雞傳染性支氣管炎病毒M41株毒種鑒定

王丹丹

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150227）

雞傳染性支氣管炎（IB）是由冠狀病毒屬的雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起雞的一種高度接觸性傳染病，是嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的主要疫病之一。為了防治IB，除了用嚴(yán)格的生物安全措施外，疫苗免疫接種已成為防治IB不可缺少的手段之一。IB常規(guī)疫苗分為弱毒疫苗和滅活疫苗，是養(yǎng)雞生產(chǎn)中不可缺少的。IBV血清型眾多，各血清型之間沒(méi)有或僅有部分交叉免疫保護(hù)。研究表明，我國(guó)目前流行的IBV血清型主要屬于馬薩諸塞型（Massachusetts）[1]。M41株是馬薩諸塞型的標(biāo)準(zhǔn)毒株，該毒株以繁殖滴度高、免疫原性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在世界范圍內(nèi)被廣泛使用[2]。在進(jìn)行IB 滅活疫苗研究時(shí)，選用M41作為IB滅活疫苗的種毒株。為此，研究對(duì)M41株進(jìn)行了鑒定和傳代研究，并建立M41株種子庫(kù)。

1 材料與方法

1.1 病毒

IBV M41株購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.2 IBV M41的HA抗原和陽(yáng)性血清

IBV（M41 株）HA抗原購(gòu)自荷蘭GD 公司。抗血清由本實(shí)驗(yàn)室自制，小量分裝，-70 ℃保存，HI≥1∶256。

1.3 SPF雞和SPF雞胚

SPF雞和SPF雞胚來(lái)自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司SPF雞場(chǎng)。

1.4 毒種的復(fù)壯和傳代

將毒種作103倍稀釋，接種10 日齡的SPF 雞胚，每個(gè)胚尿囊腔接種0.1 mL。接種后將30 h前死亡的雞胚剔除，收取30～48 h死胚和48 h活胚尿囊液，記為E0 代，低溫保存?zhèn)溆?。將M41 株毒種用SPF胚連續(xù)傳12代，分別記作E1～E12。

1.5 病毒含量（EID50）

將E1、E5、E9和E12代次的毒種分別作10倍系列稀釋，取10-4～10-85個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種5個(gè)10日齡的SPF雞胚，每胚接種0.1 mL。剔除24 h 前死亡的雞胚，觀察144 h，計(jì)算病毒的EID50。接種后24～144 h，雞胚死亡或存活雞胚的胎兒出現(xiàn)失水、蜷縮、發(fā)育矮小等特異癥狀判為感染。

1.6 毒力

1.6.1 對(duì)雞胚毒力的測(cè)定

將E1、E5、E9 和E12 代次毒種用滅菌生理鹽水作1 000 倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種10 日齡SPF 雞胚10 個(gè)，每個(gè)0.1 mL，置37 ℃繼續(xù)孵化，照胚1～2次·d-1，記錄24～144 h內(nèi)死亡胚的數(shù)量和胎兒病變情況。

1.6.2 對(duì)SPF雞毒力的測(cè)定

將E1、E5、E9和E12代次的毒種分別作10倍稀釋，經(jīng)氣管接種10只10日齡以內(nèi)的SPF雞，每只0.1 mL，觀察10 d，記錄雞的臨床癥狀，在攻毒后第10天，剖殺雞，取氣管，制氣管環(huán)，在顯微鏡下觀察環(huán)纖毛破壞情況，對(duì)個(gè)別氣管環(huán)作病理切片。

1.7 特異性

將E1、E5、E9 和E12 代次毒種用滅菌PBS 稀釋1 000 倍，分別與10 倍稀釋的抗IBV、NDV、AIV和EDSV特異血清中和，在室溫作用1 h，接種10 日齡SPF 雞胚各10 枚，每胚0.2 mL，置37 ℃繼續(xù)孵化，觀察到144 h，記錄24～144 h 內(nèi)死亡胚的數(shù)量和胎兒病變情況，出現(xiàn)死亡或胎兒病變視為雞胚感染IBV。

1.8 免疫原性

用甲醛滅活E1、E5、E9 和E12 代次病毒，并分別與油佐劑按1∶3比例乳化，制成滅活疫苗，接種4 周齡的SPF 雞（2 周齡時(shí)滴鼻接種IBV H120 疫苗），免疫4周后測(cè)定血清的HI抗體。

1.9 IBV分離株對(duì)M41陽(yáng)性血清的反應(yīng)性

將9 株來(lái)自5 個(gè)不同地區(qū)的IBV 分離株尿囊液用滅菌PBS作1∶1 000稀釋，與等量的10倍稀釋的M41 株特異抗血清混合，室溫作用1 h，然后每個(gè)毒株-血清混合物接種到10個(gè)雞胚尿囊液中，每胚接種0.1 mL，同時(shí)設(shè)SPF血清作對(duì)照。接種后，每天照胚2 次，隨時(shí)取出死亡的雞胚，孵化144 h，取出全部雞胚。對(duì)每個(gè)雞胚收獲尿囊液，用RT-PCR 方法檢測(cè)尿囊液中是否含有IBV 病毒（具體方法見附錄2）。RT-PCR結(jié)果陽(yáng)性的雞胚判為感染，統(tǒng)計(jì)雞胚感染情況。

1.10 濕毒種保存期

將M41株E1、E5和E9代次的SPF雞胚尿囊液毒分成數(shù)等份，分別存放于-70 ℃；病毒凍干后放-20 ℃冰箱內(nèi)。在不同時(shí)間測(cè)定病毒的EID50，每次設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 毒種的復(fù)壯和繼代

M41 株凍干毒種在10 日齡SPF 雞胚上復(fù)壯，收獲的胚液計(jì)為E0 代毒，然后將E0 代次毒在10日齡的SPF 雞胚繼代12 次，得到E1～E12 代次毒，小量分裝，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 病毒含量（EID50）

病毒含量（EID50）結(jié)果見表1。

表1 M41株各代次毒種EID50測(cè)定

由表1 可知，E1～E12 代次M41 株的易感雞胚尿囊液的EID50為10-6.1·0.1 mL-1～10-6.3·0.1 mL-1，沒(méi)有明顯改變。

2.3 毒力

2.3.1 對(duì)雞胚毒力

各代次毒種對(duì)雞胚毒力的測(cè)定結(jié)果見表2。

由表2 可知，E1～E12 代次病毒在接種雞胚后的24～144 h，可以致50%的雞胚死亡。早期死亡的雞胚胚體發(fā)紅，有尿酸鹽沉積；后期胚體矮小、蜷縮，多數(shù)有尿酸鹽沉積，但隨著傳代代次的增加，對(duì)SPF雞胚毒力有下降的趨勢(shì)。說(shuō)明各代次病毒對(duì)雞胚具有一定的致病力，但致病力有下降的趨勢(shì)。

2.3.2 對(duì)SPF雞毒力

各代次毒種對(duì)SPF 雞毒力的測(cè)定結(jié)果見表3，呼吸道癥狀見圖1。

表2 各代次毒種對(duì)雞胚毒力的測(cè)定

表3 各代次毒種對(duì)SPF雞毒力的測(cè)定

圖1 呼吸道癥狀

由表3 和圖1 可知，給SPF 雞接種不同代次的M41株后，只有少數(shù)SPF雞出現(xiàn)程度不同的呼吸道癥狀；但氣管環(huán)試驗(yàn)表明，接種不同代次M41 株病毒后，SPF 雞的氣管纖毛都受到程度相近的破壞，這表明，各代次的M41株病毒對(duì)SPF雞具有一定的毒力，隨著傳代次數(shù)的增加（E1～E12），毒力沒(méi)有發(fā)生明顯的改變。

2.4 特異性

各代次毒種特異性的測(cè)定結(jié)果見表4。

由表4可知，各代次病毒能被IBV特異血清中和，表現(xiàn)為接種雞胚后，100%雞胚發(fā)育正常，說(shuō)明沒(méi)有被IBV感染；病毒不能被NDV、AIV（H9）和EDSV 特異血清中和，表現(xiàn)為接種雞胚后100%的雞胚發(fā)育矮小，說(shuō)明被IBV感染。

表4 各代次毒種特異性的測(cè)定

2.5 免疫原性

不同代次的M41 株病毒免疫原性試驗(yàn)結(jié)果見表5。

由表5可知，各代次病毒制成的滅活疫苗免疫SPF 雞后都能產(chǎn)生較高的HI 抗體，這表明各代次病毒仍然具有很好的免疫原性。

表5 不同代次的M41株病毒免疫原性試驗(yàn)

2.6 IBV分離株與抗M41陽(yáng)性血清中和試驗(yàn)

IBV 分離株與M41 陽(yáng)性血清中和試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表6可知，M41株的特異陽(yáng)性血清可全部或部分中和5個(gè)不同地區(qū)（河南省、山東省、河北省、黑龍江省、北京市）分離的9 株IBV 中的6 株（SD、HN1、HN2、HB1、HL1、HL2），表現(xiàn)為與相應(yīng)陰性血清對(duì)照組比較，這6株病毒與M41特異陽(yáng)性血清作用后，無(wú)雞胚感染或感染IBV的雞胚數(shù)量明顯減少；而與對(duì)照血清作用的病毒株可使100%雞胚感染。

表6 IBV分離株與M41陽(yáng)性血清中和試驗(yàn)

2.7 保存期

M41株毒種保存期的測(cè)定結(jié)果見表7。

由表7 可知，各代次病毒濕毒存放在-70 ℃條件下，經(jīng)過(guò)24 個(gè)月，病毒含量沒(méi)有顯著變化；凍干毒存放在-20 ℃條件下，經(jīng)過(guò)42個(gè)月，病毒含量沒(méi)有顯著變化。

表7 M41株毒種保存期的測(cè)定

2.8 種子庫(kù)

根據(jù)2.1～2.7的結(jié)果，將E0代次病毒傳代至12代，M41 株毒種的特性沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，因此，將M41 株E0 代次病毒作為原始種子，基礎(chǔ)種子的代次范圍定為E1～E5代，生產(chǎn)用毒種的代次控制在基礎(chǔ)種子基礎(chǔ)上傳代不超過(guò)3代，即控制在E9代以內(nèi)。分別建立了M41株病毒的原始種子庫(kù)、基礎(chǔ)種子庫(kù)和生產(chǎn)種子庫(kù)，以便進(jìn)行M41株病毒滅活疫苗的研究和生產(chǎn)。

3 結(jié) 論

IBV的M41株具有免疫原性好、特異性強(qiáng)和繁殖滴度高等優(yōu)點(diǎn)；經(jīng)過(guò)繼代，在E12代次以內(nèi)，病毒的各種生物學(xué)特性沒(méi)有明顯的改變，說(shuō)明該毒株生物特性穩(wěn)定。各代次IBV M41 株濕毒在-70 ℃條件下保存24 個(gè)月和凍干毒在-20 ℃條件下保存36個(gè)月，病毒的效價(jià)沒(méi)有明顯的改變，可作為毒種進(jìn)行滅活疫苗的研制。