應(yīng)用正交設(shè)計(jì)優(yōu)選二歧鹿角蕨球狀體分化培養(yǎng)基研究

葉秀仙 方能炎 吳建設(shè) 鐘淮欽

摘?要：為篩選二歧鹿角蕨球狀體分化培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，建立鹿角蕨球狀體分化培養(yǎng)技術(shù)體系。以二歧鹿角蕨孢子萌發(fā)的綠色球狀體為芽分化培養(yǎng)材料，采用正交設(shè)計(jì)法研究基本培養(yǎng)基、IBA、活性炭（AC）和白糖4種因素對鹿角蕨球狀體分化培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明：各試驗(yàn)因素對鹿角蕨球狀體分化培養(yǎng)影響的主次關(guān)系為基本培養(yǎng)基>IBA>AC>白糖;篩選出適宜二歧鹿角蕨綠色球狀體（GGB）分化的培養(yǎng)基配方為HD2基本培養(yǎng)基+ IBA 0.5 mg·L-1+AC 0.5 mg·L-1+白糖30.0 g·L-1，培養(yǎng)56 d，芽分化系數(shù)達(dá)6.7，有效提高了其繁殖效率，為種苗規(guī)?；缣峁┝思夹g(shù)保障。

關(guān)鍵詞：鹿角蕨;球狀體;正交設(shè)計(jì);快速繁殖

中圖分類號：Q943.1?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）02-0024-04

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.02.005

Abstract：In order to select the best medium for the spheroid differentiation culture of Platycerium bifurcatum， a technical system for the spheroid differentiation culture of Platycerium wallichii Hook. was established. The green globularbodies （GGB） germinated from Platycerium bifurcatum spores were used as the culture material for bud differentiation， and the effects of basic medium， IBA， activated carbon and white sugar on the spheroid differentiation culture of Platycerium wallichii Hook. were studied by using the orthogonal design method. The results showed that the primary and secondary relationship of the effect of each factor on the spheroid differentiation culture of Platycerium wallichii Hook. was basic medium>IBA>AC>white sugar. The medium formula suitable for the GGB differentiation of Platycerium bifurcatum was selected as HD2 basic medium+ IBA 0.5 mg·L-1+AC 0.5 mg·L-1+white sugar 30.0 g·L-1. The culture was conducted for 56 d and the coefficient of bud differentiation was up to 6.7， which effectively improved its reproductive efficiency and provided technical guarantee for largescale culture of seedlings.

Key words：Platycerium wallichii Hook;Spheroid;Orthogonal design;Rapid propagation

鹿角蕨Platycerium wallichii Hook.為鹿角蕨科鹿角蕨屬多年生常綠草本植物，原產(chǎn)于中國云南西南部盈江縣那邦壩，海拔210～950 m山地雨林中，緬甸、印度東北部、泰國也有分布，該種已列入國家二級保護(hù)植物[1-2]。其株型奇特，姿態(tài)優(yōu)美，是觀賞蕨中姿態(tài)最為奇特的一類蕨類植物。鹿角蕨常作為室內(nèi)垂吊或壁掛的觀賞植物，在公園、植物園等地方的裝飾與布置十分流行，也是室內(nèi)觀葉中珍貴稀有的精品，亦是室內(nèi)立體綠化的好材料，雅致而充滿異國風(fēng)情，深受喜愛，應(yīng)用前景廣闊。目前，鹿角蕨的繁殖方法主要以分株繁殖和孢子繁殖為主，但分株繁殖系數(shù)小，孢子自然萌發(fā)率低，極大限制了鹿角蕨的應(yīng)用，而采用組織培養(yǎng)技術(shù)可以解決快速繁殖育苗問題。

目前，關(guān)于鹿角蕨組織培養(yǎng)快速繁殖方面的研究國內(nèi)已有一些報(bào)道[3-9]。金建平等[3]研究表明對生鹿角蕨的孢子萌發(fā)及原葉體發(fā)育的最佳培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，最佳原葉體增殖培養(yǎng)基為1/2MS+KT 2.0 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1，pH值5.8，最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度 25℃左右，光照時(shí)間 16 h·d-1，光照強(qiáng)度2000 lx。黃韶玲等[4]研究發(fā)現(xiàn)，以鹿角蕨幼孢子體作為外植體，誘導(dǎo)GGB的培養(yǎng)基為MS+6BA 0.05 g·L-1+IBA 0.05 mg·L-1或 MS+6BA 0.01 g·L-1+IBA 0.2 mg·L-1，誘導(dǎo)叢芽及繼代培養(yǎng)基為MS+IAA 0.25 mg·L-1，生根培養(yǎng)基為1/2MS。王承義等[5]報(bào)道細(xì)胞分裂素、蔗糖對鹿角蕨芽分化的影響，認(rèn)為6BA適宜不定芽分化，30 g·L-1用糖量為最優(yōu)。林證明等[6]報(bào)道以二叉鹿角蕨無菌孢子體幼苗葉片或莖尖接種到改良MS+6BA 0.1～1.0 mg·L-1+NAA 0.1～0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上，20 d左右形成綠白色愈傷組織，120 d左右形成肉眼可見的叢生芽。黃執(zhí)纓[7]以二歧鹿角蕨幼嫩真葉為外植體，建立了鹿角蕨組織培養(yǎng)技術(shù)，篩選出適宜幼嫩真葉誘導(dǎo)球狀體（GGB）的培養(yǎng)基為MS+6BA 0.1 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1，GGB誘導(dǎo)叢生芽適宜的培養(yǎng)基為 MS+KT 0.5 mg·L-1 +IAA 0.5 mg·L-1，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 mg·L-1?？梢姡煌蛐偷穆菇寝?，不同研究者研究報(bào)道結(jié)果不盡相同。本研究以二歧鹿角蕨孢子萌發(fā)形成的GGB為外植體，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法，探討影響GGB分化培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，建立其GGB分化培養(yǎng)技術(shù)體系，為鹿角蕨種苗繁育及遺傳轉(zhuǎn)化等相關(guān)研究提供技術(shù)保障。

1?材料與方法

1.1?材料

以二歧鹿角蕨Platycerium bifurcatum孢子萌發(fā)形成的綠色球狀體 （Green globularbodies，GGB）作為芽分化培養(yǎng)材料。試驗(yàn)在福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心花卉育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2?方法

1.2.1?接種方法?選取生長均勻一致的鹿角蕨GGB團(tuán)塊，切割成大小0.5 cm×0.5 cm，接種到分化培養(yǎng)基中，每瓶接入GGB團(tuán)塊10個(gè)，接種完畢置于培養(yǎng)室培養(yǎng)架上進(jìn)行光培養(yǎng)。

1.2.2?試驗(yàn)設(shè)計(jì)?分化培養(yǎng)基采用L9（34）正交設(shè)計(jì)[10]，以基本培養(yǎng)基、IBA、AC、白糖為試驗(yàn)因子，各因子設(shè)3個(gè)水平，詳見表1。各處理培養(yǎng)基均附加瓊脂粉5.0 g·L-1。每處理接種5瓶，3次重復(fù)，共9個(gè)處理。

其中，HD1基本培養(yǎng)基的組分為：花寶1號1.8 g·L-1、KNO3 0.95 g·L-1、（NH4）2SO4 0.85 g·L-1、KH2PO4 0.25 mg·L-1、MgSO4·7H2O 0.25 g·L-1、CaCl2·2H2O 0.4 g·L-1、FeSO4·7H2O 27.8 mg·L-1、Na2·EDTA 37.3 mg·L-1、VB1 10.0 mg·L-1、VB5 5.0 mg·L-1、VB6 1.0 mg·L-1、甘氨酸2.0 mg·L-1、肌醇150 mg·L-1。

HD2基本培養(yǎng)基的組分為：花寶1號1.2 g·L-1、KNO3 0.95 g·L-1、（NH4）2SO4 0.85 g·L-1、KH2PO4 0.25 mg·L-1、MgSO4·7H2O 0.25 g·L-1、CaCl2·2H2O 0.2 g·L-1、MnSO4·H2O 16.9 mg·L-1、ZnSO4.7H2O 8.6 mg·L-1、H3BO3 6.2 mg·L-1、KI 0.83 mg·L-1、Na2MoO2·2H2O 0.25 mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1、FeSO4·7H2O 27.8 mg·L-1、Na2·EDTA 37.3 mg·L-1、VB1 5.0 mg·L-1、VB5 3.0 mg·L-1、VB6 1.0 mg·L-1、甘氨酸2.0 mg·L-1、肌醇180 mg·L-1。

1.2.3?培養(yǎng)方式與培養(yǎng)條件?采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)方式， pH值5.6～5.8，培養(yǎng)溫度為（24±3）℃，光強(qiáng)為1500～2000 lx，光照時(shí)間為10～12 h·d-1。

以上試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純試劑，白糖為廈門古龍牌優(yōu)質(zhì)白砂糖;瓊脂粉強(qiáng)度1400 g·cm-2;花寶1號產(chǎn)地美國，其N、P、K質(zhì)量比7∶6∶19。

1.2.4?觀測指標(biāo)與數(shù)據(jù)分析?每隔14 d對GGB生長情況進(jìn)行觀察，增殖培養(yǎng)56 d時(shí)，統(tǒng)計(jì)分化叢生芽的GGB團(tuán)塊數(shù)、每塊GGB分化芽數(shù)，分化系數(shù)=分化芽總數(shù)/ GGB接種團(tuán)塊數(shù)[7]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用正交設(shè)計(jì)助手V3.1軟件進(jìn)行分析。

2?結(jié)果與分析

接種14 d時(shí)，GGB切口及表面部位開始萌動芽點(diǎn)，28 d時(shí)不同處理組陸續(xù)分化出芽。培養(yǎng)56 d時(shí)，觀察與統(tǒng)計(jì)GGB分化生長情況，試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表2、表3。

2.1?不同因素與水平對GGB分化培養(yǎng)的極差分析結(jié)果

表2結(jié)果表明，從k值大小可以看出，MS、改良1號、改良2號基本培養(yǎng)基對鹿角蕨GGB分化芽影響效果表現(xiàn)為HD2>HD1>MS，說明改良2號成分對芽分化作用較大，以HD2為基本培養(yǎng)基較好;IBA對鹿角蕨GGB分化芽影響效果表現(xiàn)為0.5 mg·L-1IBA>0.1 mg·L-1IBA>1.0 mg·L-1 IBA，其中以0.5 mg·L-1 IBA處理對芽分化效果較好;AC與白糖因素k值大小差異不大，AC適宜濃度為0.5 g·L-1，白糖為30.0 g·L-1。從極差R值大小可以看出，不同因素對GGB分化培養(yǎng)影響的主次關(guān)系為A>B>C>D，這說明對鹿角蕨GGB分化起主要作用的是基本培養(yǎng)基，其次是IBA，白糖和AC對芽分化的影響較小。鹿角蕨GGB最佳處理組合是A3B2C1D3，即HD2+IBA 0.5 mg·L-1+AC 0.5 g·L-1+白糖30.0 g·L-1，分化培養(yǎng)56 d，芽分化系數(shù)達(dá)6.7。

2.2?不同因素與水平對GGB分化培養(yǎng)的方差分析結(jié)果

從表3可知，基本培養(yǎng)基和IBA兩個(gè)因素均顯著影響鹿角蕨GGB芽分化系數(shù)，但其影響程度的大小有較大差異，表現(xiàn)為基本培養(yǎng)基>IBA，白糖和AC因素?zé)o顯著影響，與極差分析結(jié)果基本一致。

3?討論與結(jié)論

采用鹿角蕨孢子無菌萌發(fā)形成綠色球狀體（Green globularbodies，GGB）的快速繁殖途徑是鹿角蕨組織培養(yǎng)的重要途徑。孢子數(shù)量具大，以孢子為外植體，取材方便，但由于孢子顆粒極其微小，且裸露于空氣中，孢子消毒滅菌到成功萌發(fā)是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，筆者在實(shí)踐中已取得較好成效，同時(shí)獲得大量GGB，而GGB分化芽的效率直接影響鹿角蕨育苗速度，同時(shí)培養(yǎng)基配方的合理選擇是GGB分化培養(yǎng)的關(guān)鍵，通過GGB的增殖與分化可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)鹿角蕨試管苗的大量繁殖。

針對不同基因型鹿角蕨，不同研究者的研究報(bào)道結(jié)果不盡相同[11-13]，其中培養(yǎng)基類型、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度等因素均影響鹿角蕨GGB的增殖與分化。因此，開展特定基因型材料組織培養(yǎng)時(shí)， 要摸索適合于外植體材料特點(diǎn)的培養(yǎng)基配方，提高育苗效率。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)在植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)中已廣泛應(yīng)用[14-16]，尤其在培養(yǎng)基配方篩選方面，筆者在文心蘭、秋石斛、花葉金線蓮等蘭花組培培養(yǎng)基優(yōu)選，皆取得較好的成效[14-18]。本研究選擇基本培養(yǎng)基、IBA、AC和白糖為關(guān)鍵試驗(yàn)因素，探索和優(yōu)化了二歧鹿角蕨球狀體分化培養(yǎng)技術(shù)。試驗(yàn)結(jié)果表明對鹿角蕨GGB分化起主要作用的是基本培養(yǎng)基，其次是IBA，白糖和AC對芽分化的影響較小，GGB分化適宜的培養(yǎng)基為HD2+IBA 0.5 mg·L-1+AC 0.5 g·L-1+白糖30.0 g·L-1，培養(yǎng)56 d，芽分化系數(shù)達(dá)6.7，為種苗繁育提供了技術(shù)保障。關(guān)于影響鹿角蕨GGB分化的其他培養(yǎng)因素有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）