人胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型建立的研究進(jìn)展

王霞 董孟佳

[摘要] 我國是消化道腫瘤的高發(fā)地區(qū)，早診斷、早治療是降低胃癌死亡率的重要手段。建立胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型是研究胃早期癌變的方法之一。目前常用的模型誘導(dǎo)劑有亞硝基胍、幽門螺桿菌、鵝去氧膽酸、赭曲霉毒素A、非編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達(dá)等，但尚缺乏成熟公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。本文就近年來文獻(xiàn)發(fā)表的胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型作一綜述，介紹各類模型制備方法、胃黏膜上皮細(xì)胞的形態(tài)變化、分子表達(dá)差異及其致病原理，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

[關(guān)鍵詞] 惡性轉(zhuǎn)化;細(xì)胞模型;胃黏膜上皮細(xì)胞;癌前病變

[中圖分類號] R735.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）03（b）-0036-04

[Abstract] China is a high incidence area of digestive tract tumors. Early diagnosis and early treatment are an important means to reduce the mortality of gastric cancer. The establishment of malignant transformation model of gastric mucosal epithelial cells is one of the important methods to study early gastric cancer. Currently model inducers include nitrosoguanidine， Helicobacter pylori， chenodeoxycholic acid， ochratoxin A， non-coding transcriptional regulatory gene expression and so on. There is no established standard for model development. This paper summarizes the malignant transformation model of gastric mucosa epithelial cells published in recent years， and introduces the methods of model preparation， related morphology， molecular expression difference and its pathogenic principle， so as to provide reference for further experimental research.

[Key words] Malignant transformation; Cell model; Gastric mucosal epithelial cells; Precancerous lesion

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居世界惡性腫瘤的第四位，死亡率居惡性腫瘤的第三位[1-2]，嚴(yán)重威脅人類健康。目前被認(rèn)可的胃癌發(fā)生進(jìn)展模式是Correa等[3]提出正常胃黏膜-慢性淺表性胃炎（CSG）-慢性萎縮性胃炎（CAG）-胃黏膜腸上皮化生（IM）-異型增生（中度/重度）-胃癌（腸型）。從CAG到胃癌發(fā)生前統(tǒng)稱為癌前病變（PLGC），此過程具有可控制、可逆轉(zhuǎn)性，是胃癌防治的重要階段。PLGC伴隨胃黏膜上皮細(xì)胞向胃癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，積極探索胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)，對于預(yù)防胃癌和降低胃癌發(fā)病率至關(guān)重要。細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化指外源性因素對體外培養(yǎng)的細(xì)胞誘發(fā)的惡性表型改變，包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖速度、生長特征（如錨著獨(dú)立性生長或接觸抑制消失等）、染色體畸變等方面的改變;轉(zhuǎn)化的細(xì)胞接種在裸鼠皮下可形成肉眼可見的腫瘤。成瘤性是確定細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的可靠指標(biāo)[4]。

目前關(guān)于胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的研究并不多，其細(xì)胞模型的制作方法和標(biāo)準(zhǔn)也沒有完全統(tǒng)一。探索胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的標(biāo)準(zhǔn)制作方法對推動(dòng)胃癌發(fā)生的相關(guān)機(jī)制和藥物研究具有重要意義。常見的人胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1）具有正常人胃上皮細(xì)胞的特性和功能，可在體外穩(wěn)定傳代，且不具有錨著獨(dú)立生長能力，接種裸鼠后6個(gè)月內(nèi)不會成瘤。這些生物學(xué)特性使其成為了解正常胃黏膜上皮細(xì)胞離體特征及研究胃癌致病機(jī)制的良好選擇[5]。現(xiàn)將常見的誘導(dǎo)GES-1惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型的制作方法總結(jié)如下：

1 N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型

MNNG誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型是研究最早且最多的實(shí)驗(yàn)方法。流行病學(xué)資料顯示[6]，亞硝酰胺類化合物與人胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，人體中亞硝基化合物主要通過亞硝胺腌制和加工的肉制品、其他食物、酒精飲料及體內(nèi)的細(xì)菌還原硝酸鹽而產(chǎn)生。MNNG是人工合成的亞硝基化合物，常作為典型的模式化學(xué)誘變劑和致癌劑，主要用于研究N-亞硝基類致癌物的致癌機(jī)制。研究顯示，MNNG能誘導(dǎo)大鼠胃癌前病變的發(fā)生，是研究天然植物預(yù)防胃癌的最常用的致癌劑[7]。

研究發(fā)現(xiàn)[8]，經(jīng)過MNNG處理后的GES-1細(xì)胞即MC細(xì)胞，隨著傳代的繼續(xù)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，從最初的梭形變成不規(guī)則形，細(xì)胞間接觸緊密，呈“島樣”克隆生長。MNNG作用于GES-1細(xì)胞24 h后，MC細(xì)胞失去接觸抑制能力，染色體畸變增多、細(xì)胞增殖率增加、獲得軟瓊脂集落生成能力。提示MNNG使GES-1細(xì)胞發(fā)生質(zhì)變，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性[9]。張水蓮[10]應(yīng)用低劑量MNNG和同類藥物N-甲基-N亞硝基脲（MNU）處理GES-1細(xì)胞，每周處理1次，連續(xù)處理4周后，細(xì)胞在正常培養(yǎng)基中繼續(xù)傳代，繼續(xù)培養(yǎng)8周，隨后進(jìn)行細(xì)胞惡性表型檢測以及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示MNNG和MNU能成功建立胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型。Yang等[11]在此基礎(chǔ)上，將惡性轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞多次稀釋后挑取單個(gè)細(xì)胞形成克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，制成單克隆細(xì)胞株，用于后續(xù)研究。

MNNG是一種不依賴于酶的代謝能夠直接作用于胃腸道黏膜引起癌變的活性致癌劑，其可直接滲透胃幽門部和胃底部黏膜，誘發(fā)大鼠及犬實(shí)驗(yàn)性胃癌的發(fā)生。目前MNNG致癌機(jī)制尚不明確，可能與其促使胃黏膜發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、激活Wnt/β-catenin信號通路、促發(fā)胃黏膜上皮癌變的啟動(dòng)因子相關(guān)[12-13]。

2 幽門螺桿菌（Hp）誘導(dǎo)GES-1惡性轉(zhuǎn)化

自從Marshall成功培養(yǎng)和分離出Hp以來，文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，Hp感染與胃癌癌前病變的發(fā)生密切相關(guān)[14-15]。世界衛(wèi)生組織（WHO）將Hp列為第一類致癌危險(xiǎn)因素。

劉琳娜等[16]按細(xì)胞∶細(xì)菌1∶50、1∶100、1∶200的比例分別加入GES-1細(xì)胞和高、低表達(dá)硫氧還蛋白1的Hp菌株共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨著Hp濃度增高、作用時(shí)間延長，GES-1細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)改變，細(xì)胞壁變得不光整，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞的增殖活性逐漸受到抑制且呈觀察時(shí)間和Hp濃度依賴性，細(xì)胞周期中進(jìn)入S期的比例升高。鄧志燕等[17]將濃度為1×109 CFU/mL的Hp菌液加入GES-1細(xì)胞中，按細(xì)菌∶細(xì)胞為200∶1共培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)Hp感染后可顯著抑制GES-1細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)胃黏膜上皮炎癥細(xì)胞的浸潤，釋放白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-8等炎癥介質(zhì)。

Hp致病性主要依賴鞭毛、螺旋結(jié)構(gòu)、脂多糖、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白和空泡毒素等多種致病因子，其致病機(jī)制復(fù)雜，目前發(fā)現(xiàn)Hp感染GES-1細(xì)胞后，可影響細(xì)胞自噬、多胺代謝異常，干擾細(xì)胞增殖、凋亡，促使腫瘤的發(fā)生[18-19]。

3 鵝去氧膽酸（CDCA）刺激GES-1細(xì)胞建立腸上皮化生（IM）模型

膽汁酸刺激是胃黏膜IM發(fā)生的重要內(nèi)源性因素，CDCA是膽鹽的原體，可模擬膽汁反流對胃黏膜的傷害刺激，用于胃黏膜上皮細(xì)胞IM模型的建立。李紅[20]選用4種含有特定濃度的膽汁酸刺激GES-1細(xì)胞，最終確定CDCA刺激24 h效果最佳，并用Western blot和免疫熒光分別檢測了腸上皮特異分子KLF4、VILLIN及MUC2的表達(dá)，證實(shí)其可作為胃黏膜IM的細(xì)胞模型。沈和德等[21]將CDCA溶解至無胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)液中，配成濃度為100 μmol/L的無血清培養(yǎng)基，加入到融合度80%的GES-1細(xì)胞中，24 h后換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，與對照組比較，CDX2抗體在CDCA誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞呈陽性表達(dá)，提示CDCA能誘導(dǎo)胃黏膜IM。劉洪等[8]采用不同濃度CDCA、MNNG刺激GES-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩者對GES-1細(xì)胞均有抑制作用，半數(shù)抑制濃度分別為0.42、173.79 μmol/L，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)均呈長梭形。提示MNNG、CDCA可通過下調(diào)胃特異性基因MUC1表達(dá)、上調(diào)腸特異性基因CDX2表達(dá)模擬胃黏膜腸化生細(xì)胞學(xué)改變，構(gòu)建IM模型。

4 赭曲霉毒素A（OTA）誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化

OTA是一種真菌毒素，由曲霉菌和青霉菌株產(chǎn)生，廣泛存在于糧食作物和咖啡、面包等食品中，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)[22]，河北部分地區(qū)出現(xiàn)胃癌高發(fā)與OTA廣泛污染密切相關(guān)。2.5 μmol/L OTA作用于GES-1細(xì)胞，40代后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞鏡下呈多角形，大小不一，細(xì)胞間排列緊密，可見多核巨細(xì)胞，且呈團(tuán)塊狀生長，排列紊亂，很多細(xì)胞周邊多呈毛刺狀，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，可成功建立裸鼠成瘤模型。其作用機(jī)制可能與氧化應(yīng)激，Wnt/β-catenin通路活化、誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)相關(guān)[23-24]。崔晉峰等[25]發(fā)現(xiàn)OTA可以增加GES-1細(xì)胞微核的形成，誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞染色體發(fā)生畸變。

5 非編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達(dá)誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化

各類RNA間存在相互作用的網(wǎng)絡(luò)，可以通過基因編輯技術(shù)，競爭性結(jié)合相應(yīng)的miRNA，對該miRNA后續(xù)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用發(fā)生有效控制，調(diào)控與癌癥相關(guān)基因和通路的表達(dá)，促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)[26]，GES-1細(xì)胞經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，通過影響miR-200a/b/c表達(dá)，出現(xiàn)GES-1細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化傾向，增加細(xì)胞的侵襲、遷移能力。

6 小結(jié)

N-亞硝基化合物、高糖類伴低蛋白食物、高鹽飲食、霉變食物、Hp感染、維生素C缺乏、吸煙、年齡、胃癌家族史等均是胃癌發(fā)生的高危因素，這些危險(xiǎn)因素也為建立胃癌實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆椒ㄌ峁﹨⒖肌?/p>

對于體外細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的鑒定目前尚無金標(biāo)準(zhǔn)。綜合比較上述GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的建立方法，MNNG和Hp感染誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞實(shí)現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化的方法較為可靠，具有穩(wěn)定性，可重復(fù)性。但Hp感染形成的模型細(xì)胞克隆形成率低于親代對照細(xì)胞，不利于藥物干預(yù)和研究，因此一般不將Hp作為唯一的致病因素來制作細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型，更多的把Hp感染用作藥物根除模型。CDCA誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞實(shí)現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化，只構(gòu)建IM模型，缺少對萎縮性胃炎模型的研究，并且模型的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)是通過鑒定KLF4、VILLIN及MUC2等相關(guān)特異性分子，細(xì)胞形態(tài)學(xué)的研究不夠詳細(xì)，是否具有成瘤性仍需進(jìn)一步檢驗(yàn)。OTA、非編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達(dá)誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化具有參考價(jià)值，但相關(guān)報(bào)道較少。此外，腫瘤壞死因子α、乙醇等對GES-1的影響，著重于黏膜損傷，和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化尚有一定距離。

綜上所述，MNNG誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，參考性強(qiáng)，是更容易成功的實(shí)驗(yàn)方法。該細(xì)胞模型的制作為胃癌癌前病變和相關(guān)藥物的作用機(jī)制探索奠定了科學(xué)的基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-09-19? 本文編輯：劉明玉）