液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中的泛酸

鄭國(guó)建，解 楠，徐 瓊，楊保剛，彭亞鋒，雷 濤，寧嘯駿

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院,上海200233)

泛酸又名維生素B5,是一種廣泛存在于動(dòng)植物組織中的水溶性維生素,參與了機(jī)體的脂肪代謝[1]、谷胱甘肽的合成[2]、肌肉發(fā)育[3]。泛酸可有效防止動(dòng)脈硬化[4],有利于保持骨骼、心臟和平滑肌等器官的健康[3]。自然界中的泛酸主要有游離態(tài)的泛酸和結(jié)合態(tài)泛酸。游離態(tài)泛酸可以直接測(cè)定。結(jié)合態(tài)的泛酸又主要以輔酶A[1]和?；d體蛋白[5]的形式存在。在輔酶A 中,泛酸的一端連接的是一個(gè)巰基乙胺,另一端連接的是一個(gè)磷酸基團(tuán)[6],在測(cè)定泛酸含量時(shí),就需要使用泛酸巰基乙胺酶和磷酸酶將結(jié)合態(tài)的泛酸游離出來(lái)才可以進(jìn)行測(cè)定[6],提取方法主要有直接提取法或酶解法。直接提取法用于提取游離泛酸,提取對(duì)象一般為顆粒、粉末、片劑、液體的營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑或強(qiáng)化劑、預(yù)混料及添加了泛酸鈣的配方食品或保健食品,如奶粉、米粉、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品(FSMP);酶解法可用于提取樣品中的總泛酸,提取對(duì)象一般為薯、肉、乳、谷、蔬、菌、藻、豆、堅(jiān)果等天然食品。

目前,泛酸常用的測(cè)定方法包括微生物法[7]、高效液相色譜法[8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9]。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009．210－2016中推薦的測(cè)定泛酸的第一法為微生物法,可以測(cè)定食品中的總泛酸和游離泛酸,但存在前處理步驟繁瑣、操作費(fèi)時(shí)、標(biāo)準(zhǔn)化程度低、受培養(yǎng)基質(zhì)量影響大[10]和線性范圍窄等缺點(diǎn);第二法為高效液相色譜法,只能用于測(cè)定強(qiáng)化食品中的游離泛酸,在用200 nm的紫外波長(zhǎng)檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉、FSMP 等復(fù)雜基質(zhì)中的泛酸時(shí),存在較強(qiáng)基質(zhì)干擾,難以獲得準(zhǔn)確的結(jié)果[7]。LC-MS/MS具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[11],被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)中化合物的定性定量分析[12]。本工作用直接提取法處理奶粉,用酶解法處理牛肉、西蘭花等食品樣品,然后用LC-MS/MS測(cè)定其中的游離泛酸和總泛酸,為食品安全提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Waters XEVO TQXS 型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;Eppendorf 5804型離心機(jī);Wiggens Votex 3000型渦旋振蕩儀;illipore Milli-Q 型超純水儀;JULABO SW22型水浴鍋。

泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:250 mg·L－1,將54．5 mgD-泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品加水溶解并轉(zhuǎn)移至200 m L容量瓶中,加水稀釋至刻度,混勻。

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液:50 mg·L－1,稱(chēng)取10 mg泛酸鈣內(nèi)標(biāo)物質(zhì)加水溶解并轉(zhuǎn)移至200 m L 容量瓶中,用水稀釋至刻度,混勻。

泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:用水將泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液稀釋至不同倍數(shù),得到10,50,100,300,600,1 000,1500μg·L－1的泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液均含100μg·L－1的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

甲酸、乙腈為色譜純;碳酸氫鉀、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、碳酸鈉、甲苯、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅均為化學(xué)純;D-泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品純度大于99%;泛酸鈣-[13C6,15N2]同位素內(nèi)標(biāo)物質(zhì)純度大于99;α-淀粉酶(活力不小于1．5 U·mg－1);陰離子交換樹(shù)脂Dowex 1×8(粒徑38～75μm);堿性磷酸酶(酶活力不小于23 U·g－1);鴿子肝臟丙酮提取物干粉(酶活力不小于0．1 U·g－1;試驗(yàn)用水為超純水。

1．2 儀器工作條件

1)色譜條件 Waters BEH C18色譜柱(2．1 mm×100 mm,1．8 μm),柱 溫 35 ℃;流 量0．3 m L·min－1;進(jìn)樣量2μL。流動(dòng)相 A 為0．1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,流動(dòng)相B 為乙腈。梯度洗脫程序:0～3 min時(shí),A 為97%;3～7 min時(shí),A 由97%降至50%,保持1 min;8～12 min時(shí),A由50%升至97%。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),正離子模式;毛細(xì)管電壓3．0 k V;錐孔電壓30 V;干燥氣溫度400 ℃,干燥氣流量800 L·h－1;錐孔反吹氣流量150 L·h－1;離子源溫度150 ℃。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab．1 MS Parameters

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 直接提取法

稱(chēng)取5 g奶粉(FSMP或米粉)和0．2 g淀粉酶于50 m L的離心管中,振搖均勻,蓋上瓶塞在(55±5)℃水浴條件下振搖酶解30 min。移取0．5 ～5．0 g樣品溶液于50 m L離心管中,加入100μL 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液,振蕩10 s,加水至20 m L,振蕩10 s,分別加入0．4 m L的300 g·L－1乙酸鋅溶液和150 g·L－1亞鐵氰化鉀溶液,用水定容至25．0 m L,渦旋10 s,靜置10 min,以8 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心2 min。上清液過(guò)0．22μm 尼龍濾膜,按照儀器工作條件對(duì)濾液進(jìn)行測(cè)定。

1．3．2 酶解法

稱(chēng)取適量天然類(lèi)食品(谷、薯、肉、蛋、豆類(lèi)及其制品稱(chēng)取量為1～5 g;新鮮果蔬、乳及其制品稱(chēng)取量為5～10 g于100 m L錐形瓶中。加入1 mol·L－1Tris-HCl緩沖溶液(p H 8．1±0．1)10 m L,40 m L水,振蕩混勻,在121 ℃,103．4 kPa下水解15 min;冷卻后加水定容至100．0 m L,用濾紙過(guò)濾;移取10．0 m L濾液于50 m L 離心管中,加入100μL 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液,1 mol·L－1Tris-HCl緩沖溶液(p H 8．1±0．1)5 m L,振蕩10 s;將上述離心管置于冰浴中,依次加入預(yù)冷的0．08 mol·L－1碳酸鈉溶液0．1 m L、20 g·m L－1堿 性 磷 酸 酶溶液 0．4 m L、0．5 g·L－1鴿子肝臟提取液0．2 m L 和水0．4 m L,小心混合均勻,避免混合物黏附于離心管壁上,然后再加入1 滴甲苯隔絕氧氣,防止溶液被污染,在37 ℃下反應(yīng)過(guò)夜(8 h以上)。在離心管中加水稀釋至20 m L,再分別加入300 g·L－1乙酸鋅溶液和150 g·L－1亞鐵氰化鉀溶液各0．4 m L,用水稀釋至25 m L,振 蕩 10 s。靜 置 10 ～30 min 后,以8 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心 2 min。取上清液過(guò)0．22μm 尼龍濾膜,按照儀器工作條件對(duì)濾液進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2．1 直接提取法中沉淀劑和濾膜的選擇

用水對(duì)奶粉提取時(shí),提取液常呈渾濁態(tài),需先沉淀雜質(zhì)使溶液變澄清后才可以進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。

試驗(yàn)考察了400 mmol·L－1的p H 3．8及p H 4．5 乙酸銨溶液[13]、乙醇(GB 5009．210－2016)、300 g·L－1乙酸鋅溶液和150 g·L－1亞鐵氰化鉀溶液混合溶液[14]做沉淀劑時(shí)對(duì)普通、部分水解、全氨基酸嬰幼兒奶粉的提取效果。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):當(dāng)采用400 mmol·L－1的乙酸銨溶液作沉淀劑時(shí),不能得到澄清的樣品溶液,提取效果不佳;當(dāng)樣品溶液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí),提取效果較好,但是后續(xù)的LC-MS/MS測(cè)定會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的溶劑效應(yīng),使泛酸的保留時(shí)間從3．4 min 前移到3．2 min。當(dāng)300 g·L－1乙酸鋅溶液和150 g·L－1亞鐵氰化鉀溶液的用量均為0．2 m L 時(shí),對(duì)普通和部分水解的嬰幼兒奶粉的提取效果較好,但是對(duì)全氨基酸配方的奶粉的沉淀效果不佳,當(dāng)兩者的用量均增加至0．4 m L時(shí),所有奶粉均取得了較好的提取效果。試驗(yàn)選擇用量均為0．4 m L的300 g·L－1乙酸鋅溶液和150 g·L－1亞鐵氰化鉀溶液的混合溶液作沉淀劑。

試驗(yàn)還考察了0．22μm 的尼龍濾膜和0．22μm的聚四氟乙烯濾膜的過(guò)濾效果,發(fā)現(xiàn)尼龍濾膜的過(guò)濾效果較好。試驗(yàn)選擇0．22μm 的尼龍濾膜過(guò)濾上清液。

2．2 酶解法條件優(yōu)化

由于市面上沒(méi)有商品化的泛酸巰基乙胺酶,而動(dòng)物肝臟中含有高含量的巰基乙胺酶[15]。因此,試驗(yàn)采用磷酸酶和鴿子肝提取物對(duì)食品類(lèi)試樣進(jìn)行酶解,然后用用量均為0．4 m L 的300 g·L－1乙酸鋅溶液和150 g·L－1亞鐵氰化鉀溶液沉淀雜質(zhì),0．22μm 的尼龍濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

2．3 沉淀劑影響的消除

由于前處理方法中使用了乙酸鋅和亞鐵氰化鉀等2種沉淀劑,容易造成質(zhì)譜儀毛細(xì)管堵塞和離子源污染。試驗(yàn)根據(jù)無(wú)機(jī)鹽在反相色譜中無(wú)保留的特性,利用質(zhì)譜儀的閥切換功能將初始階段的流動(dòng)相切入廢液,以消除這兩種不揮發(fā)鹽對(duì)質(zhì)譜儀的不利影響。試驗(yàn)先采用高比例的水相流出這兩種無(wú)機(jī)鹽,設(shè)定質(zhì)譜儀六通閥的切換時(shí)間為2．0 min,溶劑在0．5 min左右出峰,泛酸在3．4 min出峰,滿足試驗(yàn)要求。奶粉樣品中泛酸的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 奶粉樣品中泛酸的色譜圖Fig．1 Chromatograph of pantothenicacid in milk powder

2．4 基質(zhì)效應(yīng)的消除

質(zhì)譜的基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中復(fù)雜的干擾物對(duì)分析物質(zhì)譜響應(yīng)的抑制或增強(qiáng),可用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值進(jìn)行評(píng)估[16]。本工作通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品提取液中的內(nèi)標(biāo)的物質(zhì)的峰面積進(jìn)行評(píng)估,發(fā)現(xiàn),泛酸在奶粉、FSMP、米粉、天然食品基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)比值分別為0．87,0．84,0．97,0．73,均小于1,可見(jiàn),樣品基質(zhì)對(duì)泛酸的測(cè)定有輕微抑制的效應(yīng),但可通過(guò)內(nèi)標(biāo)法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行消除。

2．5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

根據(jù)儀器工作條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以泛酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,泛酸的質(zhì)量濃度在10～1 500μg·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積的比值呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y＝8．850×10－3x－6．088×10－2,相關(guān)系數(shù)不小于0．999。

以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N)為3．0μg·kg－1,10倍信噪比計(jì)算測(cè)定下限(10S/N)為10μg·kg－1。

2．6 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法,分別以奶粉、FSMP、米粉、天然食品等4個(gè)樣品為基質(zhì)進(jìn)行低、中、高等3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每種基質(zhì)每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測(cè)定6次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 4個(gè)不同基質(zhì)中方法的回收試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab．2 Results of tests for recovery and precision in 4 different substrates(n＝6)

由表2 可知:回收率為91．0%～105%之間,RSD 為0．46%～3．0%。

2．7 方法比對(duì)

按照試驗(yàn)方法對(duì)35 種嬰幼兒奶粉、7 種FSMP、11種天然食品(涵蓋了谷薯類(lèi)、肉類(lèi)、蛋、乳、蔬菜、豆類(lèi)等食品)進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)和 GB 5009．210－2016中的微生物法進(jìn)行比較,本方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果的比對(duì)見(jiàn)表3。

表3 本方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的結(jié)果比對(duì)Tab．3 Comparison of results between this method and national standard method

表3(續(xù))

由表3可知:本方法和微生物法相對(duì)偏差小于10%。對(duì)2種方法比值和理論值(100%)在95%的置信區(qū)間內(nèi)進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn),結(jié)果顯示,在奶粉中P值為0．079,在FSMP中P值為0．665,在天然食品中P值為0．313,均大于0．05,說(shuō)明這2種方法無(wú)顯著性差異,具有等效性。

本工作建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中游離泛酸和總泛酸的方法。該方法具有非常寬的線性范圍,在奶粉、米粉、FSMP、天然食品基質(zhì)中都有非常好的準(zhǔn)確度和精密度。與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異,可適用于食品中游離泛酸和總泛酸的測(cè)定。