麩炒澤瀉樣品鑒定及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)的測(cè)定研究

程華,張帥康,方巖,梁巍，王方闊，董雄輜，姚成立

（合肥師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥230601）

澤瀉別名又稱建澤瀉、水瀉、水澤等，在水中生長(zhǎng)，由于其大部分產(chǎn)于四川、福建等地，故常以“川澤瀉”和“建澤瀉”著稱，其花期較長(zhǎng)，花瓣大，顏色多樣，具有觀賞價(jià)值[1-3]。本品來源于澤瀉科植物干的塊莖。當(dāng)分莖葉在冬季開始枯敗時(shí)，可以采摘挖掘，洗凈后，進(jìn)行干燥，除去粗外皮及須根[4-5]。本品顏色為淡黃棕色至淡黃色，有球狀、橢圓狀或卵圓狀，長(zhǎng)度約為2～7 cm，直徑約為2～6 cm。外表上有環(huán)狀淺溝紋和小而凸起的須根狀痕跡，部分樣品底部有瘤狀的芽痕跡。其有堅(jiān)硬的皮質(zhì)，斷面分為黃白色和粉色，含有較多孔。聞其氣味，略苦[6]。

麩炒澤瀉則是將澤瀉干燥的莖塊用麩皮炒過的炮制品。炮制樣品時(shí)，要先除去雜質(zhì)，浸潤(rùn)后切厚片，干燥。隨后加熱炒制容器直至撒入的麩皮即刻起煙。隨即放入本藥材，迅速翻炒至藥品表面呈黃色或深黃色時(shí)取出，用篩子篩除麩皮，室溫自然冷卻。每100 kg本藥材，需要麩皮的用量為10～15 kg[7-8]。麩炒澤瀉可對(duì)人體的重大失水、泄放熱量、滲濕等癥狀有很好療效，對(duì)于水腫脹滿、瀉痢、淋病、小便不利、嘔吐、痰飲等癥狀也有很好的功效，特別是對(duì)于尿血癥狀的患者，麩炒澤瀉經(jīng)常被用來調(diào)節(jié)身體[9-15]。

目前中國(guó)藥典上雖然對(duì)澤瀉有明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，但是對(duì)其炮制品并沒有確切的質(zhì)量規(guī)范數(shù)據(jù)，在公開文獻(xiàn)中也很少有這方面的資料。為保證中藥炮制品的質(zhì)量，促進(jìn)發(fā)展新的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，本研究定性鑒別不同產(chǎn)地、不同批次的麩炒澤瀉炮制品，并對(duì)其有效成分23-乙酰澤瀉醇B、水分、總灰分、浸出物等進(jìn)行測(cè)試表征，為擬定麩炒澤瀉中藥飲片炮制標(biāo)準(zhǔn)提供參考數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品：四川、福建等地10 批樣品，代號(hào)：YP-FCZX-001-四川、YP-FCZX-002-四川、YP-FCZX-003-四川、YP-FCZX-004-四川、YP-FCZX-005-四川、福建-1、福建-2、福建-3、福建-4、福建-5；對(duì)照藥品23-乙酰澤瀉醇B，批號(hào)111846-201504，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

試劑：純化水、濃鹽酸、硝酸銀AR、丙酮AR、乙酸乙酯AR、硅鎢酸AR、無(wú)水乙醇AR、甘油AR、水合氯醛AR、環(huán)己烷、乙腈（色譜級(jí)）以及氧化鋁等。

1.2 主要儀器

LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）；SX-4-10馬弗爐（天津泰斯特儀器有限公司）；AL204分析天平（杭州康納科技有限公司）；GZX-9240MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；HAD8-DYQ-I 薄層電動(dòng)點(diǎn)樣器（北京恒奧德儀器有限公司）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵（河南省予華儀器有限公司）；BA-310 顯微鏡（北京中儀光科科技發(fā)展有限公司）；HY-5回旋式振蕩器（江蘇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；LG-06A六兩裝高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市百信藥機(jī)械廠）；700VDE 超聲波清洗器（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 顯微鑒別

適量麩炒澤瀉樣品投入六兩裝高速中藥粉碎機(jī)，粉碎，過三號(hào)篩篩粉，再將少量粉末放置在載玻片中間，用膠頭滴管滴加水合氯醛溶液（水合氯醛溶液是用15 mL蒸餾水與10 mL甘油的混合液溶解50 g水合氯醛制得）和稀甘油試液（取少許樟腦或1 滴液化苯酚溶解于33 mL 甘油和10 mL 蒸餾水中），加熱至微沸后蓋上蓋玻片，用吸紙慢慢吸除氣泡，將其放在顯微鏡試驗(yàn)臺(tái)上，觀察樣品內(nèi)部特征結(jié)構(gòu)。

1.3.2 薄層色譜鑒別

2015 版藥典將23-乙酰澤瀉醇B 作為澤瀉定性鑒別的指標(biāo)成分，因此在薄層色譜定性鑒別中選取23-乙酰澤瀉醇B作為對(duì)照品[16]。取本品粉末2 g，放入錐形瓶中再加入20 mL 乙酸乙酯，超聲30 min，過濾后將濾液加到氧化鋁柱(200～300 目，5 g，內(nèi)徑為1 cm，干法裝柱)上，用10 mL 的乙酸乙酯洗脫，蒸干洗脫后的溶液，在殘?jiān)械渭? mL 乙酸乙酯將其溶解，作為供試品溶液。然后再取23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL 含2 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。按《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版第一部附錄ⅥB進(jìn)行薄層色譜法試驗(yàn)，取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H 薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%硅鎢酸乙醇溶液，105℃下加熱，待其斑點(diǎn)色彩明晰后關(guān)掉加熱儀器[17]。

1.3.3 水分測(cè)定（烘干法）

將麩炒澤瀉粉碎，過2 號(hào)篩，稱取3 g 試品，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，疏松供試品不超過10 mm，精密稱量，開起瓶蓋105℃干燥5 h，然后蓋好瓶蓋，移至干燥器中，冷卻30 min，精密稱量，再在上述溫度下干燥1 h，室溫冷卻，直至連續(xù)兩次稱重時(shí)其質(zhì)量差異不超過5 mg 為止。根據(jù)減少的重量，計(jì)算供試品中含水量（%）。對(duì)每批樣品要進(jìn)行兩次測(cè)試，最后取其平均值。

1.3.4 總灰分測(cè)定

將麩炒澤瀉粉碎，過2 號(hào)篩，稱取4 g 試品，置入恒重坩堝中，稱量（精確至0.000 01 g），然后再慢慢加熱。150℃保溫3 h，300℃保溫3 h至完全炭化后再逐漸升高溫度至600℃，在此溫度下繼續(xù)灼燒5 h，使其完全灰化并至恒重。最后總灰分的含量（%）可以根據(jù)殘?jiān)亓坑?jì)算得出。如果供試品不易灰化，需要等坩堝冷卻，然后加入熱水使殘?jiān)鼭駶?rùn)，最后再將其置于電爐上蒸干，殘?jiān)涨耙徊椒椒胱?，直至坩堝里的?nèi)容物徹底灰化。對(duì)每批樣品要進(jìn)行兩次測(cè)試，最后取其平均值。

1.3.5 浸出物測(cè)定

將麩炒澤瀉粉碎，過2 號(hào)篩，精密稱取3 g 試品，置250 mL 的錐形瓶中，精密加乙醇50 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h 后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量。除另有規(guī)定外，以干燥品計(jì)算供試品中醇溶性浸出物的含量（%）。對(duì)每批樣品要進(jìn)行兩次測(cè)試，最后取其平均值。

1.3.6 有效成分23-乙酰澤瀉醇B的含量測(cè)定

（1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：以十八烷基硅烷和硅膠為填充劑；儀器設(shè)備：島津LC-20A 液相色譜儀；色譜柱：島津InertSustain C18 柱5（μm(250*4.6 mm)；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；流速：1 mL/min；柱溫：35℃；流動(dòng)相：乙腈-水（73∶27）。

（2）樣品前處理與有效成分測(cè)定[18-19]

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品，加乙腈制成每l mL含0.2 mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取本品過五號(hào)篩粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙腈25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用乙腈補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定時(shí)分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

（3）線性關(guān)系考查

精密稱取23-乙酰澤瀉醇B 對(duì)照品4.01 mg 稀釋至200 mL，加流動(dòng)相使其溶解并稀釋至刻度，搖勻即成母液；精密吸取母液1 mL，置于10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述對(duì)照品溶液1 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL注入液相色譜儀。

（4）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按照各自色譜條件，分別在0 h、5 h、10.5 h及24.5 h進(jìn)樣一次。

（5）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取23-乙酰澤瀉醇B 對(duì)照品6.11 mg 稀釋至250 mL，加乙腈使之溶解并稀釋至刻度，配制成23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品溶液（0.024 44 mg/mL），取該對(duì)照品5份，每份進(jìn)樣10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品鑒別

2.1.1 顯微鑒別

本品粉末呈淡黃棕色，淀粉粒甚多，單粒長(zhǎng)卵形、類球形或橢圓形，直徑3～14 μm；復(fù)粒由2～3 分粒組成。薄壁細(xì)胞類圓形，具多數(shù)橢圓形紋孔，集成紋孔群。油室大多破碎，完整者類圓形，直徑54～110 μm，分泌細(xì)胞中有時(shí)可見油滴，見圖1。

2.1.2 薄層色譜

取10 批麩炒澤瀉樣品，按照前述薄層色譜鑒別方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，鑒別結(jié)果如圖2 所示。日光下檢視，供試品色譜與23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品色譜在H板的相同位置顯示相同顏色的斑點(diǎn)，見圖2。說明10批供試品中都含有澤瀉中的有效成分23-乙酰澤瀉醇B，供試品是麩炒澤瀉樣品。

2.2 水分測(cè)定

圖1 麩炒澤瀉粉末顯微圖Fig.1 The microscopic images of bran fried alisma powder

圖2 日光下麩炒澤瀉薄層色譜圖Fig.2 The thin-layer chromatography image of bran fried alisma under sunlight

分別取麩炒澤瀉粉末，按照前述烘干法對(duì)10 批樣品進(jìn)行水分測(cè)定，結(jié)果見表1，平均值為7.714%，最大值為8.050%，最小值7.400%，可看出不同批次產(chǎn)品，由于其生長(zhǎng)環(huán)境不同，水分含量略有差異?？傮w來說，麩炒澤瀉炮制品水分含量的規(guī)定限度應(yīng)不得超過9.0%。

表1 10批麩炒澤瀉樣品水分測(cè)定數(shù)據(jù)Tab.1 The results of moisture of 10 batches of bran fried alisma

2.3 總灰分測(cè)定

分別取麩炒澤瀉粉末，按照前述總灰分測(cè)定方法對(duì)10 批樣品進(jìn)行總灰分測(cè)定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2，平均值為2.718 5%，最大值為3.620%，最小值為2.315%，可看出不同產(chǎn)地的樣品，其總灰分含量也略有差異，總體來說麩炒澤瀉炮制品總灰分含量的規(guī)定限度應(yīng)不得超過4.0%。

表2 10批澤瀉樣品總灰分測(cè)定數(shù)據(jù)Tab.2 The results of total ash of 10 batches of bran fried alisma

2.4 浸出物測(cè)定

分別取澤瀉粉末，按照前述醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，用乙醇作溶劑，對(duì)10批樣品進(jìn)行浸出物測(cè)定，結(jié)果見表3，平均值為10.777%，最大值為12.440%，最小值為10.050%。綜上，結(jié)合不同產(chǎn)地樣品綜合屬性，麩炒澤瀉炮制品浸出物含量的規(guī)定限度應(yīng)不得少于10.0%。

表3 10批澤瀉樣品浸出物測(cè)定數(shù)據(jù)Tab.3 The results of the extract of 10 batches of bran fried alisma

2.5 有效成分23-乙酰澤瀉醇B的含量測(cè)定

澤瀉的主要化學(xué)成分是三萜及倍半萜類，其中23-乙酰澤瀉醇B屬于三萜類成分，其能夠恢復(fù)多藥耐藥細(xì)胞株對(duì)抗癌素的敏感性，可用于研制新型抗腫瘤藥物。2015 版藥典已將23-乙酰澤瀉醇B 作為澤瀉定性鑒別的指標(biāo)成分，故在麩炒澤瀉炮制品中依然選擇澤瀉中主要成分23-乙酰澤瀉醇B作為含量測(cè)定指標(biāo)，可以較好地控制本品的內(nèi)在品質(zhì)。

2.5.1 有效成分含量限度的確定

按照前述高效液相色譜操作條件，對(duì)10批樣品23-乙酰澤瀉醇B 的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。由于生長(zhǎng)環(huán)境及炮制環(huán)節(jié)火候處理等的差異，致使不同樣品有效成分含量略有差別。根據(jù)上述10 批樣品測(cè)定數(shù)據(jù)，結(jié)果平均值為0.127%，最大值為0.187%，最小值為0.045%。根據(jù)測(cè)定結(jié)果建議麩炒澤瀉炮制品23-乙酰澤瀉醇B含量限度暫定為：本品按干燥品計(jì)算，含23-乙酰澤瀉醇B計(jì)，不得少于0.040%。

2.5.2 線性關(guān)系考查

精密稱取23-乙酰澤瀉醇B 對(duì)照品6.11 mg稀釋至250 mL，加乙腈使之溶解并稀釋至刻度，搖勻即成母液。精密吸取上述對(duì)照品溶液2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL 注入液相色譜儀，按正文色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積積分值取l g 為底的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量取l g為底的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，23-乙酰澤瀉醇B 回歸方程為y=1.018 8x+5.938 9，R2=0.999 57，結(jié)果見表5，表明23-乙酰澤瀉醇B 在0.048 88～0.611 0 μg之間呈良好線性關(guān)系。測(cè)量結(jié)果見表5及圖3。

表4 10批麩炒澤瀉樣品有效成分含量測(cè)定數(shù)據(jù)Tab.4 The results of effective component of 10 batches of bran fried alisma

表5 線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果Tab.5 The results of linear relation

圖3 線性關(guān)系圖Fig.3 The image of linear relation

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10 μL,按照各自色譜條件，分別在0 h、5 h、10.5 h 及24.5 h 進(jìn)樣一次，結(jié)果如表6 所示，結(jié)果表明，對(duì)照品溶液中各成分在24.5 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.6 The results of stability

2.5.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取23-乙酰澤瀉醇B 對(duì)照品6.11 mg 稀釋至250 mL，加乙腈使之溶解并稀釋至刻度，配制成23-乙酰澤瀉醇B 對(duì)照品溶液（0.024 44 mg/mL）。取該對(duì)照品5份，每份進(jìn)樣10 μL，峰面積及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表7。結(jié)果表明，本法重現(xiàn)性較好。

表7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Tab.7 The results of repeatability

3 結(jié)論

本研究使用顯微鑒別和薄層色譜分析法對(duì)不同產(chǎn)地、不同批次的10 批麩炒澤瀉樣品進(jìn)行水分、總灰分、浸出物、23-乙酰澤瀉醇B 有效成分含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，麩炒澤瀉炮制品水分含量應(yīng)不得超過9.0%，總灰分含量應(yīng)不得超過4.0%，浸出物含量應(yīng)不得少于10.0%，23-乙酰澤瀉醇B含量按干燥品計(jì)算含量應(yīng)不得少于0.040%。期望本研究能為制定麩炒澤瀉中藥飲片炮制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。