guò)表達(dá)NOP14可以明顯抑制黑 素 瘤 細(xì) 胞 的 遷 移 和 侵 襲 能 力［6?7］，且 過(guò) 表 達(dá)NOP14 能夠抑制乳腺癌腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移［4］，同樣發(fā)揮抑制腫瘤惡化的作用。這些結(jié)果表明，NOP14在調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用，但其具體作用需要進(jìn)一步探討。

雖然蛋白融合技術(shù)是蛋白研究中常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，但融合的EGFP 可能會(huì)影響目標(biāo)蛋白質(zhì)的折疊，進(jìn)而影響其功能的發(fā)揮。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明融合EGFP 后NOP14 可以明顯影響黑素瘤細(xì)胞的功能，且與干擾NOP14 表達(dá)的功能相反，說(shuō)明融合EGFP 對(duì)NOP14 的功能沒(méi)有本質(zhì)上的改變。但是，仍可能存在其他影響，這是本文的缺陷之一。另外，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性不如慢病毒感染，可能會(huì)影響本文結(jié)論的可靠性，我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用慢病毒感染構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)或者過(guò)表達(dá)NOP14 的細(xì)胞株的方式進(jìn)一步驗(yàn)證本文的結(jié)論。

總之，本研究表明，NOP14 在調(diào)控黑素瘤的血管新生中發(fā)揮重要作用，該結(jié)果進(jìn)一步明確了NOP14在調(diào)控黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，并將為抗腫瘤血管新生藥物的研發(fā)提供新的理論基礎(chǔ)。將來(lái)我們將驗(yàn)證NOP14 和其他血管新生標(biāo)志物（如CD34和CD105）表達(dá)的相關(guān)性，分析NOP14和血管新生標(biāo)志物的相關(guān)性在不同類型的黑素瘤組織中是否存在差異，進(jìn)一步明確NOP14 和黑素瘤血管新生的關(guān)系。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突