益腎祛濁方對(duì)多囊卵巢綜合征胰島素抵抗模型大鼠激素受體表達(dá)的干預(yù)作用

尹謙 王明星 許昕

摘要 目的：探索益腎祛濁方對(duì)多囊卵巢綜合征胰島素抵抗（PCOS-IR）模型大鼠激素及胰島素受體表達(dá)的干預(yù)作用。方法：選取6～8周齡SPF級(jí)SD雌性大鼠60只隨機(jī)分為空白組、模型組、益腎祛濁組、益腎組、西藥組（達(dá)英-35聯(lián)合二甲雙胍），每組12只?？瞻捉M給予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組均給予來曲唑灌胃聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)至第27天。然后給予不同藥物灌胃2周，采用免疫熒光法檢測(cè)各組大鼠雄激素受體（AR）、促黃體生成素受體（LHR）在卵巢、胃、腸組織的表達(dá);并觀察胰島素受體（INSR）在卵巢的表達(dá)。結(jié)果：治療14 d后發(fā)現(xiàn)，益腎祛濁方可以顯著降低大鼠卵巢局部AR、LHR和INSR的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且明顯減少胃中AR及LHR的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;同時(shí)顯著減少結(jié)腸組織LHR的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：益腎祛濁方可能通過降低AR、LHR表達(dá)而調(diào)整模型大鼠內(nèi)分泌紊亂，又可通過降低INSR的表達(dá)，對(duì)PCOS-IR大鼠的代謝紊異常起到治療作用。

關(guān)鍵詞 益腎祛濁方;多囊卵巢綜合征胰島素抵抗;大鼠模型;受體表達(dá)

Study on Intervention Effects of Yishen Quzhuo Formula on Hormone Receptor Expression in PCOS-IR Model Rats

YIN Qian1， WANG Mingxing2， XU Xin2

（1 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; 2 Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100010， China）

Abstract Objective：To explore the intervention effects of Yishen Quzhuo Formula on the expression of hormones and insulin receptors in polycystic ovary syndrome model （PCOS-IR） rats.Methods：A total of 60 SPF level SD female rats aged 6-8 weeks were randomly divided into a blank group， a model group， a Yishen Quzhuo group， a Yishen Quzhuo group， and a Western medicine group （Diane-35 combined with metformin）， with 12 rats in each group.The blank group was fed with normal diet， and the other groups were fed with letrozole by gavage combined with high-fat diet until the 27th day.Then， different drugs were fed by gavage for 2 weeks.The expression of androgen receptor （AR）， luteinizing hormone receptor （LHR） in ovary， stomach and intestine and insulin receptor （INSR） in ovary were observed by immunofluorescence.Results：After 14 days of treatment， Yishen Quzhuo Formula could significantly reduce the expression of AR， LHR and INSR in part of ovary in rats （P<0.05）， the expression of AR and LHR in stomach （P<0.05）， and the expression of LHR in colon tissue （P<0.05）.Conclusion：Yishen Quzhuo Formula may regulate endocrine disorders in model rats by lowering the expression of AR， LHR and further exert therapeutic effects on metabolic disorder of PCOS-IR rats by reducing the expression level of INSR.

Keywords Yishen Quzhuo Formula; PCOS-IR; Rat model; Receptor expression

中圖分類號(hào)：R289.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.06.005

多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）是婦科常見的內(nèi)分泌及代謝紊亂性疾病，以持續(xù)無排卵或稀發(fā)排卵、高雄激素血癥或高胰島素血癥為特征，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)，或異常子宮出血、不孕不育、肥胖、多毛、痤瘡、黑棘皮癥等。各國報(bào)道的多囊卵巢綜合征患病率在育齡期女性為5%～10%，中國為5.61%[1]。胰島素抵抗（ Insulin Resistance，IR）是正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)，指單位濃度胰島素的細(xì)胞效應(yīng)減弱，即組織對(duì)胰島素的敏感性下降，代償性引起胰島B細(xì)胞分泌胰島素增加，從而產(chǎn)生高胰島素血癥[2]。Berger等[3]首次提出IR參與了PCOS的發(fā)生。據(jù)報(bào)道50%～70%的PCOS患者存在IR，肥胖型PCOS患者IR的發(fā)生率高達(dá)75%，非肥胖型約為30%[4]。多囊卵巢綜合征和IR密切相關(guān)的觀點(diǎn)已得到公認(rèn)。及時(shí)糾正IR狀態(tài)，改善卵巢敏感性，恢復(fù)排卵，是治療PCOS，阻斷或扭轉(zhuǎn)其發(fā)展形成PCOS-IR的關(guān)鍵。本研究基于“腎主生殖”和“沖脈隸于陽明”的中醫(yī)理論，以及前期隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)研究的成果[5-6]，擬繼續(xù)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證與闡明“益腎祛濁方”對(duì)PCOS-IR模型大鼠激素受體的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取6～8周齡SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量160～180 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（京）2018-0006，在三級(jí)動(dòng)物室無菌飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為24 ℃，濕度為60%。自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 來曲唑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H19991001）;羧甲纖維素鈉（CMC-Na，美國SIGAMA公司，生產(chǎn)批號(hào)：1002375619）;鹽酸二甲雙胍腸溶片（北京利齡恒泰藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H11021560）;達(dá)英-35（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，國藥準(zhǔn)字J20140114）。

益腎祛濁方由敗醬草、生薏苡仁、續(xù)斷、桑寄生、菟絲子等12味中藥組成。單純益腎組由益腎祛濁方中同劑量的補(bǔ)腎中藥（菟絲子、桑寄生、續(xù)斷等）組成。以上中藥購自于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院。

高脂飼料（H10060，供能比：蛋白20%、碳水化合物20%、脂肪60%）;普通飼料（H10010，供能比：蛋白20%、碳水化合物70%、脂肪10%），由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，主要成分為酪蛋白、糊精、蔗糖、纖維素、豆油、豬油等。

1.1.3 試劑與儀器 進(jìn)口羊血清工作液（中衫金橋，批號(hào)：18122701），Anti-Androgen Receptor antibody（艾博康上海貿(mào)易有限公司，批號(hào)：GR3179947-6）;LH Receptor antibody（美國LSBio公司，批號(hào)：LS-C393279）;Anti-Insulin Receptor（β-subunit）（Monoclonal Antibody，批號(hào)：NG1739931）;Alexa Fluor 594 Anti-Rabbit lgG（北京冠星宇科技有限公司，批號(hào)：1611）;Alexa Flour 488 Anti-Rabbit lgG（北京冠星宇有限公司，批號(hào)：1712）;含DAPI的封片劑（中衫金橋，批號(hào)：K185910L）。

超低溫冰箱（中國賽默飛世爾有限公司，型號(hào)：700SERIES）、組織脫水機(jī)（德國LEICA公司，型號(hào)：ASP6025）、組織包埋機(jī)（德國LEICA公司，型號(hào)：EG1150H）、石蠟切片機(jī)（德國LEICA公司，型號(hào)：RM2255）等設(shè)備均由北京市中醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將60只大鼠按體質(zhì)量排序編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為：空白組12只;模型組12只;益腎祛濁組12只;益腎組（陽性中藥對(duì)照）12只;達(dá)英-35聯(lián)合二甲雙胍組（陽性西藥對(duì)照）12只。分籠喂養(yǎng)，每籠3只?？瞻捉M予以普通飼料，其余各組均予以高脂飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

參考來曲唑造模法[7-8]，在來曲唑灌胃基礎(chǔ)上，加用高脂飼料喂養(yǎng)，建立多囊卵巢綜合征-胰島素抵抗（PCOS-IR）大鼠模型。實(shí)驗(yàn)期間，空白對(duì)照組大鼠予以普通顆粒飼料喂養(yǎng)，其余各實(shí)驗(yàn)組大鼠予以高脂飼料喂養(yǎng);造模前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將來曲唑溶于10 g/L羧甲基纖維素中，實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃來曲唑1 mg/（kg·d），空白組大鼠同期灌服等容積等濃度的基質(zhì)羧甲基纖維素，均于上午9時(shí)灌胃;連續(xù)灌胃27 d。

1.2.2 給藥方法 各組給予相應(yīng)組別藥物灌胃，模型組及空白組給予等量生理鹽水;均連續(xù)灌服14 d。制備中藥水煎劑，按成人服用劑量折算成小鼠用量。

根據(jù)“動(dòng)物與人體的每公斤體重劑量折算系數(shù)表”，本實(shí)驗(yàn)的中藥劑量計(jì)算方式：中劑量=每天正常人給藥劑量÷人的重量×6.25（通常默認(rèn)人的重量為60 kg）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，中藥共194 g，由公式計(jì)算中劑量為10 g/kg。西藥組藥物灌胃劑量由公式得出：達(dá)英-35（醋酸環(huán)丙孕酮0.2 mg/kg，炔雌醇3.5 μg/kg），二甲雙胍50 mg/kg。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

大鼠一般情況及體質(zhì)量：觀察記錄各組模型大鼠的形態(tài)、毛色、活動(dòng)、納食等。體質(zhì)量測(cè)量：每周定時(shí)測(cè)量大鼠體質(zhì)量并記錄數(shù)據(jù)，繪制大鼠體質(zhì)量增長變化曲線。

卵巢形態(tài)學(xué)觀察：各組大鼠分別在第42天（灌胃結(jié)束后），腹腔麻醉取出大鼠左側(cè)卵巢，清除表面血液及周圍脂肪，觀察卵巢形態(tài)、顏色、包膜厚度;卵巢周圍脂肪剖凈后，分別測(cè)量大鼠卵巢長、短徑及厚度，計(jì)算卵巢體積。隨后將卵巢組織用4%多聚甲醛液固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，將石蠟包埋好的卵巢組織做成5 μm厚度的切片，做HE染色。光鏡觀察卵巢組織形態(tài)，計(jì)算囊性擴(kuò)張卵泡、成熟卵泡或黃體數(shù)目。

卵巢組織性激素受體（AR、LHR）及胰島素受體（INSR）的表達(dá)：采用免疫熒光技術(shù)，將卵巢組織切片經(jīng)過羊血清工作液孵育后，滴加抗雄激素受體抗體（Anti-AR）、促黃體生成素受體抗體（Anti-LHR）、胰島素受體抗體（Anti-INSR）及各自相對(duì)應(yīng)熒光Ⅱ抗（F488或F594）、卵巢組織性雄激素受體（AR）、促黃體生成素受體（LHR）抗體、抗胰島素受體及各自相對(duì)應(yīng)熒光Ⅱ抗（F488或F594），再用含DAPI的熒光封片劑封片。在200倍鏡下每例標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野并拍照。運(yùn)用IPP-6.0圖像分析軟件，統(tǒng)計(jì)每張熒光圖片積分光密度值（IOD），并記錄數(shù)據(jù)。

胃和腸組織中雄激素受體（AR）及促黃體生成素受體（LHR）的表達(dá)：腹腔麻醉取出大鼠胃體部及結(jié)腸部組織標(biāo)本，將胃腸標(biāo)本用4%多聚甲醛液固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，將石蠟包埋好的胃腸組織做成5 μm厚度的切片。采用免疫熒光技術(shù)，將胃和腸切片經(jīng)過羊血清工作液孵育后，滴加Anti-AR、Anti-LHR、相對(duì)應(yīng)熒光Ⅱ抗，再用含DAPI的熒光封片劑封片。在400倍鏡下每例標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野并拍照。運(yùn)用IPP-6.0圖像分析軟件，統(tǒng)計(jì)每張熒光圖片陽性點(diǎn)的個(gè)數(shù)，并記錄數(shù)據(jù)。

中醫(yī)婦科學(xué)沒有與PCOS-IR準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)的病名，根據(jù)PCOS-IR臨床癥狀及特征，分屬于“月經(jīng)后期”“閉經(jīng)”“不孕”和“崩漏”等范疇。現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者普遍認(rèn)為，PCOS-IR的病因病機(jī)主要涉及腎、肝、脾3臟，脾腎虛是根本原因，故以補(bǔ)腎健脾為主要治則。最近15年來，中醫(yī)藥治療PCOS報(bào)道增多，但關(guān)于PCOS-IR的研究相對(duì)較少。由于PCOS-IR病機(jī)復(fù)雜，病情較重，臨床常在補(bǔ)腎健脾同時(shí)合并多法，如健脾化痰，補(bǔ)腎活血，化痰活血等。比較西醫(yī)藥治療而言，中醫(yī)藥治療PCOS-IR在恢復(fù)卵巢功能及自主排卵等方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。

許昕教授在“腎主生殖”和“沖脈隸于陽明”理論指導(dǎo)下，根據(jù)30余年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)“益腎祛濁方”治療PCOS-IR。本方為壽胎丸與薏苡附子敗醬散合方加減而成，以續(xù)斷、桑寄生、菟絲子平補(bǔ)肝腎，溫而不燥;敗醬草、生薏苡仁清利陽明;意在清除濁熱，暢通胃腸，減輕脾腎功能負(fù)荷，增強(qiáng)運(yùn)化和氣化作用。其方藥可經(jīng)由陽明以達(dá)沖脈，向上影響心腦，向下影響胞宮（卵巢），實(shí)即從中焦、胞宮同時(shí)切入，多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)“心腦-腎氣-天癸-沖任-胞宮”生殖軸。本實(shí)驗(yàn)證明，益腎祛濁方可顯著降低PCOS-IR模型大鼠的體質(zhì)量，縮小異常增大的卵巢體積，糾正卵巢多囊樣改變，其效果優(yōu)于單純益腎組，且與達(dá)英-35聯(lián)合二甲雙胍作用相當(dāng)。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，中藥治療后模型大鼠卵巢局部AR、LHR、INSR的IOD值均明顯低于模型組。

AR在不同組織中均可表達(dá);也有研究發(fā)現(xiàn)在大鼠胃壁細(xì)胞和胃主細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)有LHR的表達(dá)[18]。但性激素受體在非生殖系統(tǒng)組織的表達(dá)及其作用是否會(huì)對(duì)PCOS-IR產(chǎn)生影響，此類研究及報(bào)道罕見。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SD大鼠胃和腸均有AR及LHR表達(dá)，且在PCOS-IR模型組大鼠胃中AR、LHR與腸中LHR的表達(dá)明顯增高。益腎祛濁方干預(yù)后大鼠AR與LHR在胃腸道中的表達(dá)水平顯著降低，其作用與達(dá)英35聯(lián)合二甲雙胍相當(dāng)，但降低LHR在結(jié)腸表達(dá)水平的效果優(yōu)于西藥組;而單純益腎中藥基本不會(huì)對(duì)AR與LHR在胃腸道上的表達(dá)起到干預(yù)作用。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，益腎祛濁方即可在卵巢層面降低AR、LHR和INSR的表達(dá)水平，調(diào)整模型大鼠的內(nèi)分泌紊亂，又可同時(shí)在胃腸層面（即陽明）改善AR和LHR的表達(dá)，促進(jìn)胃腸代謝功能趨于正常，故治療PCOS-IR模型大鼠具有顯著作用。

綜上所述，中藥益腎祛濁方改善大鼠卵巢多囊樣變，作用于卵巢、胃腸組織的性激素受體和胰島素受體水平，阻斷高雄激素血癥和IR之間的惡性循環(huán)，達(dá)到治療PCOS-IR的良好效果。

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（2019-07-25收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81674010）作者簡介：尹謙（1993.11—），男，碩士研究生在讀，研究方向：中醫(yī)藥治療PCOS-IR，E-mail：843938460@qq.com通信作者：許昕（1959.12—），女，碩士，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療排卵障礙性疾病，E-mail：xuxindoudou@163.com